Ensayo de fluorescencia para evaluar la permeabilidad de una barrera endotelial microvascular cardíaca en un modelo de isquemia/reperfusión en ratas

Resumen

En este trabajo describimos un método para evaluar funcionalmente la barrera endotelial de los microvasos cardíacos después de una lesión por isquemia/reperfusión mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de FITC-dextrano extravasado de 70.000 Da en comparación con el azul de Evans.

Resumen

Las terapias de revascularización de las arterias culpables, independientemente de la intervención coronaria percutánea y del injerto de revascularización coronaria, se consideran la mejor estrategia para mejorar el pronóstico clínico de los pacientes con síndrome coronario agudo (SCA). No obstante, la reperfusión miocárdica después de una revascularización efectiva puede desencadenar una muerte significativa de los cardiomiocitos y un colapso del endotelio coronario, lo que se conoce como lesión por isquemia/reperfusión miocárdica (MIRI). Por lo general, las células endoteliales y sus uniones estrechas intercelulares mantienen cooperativamente la barrera endotelial microvascular y su permeabilidad relativamente baja, pero fallan en las áreas de reperfusión.

La hiperpermeabilidad endotelial microvascular inducida por isquemia/reperfusión (RI) contribuye al edema miocárdico, al aumento de la infiltración de células proinflamatorias y al agravamiento de la hemorragia intramiocárdica, lo que puede empeorar el pronóstico del SCA. El trazador utilizado en este estudio, 70.000 Da FITC-dextrano, una molécula de glucosa ramificada marcada por isotiocianato de fluoresceína (FITC), parece demasiado grande para infiltrar el endotelio microvascular cardíaco en condiciones normales. Sin embargo, es capaz de infiltrarse en una barrera rota después de MIRI. Por lo tanto, cuanto mayor es la permeabilidad endotelial, más FITC-dextrano se acumula en el espacio intercelular extravascular. Por lo tanto, la intensidad de la fluorescencia de FITC puede indicar la permeabilidad de la barrera endotelial microvascular. Este protocolo aprovecha el FITC-dextrano para evaluar funcionalmente la barrera endotelial microvascular cardíaca, que es detectada por un sistema automatizado de imagen de patología cuantitativa.

Introducción

El hecho de que un número cada vez mayor de pacientes con enfermedades coronarias se hayan beneficiado de las terapias de revascularización durante décadas no niega las consecuencias fatales de la MIRI. Según lo descrito por Yellon y Hausenloy, aproximadamente el 30% del tamaño final del infarto se puede atribuir a MIRI¹. La disfunción endotelial microvascular cardíaca es el mecanismo central que subyace a la MIRI y al fenómeno de "no reflujo" y es el objetivo de muchos agentes cardioprotectores y de las vías cardioprotectoras clásicas². Además, la hiperpermeabilidad endotelial de los microvasos puede desencadenar edema miocárdico³ y la sobreinfiltración de células proinflamatorias, incluidos neutrófilos⁴, macrófagos y ertrocitos⁵.

El estrés oxidativo inducido por MIRI y las citocinas proinflamatorias sobreexpresadas, como los miembros de^{la familia 6} del factor de necrosis tumoral y^{la familia 7} de las interleucinas, activan las vías de señalización de la apoptosis celular para acelerar la muerte del miocardio isquémico. Los eritrocitos penetran la vulnerable barrera endotelial y se acumulan en la matriz extracelular (MEC) para formar un hematoma intramiocárdico⁸. Las metaloproteinasas de la matriz derivadas de macrófagos y neutrófilos desensamblan el colágeno en la MEC, lo que aumenta el riesgo de complicación mecánica y aneurisma ventricular post-infarto⁹. Por lo tanto, la permeabilidad de la barrera endotelial es un signo crucial para la evaluación pronóstica del infarto agudo de miocardio y marca la gravedad de la IMI hasta cierto punto.

El FITC-dextrano es un conjunto de polisacáridos compuesto por diferentes longitudes de moléculas de glucosa ramificadas de peso molecular que oscilan entre 4.000 Da y 70.000 Da. Es ampliamente utilizado como trazador estándar para demostrar la permeabilidad de las membranas celulares, las barreras fisiológicas funcionales como la barrera hematoencefálica¹⁰ y las membranas mucosas¹¹ bajo tratamientos específicos y condiciones patológicas. La permeabilidad de una membrana específica varía para diferentes sustancias de acuerdo con sus pesos moleculares. Por lo general, la albúmina se restringe a los microvasos cardíacos; sin embargo, puede penetrar el endotelio en la etapa temprana de la RI, causando edema miocárdico. Como el peso molecular de la albúmina es de aproximadamente 68.000 Da, 70.000 Da de FITC-dextrano sería un agente adecuado para demostrar la hiperpermeabilidad endotelial después de la RI. Además, el dextrano ha sido ampliamente adoptado para mantener el volumen sanguíneo y la presión osmótica coloidal de los pacientes en shock, y los trazadores marcados con FITC se utilizan en numerosos estudios in vivo o in vitro con pocos efectos adversos.

Además de FITC-dextrano, la permeabilidad endotelial se ha medido con tinción con azul de Evans (EB). Después de la inyección en la circulación sanguínea, EB se une fuertemente a la albúmina sérica y forma un complejo¹². Por lo tanto, este complejo EB-albúmina, no solo EB, se puede utilizar para la medición de la permeabilidad, lo que significa que la precisión de dicho método basado en EB puede verse influenciada por diferentes concentraciones de albúmina sérica en sujetos experimentales. Además, se ha reportado que la EB envenena los órganos de animales de experimentación, especialmente el corazón, el hígado y los pulmones, a través de la degeneración celular y el aumento de la permeabilidad vascular¹³. El endotelio sometido a isquemia/reperfusión sería más sensible a estos efectos perjudiciales que el endotelio normal, lo que puede confundir la importancia de los resultados experimentales.

En comparación con el colorante EB, el FITC-dextrano es exógeno y la afinidad de unión a la albúmina es insignificante. Por lo tanto, el FITC-dextrano permanece en estado libre y no se une a macromoléculas, como la albúmina y las proteínas tisulares. Por lo tanto, si se administra de acuerdo con el peso corporal, el FITC-dextrano puede funcionar a la misma concentración sanguínea y no se ve afectado por las diferencias individuales en la concentración de albúmina sérica y el volumen sanguíneo. Se utilizó Tongxinluo (TXL), una medicina tradicional china, para probar la sensibilidad diagnóstica de este método. La TXL reduce la MIRI al mantener la ultraestructura celular endotelial y la integridad de la barrera endotelial¹⁴. El TXL también se utiliza para curar la angina de pecho y mejorar clínicamente el no reflujo miocárdico después del infarto¹⁵. Contiene Radix ginseng, Buthus martensi, Hirudo, Eupolyphaga seu steleophaga, Scolopendra subspinipes, Periostracum cicadae, Radix paeoniae rubra, Semen ziziphi spinosae, Lignum dalbergiae odoriferae, Lignum santali albi y Borneolum syntheticum. Se ha demostrado que la TXL protege el endotelio microvascular a través de la vía MEK/ERK¹⁶ y los mecanismos mediados por la óxido nítrico sintasa^{endotelial 5,17} y alivia la isquemia/lesión por reperfusión (IRI) de los órganos¹⁸, especialmente el corazón, de forma dependiente de la dosis. Aquí, las ratas fueron alimentadas con 0,5 g/kg de polvo TXL (una dosis equivalente a la utilizada clínicamente en humanos) como se describe¹⁹. Este artículo proporciona un método para evaluar funcionalmente la barrera endotelial de los microvasos cardíacos después de la RI a través de la medición de la intensidad de fluorescencia total de FITC-dextrano extravasado de 70.000 Da en comparación con EB.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" emitida por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Bethesda, MD, EE. UU., Publicación de los NIH No. 85-23, revisada en 1996) y la "Regulación para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación" del Consejo de Cuidado de Animales de Beijing (1996). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de Experimentación del Hospital de Fuwai. En este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de clase SPF (ratas SD) con un peso de 150-180 g.

1. Preparación de reactivos, materiales y equipos

1. Prepare reactivos y soluciones que incluyan etanol al 70%, FITC-dextrano (70,000 Da, disuelto en solución salina helada para hacer una solución al 10% p/v para su uso), crema depilatoria, medio de montaje con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0,5-10 μg/mL), 1% p/v de EB/solución salina y solución salina de pentobarbital sódica/5% p/v (almacenada a 4 °C en la oscuridad).
2. Esterilizar todas las herramientas y materiales quirúrgicos con anticipación, incluida la cinta quirúrgica; almohadillas de gasa; guantes quirúrgicos; Tubo endotraqueal de 16 G; jeringa de insulina; tijeras de operación; pinzas de disección grandes y curvas; pinzas de disección rectas; pinzas antimosquitos rectas; pinzas antimosquitos curvas; retractores (30 mm de extensión); Portamicroagujas de 5 cm; sutura de polipropileno 3-0 (aguja cónica); y sutura de polipropileno 6-0 (aguja redonda).
3. Verifique y asegúrese de que todo el equipo, incluido el sistema de calentamiento a temperatura constante, el sistema de iluminación, el ventilador, el sistema automatizado de imágenes de patología cuantitativa y la cortadora de congelación ultravioleta, estén en buenas condiciones.

2. Preparación de las ratas para los procedimientos quirúrgicos

1. Divida todas las ratas SD en grupo Sham, grupo IR y grupo TXL (grupo IR + TXL) al azar.
   NOTA: En este protocolo, seis ratas fueron asignadas aleatoriamente a cada grupo, n=6.
2. Pesar cada rata SD, anotar el peso y calcular la dosis de TXL que se administrará a cada rata.
3. Administrar ibuprofeno a una dosis de 30 mg/kg por sonda nasogástrica a cada rata al menos 12 h antes de la toracotomía para aliviar el dolor y la angustia preoperatoria.
4. Administrar un polvo superfino de TXL a una dosis de 0,5 g/kg por sonda nasogástrica durante 12 h y 1 h a cada rata SD del grupo IR+TXL antes de la anestesia, como se describe¹⁹.
5. Desinfecte la mesa de operaciones con etanol al 70% y coloque las herramientas y materiales quirúrgicos esterilizados sobre la superficie desinfectada.
6. Ajuste la temperatura del sistema de calentamiento a temperatura constante para mantener la temperatura corporal de las ratas a 37 ± 1 °C.

3. Establecer un modelo de isquemia/reperfusión cardíaca en ratas

1. Inyecte una solución salina tamponada (PBS) con pentobarbital al 5% p/v de pentobarbital a una dosis de 50 mg/kg (0,1 mL/100 g de peso corporal) en la cavidad abdominal para anestesiar a la rata. Prepare el sitio quirúrgico retirando cuidadosamente el pelaje desde el cuello hasta el pecho afeitándose o usando una crema depilatoria.
2. Ajuste suavemente la posición de la lengua según sea necesario con pinzas esterilizadas y limpie la secreción respiratoria con bolas de algodón esterilizadas. Mantenga la glotis claramente a la vista e inserte un tubo endotraqueal en la tráquea suavemente.
3. Conecte el tubo endotraqueal a un ventilador que gire a 65-80 respiraciones por minuto y ajuste el volumen corriente a 4-5 mL fijando la cabeza y las extremidades de la rata.
4. Coloque un paño estéril sobre la rata, desinfecte el área de operación con tintura de yodo seguida de etanol al 70% y repita este procedimiento tres veces.
5. Realizar una incisión paraesternal izquierda a nivel del cuarto espacio intercostal para exponer el músculo pectoral mayor y el pectoral menor izquierdos.
6. Diseccionar la fascia entre el músculo pectoral mayor y el pectoral menor utilizando una técnica de disección roma para exponer el espacio intercostal del cuarto lado izquierdo.
   NOTA: Evite el daño excesivo de los tejidos y las lesiones vasculares que causarán sangrado severo y muerte postoperatoria.
7. Diseccione los músculos intercostales, coloque un retractor torácico dentro del cuarto espacio intercostal y luego separe las costillas.
8. Desgarrar el pericardio y extraer el tejido adiposo adherido.
   NOTA: Evite dañar otros órganos con instrumentos quirúrgicos afilados, especialmente los pulmones. El daño a los pulmones puede resultar en el desarrollo de neumotórax y hemoneumotórax durante la operación, causando consecuencias cacoéticas que van desde trastornos hemodinámicos hasta una menor supervivencia de los animales.
9. Manipule la posición del timo y exponga suavemente la aorta ascendente y las aurículas izquierdas. Identifique y lige la arteria descendente anterior (DA) anterior (LAD) proximal izquierda de forma transitoria durante 45 min con una sutura de polipropileno 6-0 (ver Figura 1 A-D).
   NOTA: Este procedimiento es idéntico para las ratas de control simuladas, excepto que el LAD no está ligado.
10. Retire el retractor torácico y junte las costillas en un patrón de sutura interrumpido con una sutura de polipropileno 3-0.
11. Restablezca la presión intratorácica negativa para garantizar una respiración efectiva.
    NOTA: Se pueden utilizar dos métodos para restaurar la presión intratorácica negativa: i) antes de cerrar la cavidad torácica, los investigadores pueden taponar la salida de aire del ventilador durante 2 ciclos para inflar los pulmones. ii) El aire que queda en la cavidad torácica se puede extraer con una jeringa después de que se haya cerrado el espacio intercostal.
12. Después de la depilación y desinfección, realizar una incisión en la extremidad inferior derecha y diseccionar la fascia superficial de la vena femoral derecha.
13. Aflojar la ligadura y comprobar las condiciones respiratorias y circulatorias después de inducir isquemia miocárdica durante 45 min.
14. Inyecte una solución salina de FITC-dextrano al 10% (p/v) en la vena femoral a 0,15 mL/100 g de peso corporal, y presione la vena femoral durante 1 minuto con bolas de algodón estériles para detener el sangrado (Figura 2A, B).
    NOTA: Alternativamente, inyecte 1% p/v de solución salina y EB en la vena femoral a una dosis de 0,5 mL/100 g de peso corporal.
15. Coser las incisiones con una sutura de polipropileno 3-0 y desinfectar las incisiones, seguido de analgesia postoperatoria con ibuprofeno, como se ha descrito anteriormente.

4. Preparación de cortes de tejido congelado para la medición de fluorescencia

1. Inyectar al 5% p/v de solución de pentobarbital sódico/PBS a una dosis de 150 mg/kg (0,3 mL/100 g de peso corporal) por vía intraperitoneal para anestesiar profundamente a las ratas después de 3 h de reperfusión miocárdica.
2. Raje la cavidad abdominal y exponga la aorta abdominal y la vena cava (ver en la figura 3A).
3. Inyecte 50 ml de PBS helado en la vena cava de manera constante, corte la aorta abdominal para eliminar la sangre del miocardio y extraiga el corazón.
   NOTA: Observe los cambios en los pulmones y el hígado. Un hígado sudoroso sugiere que la solución salina se inyecta con precisión en la vena cava (ver en la Figura 3C), y un pulmón pálido se considera un signo de un miocardio bien perfundido (ver en la Figura 3B).
4. En una habitación oscura, enjuague suavemente el corazón con solución salina helada o PBS para eliminar cualquier resto de sangre y FITC-dextrano (o EB) de las cavidades del corazón.
5. Corte el corazón de la ligadura y deseche el miocardio por encima de la ligadura.
6. Incrustar el corazón en moldes con compuesto de incrustación seguido de almacenamiento a -80 °C.
7. Descargue los tejidos congelados de los moldes de inclusión y cárguelos en soportes de muestras en una cámara preenfriada a -20 °C de una cortadora de congelación.
8. Ajuste el grosor de una sola rebanada a 5-8 μm y corte el tejido aproximadamente en el punto medio del eje base-ápice (por ejemplo, el centro de la isquemia).
9. Cargue el tejido cortado en portaobjetos adhesivos de microscopio y selle cada corte con una gota (aproximadamente 40 μL) de medio de montaje fluorescente que contenga DAPI.
10. Mantenga las diapositivas en una caja seca y oscura.
    NOTA: Si los portaobjetos no se pueden escanear inmediatamente, guárdelos en un lugar seco, fresco y oscuro para evitar la formación de agua condensada y el enfriamiento de la fluorescencia.

5. Medición de fluorescencia y análisis de datos

1. Configure el sistema de imágenes y compruebe el software conectado al escáner.
2. Cargue las diapositivas en los estantes de portaobjetos e insértelas en el escáner.
3. Abra el software del escáner de diapositivas (consulte la Tabla de materiales) y configure un nuevo protocolo de exposición haciendo clic en Editar protocolo | Nuevo....
   NOTA: Si el escáner o su software asociado no están disponibles, un microscopio confocal láser (consulte la Tabla de Materiales) u otros escáneres de portaobjetos ordinarios con el modo de fluorescencia (consulte la Tabla de Materiales) pueden ser una alternativa al escáner de fluorescencia cuantitativa automatizado.
4. Cambie el nombre del protocolo y del estudio, y seleccione el modo de fluorescencia .
5. Definir escaneo de diapositivas completas | Resolución de píxeles y regiones multiespectrales | Resolución de píxeles de 0,25 μm (40x) respectivamente.
6. Haga clic en Editar filtros y bandas... para seleccionar la columna Filtros de escaneo de diapositivas completas y la columna Bandas de región multiespectral .
   NOTA: Si se utiliza EB, seleccione Filtros de escaneo de diapositivas completas | DAPI y Texas Red o AF495. Si se utiliza FITC-dextran, seleccione Bandas de región multiespectral | DAPI y FITC o AF488.
7. Haga clic en Editar Exposiciones... y cargue el portador.
8. Seleccione la ranura de destino y haga clic en Obtener información general.
   NOTA: Esto toma una exploración de campo claro de cada sección del corazón. Seleccione el miocardio para enfocar o seleccione el área a ciegas.
9. Seleccione la diapositiva objetivo, ajuste la altura del escenario a aproximadamente -50 μm y haga clic en Enfoque automático.
10. Haga clic en Exposición de escaneo completo (ms)-DAPI | Autoexposición.
    NOTA: El tiempo de exposición de DAPI para cada portaobjetos no tiene por qué ser el mismo porque las imágenes con DAPI se utilizan para ilustrar secciones transversales del corazón, que son convenientes para delinear el área del miocardio, pero no para calcular la densidad de fluorescencia.
11. Haga clic en Exposición de escaneo completo (ms)-FITC | Autoexposición.
    NOTA: Haga clic en Exposición de escaneo completo (ms)-Texas Red | Exposición automática si se usa EB. Es importante recordar y asegurarse de que el tiempo de exposición de FITC o Texas Red sea el mismo en todos los escaneos de diapositivas.
12. Haga clic en Enfoque automático nuevamente y asegúrese de que la diapositiva esté enfocada.
13. Haga clic en Atrás y guarde el protocolo.
14. Repita los pasos 5.7 a 5.14 para cada diapositiva.
15. Regrese a la página de inicio y haga clic en Escanear diapositivas.
16. Seleccione una ranura, cambie el nombre de todas las diapositivas y seleccione el protocolo de exposición correspondiente para cada diapositiva.
17. Escanee las diapositivas y capture las imágenes.
18. Abra las imágenes con el software de visualización de diapositivas para los escaneos (consulte la Tabla de materiales).
19. Amplíe todas las imágenes en una medida relativamente igual.
20. Tome instantáneas y guarde imágenes como .tiff.
    NOTA: Es mejor guardar las imágenes con y sin barras de escala al mismo tiempo. Las imágenes con barras de escala se pueden utilizar para la publicación, mientras que las que no tienen barras de escala se pueden utilizar para el análisis estadístico.
21. Abra el software ImageJ, haga clic en Analizar y seleccione Establecer medición.
22. Seleccionar área | Densidad integrada.
23. Abra la imagen en el canal FITC con la imagen J.
24. Haga clic en Analizar nuevamente y registre el valor numérico de densidad integrada (IntDen) que aparece.
    NOTA: Dado que las barras de escala en las imágenes pueden confundirse con la escala de grises de fluorescencia por las computadoras, use imágenes sin barras de escala para medir IntDen.
25. Cierre la imagen FITC y abra la imagen en el canal DAPI.
26. Esboza una sección transversal del miocardio.
27. Haga clic en Analizar y recopilar datos de área .
28. Calcule las proporciones de IntDen/Area (media de fluorescencia) para cada corazón.
29. Ingrese todas las proporciones en el software de análisis estadístico.

Resultados

Antes de realizar el ensayo FITC-dextrano para evaluar los cambios en la permeabilidad endotelial cardíaca después de la RI, recomendamos encarecidamente que el mismo investigador especializado en el establecimiento de un modelo de RI miocárdico en ratas realice experimentos para confirmar que las arterias coronarias están ocluidas en la misma posición con éxito, y que las relaciones entre el área isquémica y el área total son constantes en todas las ratas. Como se muestra en la Figura 1A,B, se expuso el corazón (indicado con flecha amarilla) y se formó un asa (indicado con flecha verde) en el miocardio ubicado en la pared anterior del ventrículo izquierdo, aproximadamente 2 mm por debajo del borde de la orejuela auricular izquierda con un tubo de silicona capilar de 0,5 mm (diámetro interior) y sutura 6-0. Como se ve en la Figura 1C, cuando se colocó el asa, el miocardio isquémico cambió de rosa a rosa grisáceo (indicado por la flecha blanca) inmediatamente.

Además, el miocardio se reperfundió y recuperó su color rosado inmediatamente después de que se aflojó el bucle, como se ilustra en la Figura 1D. Después de aflojar el asa, se realizó una incisión paralela al eje largo del fémur en la parte interna del muslo. La vena femoral se expuso y se perforó con una jeringa de insulina, como se muestra en la Figura 2A,B. Tras una reperfusión de 3 h, se realizó una incisión en "V" en la parte inferior del abdomen y se disecaron la aorta abdominal y la vena cava del peritoneo (Figura 3A). Se inyectó suero fisiológico frío en la vena cava de forma suave y se cortó la aorta abdominal para evitar que la pared ventricular se estirara excesivamente debido a la presión intraventricular que afectaría a su estructura histopatológica. Los pulmones blanqueados (flecha roja en la Figura 3B) y el hígado en la Figura 3C indican que el tejido estaba bien reperfundido con solución salina.

En consecuencia, no hubo diferencia significativa en el área transversal entre los tres grupos: 1,00 ± 0,08 en el grupo Sham vs. 0,97 ± 0,08 en el grupo RI vs. 1,02 ± 0,04 en el grupo IR+TXL (Figura 4A, n = 6 en cada grupo, p > 0,05 entre dos grupos cualesquiera). Como se muestra en la Figura 4B,C, la intensidad media de la fluorescencia verde en todas las secciones de las ratas Sham fue extremadamente baja. Por el contrario, la fluorescencia emitida por el FITC-dextrano extravalado aumentó notablemente en el grupo IR, normalizado al grupo Sham (5,52 ± 0,85 en el grupo IR vs. 1,00 ± 0,19 en el grupo Sham, n = 6, p < 0,05). Además, el polvo superfino TXL, conocido por proteger el endotelio microvascular cardíaco ^14,16, revirtió notablemente la mayor intensidad de fluorescencia inducida por IR (2,87 ± 0,52 en el grupo IR+TXL frente a 5,52 ± 0,85 en el grupo IR, n = 6, p < 0,05). Las imágenes del miocardio regional indicaron que el FITC-dextrano se acumulaba abrumadoramente en la matriz extracelular pero no en los microvasos, y que el TXL mejoraba la función de la barrera endotelial (Figura 5).

En comparación con el FITC-dextrano, el EB puede ser una alternativa subóptima porque el EB es inferior a 70.000 Da FITC-dextrano tanto en calidad de imagen como en sensibilidad. Del mismo modo, no hubo diferencia significativa en el área transversal entre los tres grupos: 1,00 ± 0,08 en el grupo Sham vs. 0,97 ± 0,08 en el grupo RI vs. 0,98 ± 0,05 en el grupo IR+TXL (Figura suplementaria S1A, n = 6 en cada grupo, p > 0,05 entre dos grupos cualesquiera). Como se muestra en la Figura Suplementaria S1B,C, la intensidad media de la fluorescencia roja en secciones transversales completas de ratas Sham fue relativamente mayor, especialmente en el endocardio y el epicardio. Aunque la fluorescencia roja emitida por EB aumentó bruscamente en el grupo IR (4,41 ± 0,66 en el grupo IR vs. 1,00 ± 0,22 en el grupo Sham, n = 6, p < 0,05), la diferencia entre los grupos IR+TXL e IR no fue significativa (3,73 ± 0,47 en el grupo IR+TXL vs. 4,41 ± 0,66 en el grupo IR, n = 6, p = 0,0956).

Además, este método se probó en un modelo de infarto de miocardio (IM) (Figura suplementaria S2). En el grupo de primera eyección (MII) de infarto I miocárdico, se inyectó en la circulación una solución de FITC-dextrano (a la misma concentración mencionada anteriormente) 5 min antes de la ligadura de LAD. Esto contrasta con la solución de FITC-dextrano inyectada inmediatamente después de la ligadura en las ratas MIL (M yocardial I nfarction Ligation first) descrita anteriormente en este protocolo. Curiosamente, solo se extravasaron cantidades bajas de FITC-dextrano en la MEC del miocardio lesionado en ratas IM de ambos grupos, lo que se indica por la débil intensidad de fluorescencia verde en la Figura Suplementaria S2.

Figura 1: Campo visual de la toracotomía y establecimiento de isquemia/reperfusión en un modelo de rata. (A) Exponer el corazón de la rata (indicado con una flecha amarilla); (B) formando un bucle para rodear la arteria coronaria (indicado por una flecha verde); (C) fijación del asa e inducción de isquemia miocárdica durante 45 min (indicado con flecha blanca); (D) aflojar el asa y permitir la reperfusión miocárdica durante 3 h (indicado por la flecha azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disección de la vena femoral e inyección intravenosa. (A) Exponer la vena femoral (el nervio femoral se indica con la flecha a la izquierda; la arteria femoral se indica con la flecha en el medio; la vena femoral se indica con la flecha a la derecha). (B) Inyectar solución de FITC-dextrano en la vena femoral con una jeringa de insulina. Abreviatura: FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Perfusión tisular y síntomas de perfusión eficiente. (A) Disección de la aorta abdominal y la vena cava (la aorta abdominal se indica con la flecha blanca; la vena cava se indica con la flecha negra). (B) Los pulmones blanqueados son un síntoma de perfusión adecuada; (C) la mucosa blanqueada, el riñón blanqueado y el hígado sudoroso son síntomas de una perfusión adecuada (flecha roja: mucosa; flecha blanca: hígado; flecha negra: riñón). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes representativas y análisis de la intensidad media de fluorescencia mediante tinción con FITC-dextrano. (A) Área transversal relativa de cada grupo normalizada a la del grupo Sham (p > 0,05); (B) intensidad relativa de fluorescencia en el canal FITC de cada grupo normalizada a la del grupo Sham; (C) imágenes representativas con un aumento de 9,5x en cada grupo. Barras de escala = 800 μm. ANOVA de un factor con comparaciones post-hoc de múltiples grupos de Tukey. * vs. grupo Sham, p < 0,05; # vs. grupo IR, p < 0.05. Los gráficos de barras muestran la media del grupo ± DE. Abreviaturas: IR = isquemia/reperfusión; TXL = Tongxinluo; FITC = isotiocianato de fluoresceína; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; ANOVA = análisis de varianza; DE = desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes representativas de las áreas de interés con un aumento de 200x de cada grupo después de la tinción con FITC-dextrano. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Imágenes representativas y análisis de la intensidad media de fluorescencia mediante tinción con azul de Evans. (A) Área relativa de la sección transversal de cada grupo normalizada a la del grupo Sham (p > 0.05); (B) intensidad relativa de fluorescencia en el canal rojo de Texas de cada grupo normalizada a la del grupo Sham; (C) imágenes representativas de cada grupo. ANOVA de un factor con comparaciones post-hoc de múltiples grupos de Tukey. Barras de escala = 800 μm. * vs. grupo Sham, p < 0,05. Los gráficos de barras muestran la media del grupo ± DE. Abreviaturas: IR = isquemia/reperfusión; TXL = Tongxinluo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; ANOVA = análisis de varianza; DE = desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Imágenes representativas con un aumento de 9,5x de la tinción con FITC-dextrano en un modelo de infarto de miocardio. Barras de escala = 800 μm. Abreviaturas: MII = inyección de infarto de miocardio primero (inyectar FITC-dextrano antes del infarto de miocardio); MIL = ligadura de infarto de miocardio primero (inyectar FITC-dextrano inmediatamente después del infarto de miocardio); FITC = isotiocianato de fluoresceína; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo para evaluar la disfunción de la barrera endotelial cardíaca tras la exposición a MIRI. Cabe señalar que hay varios pasos cruciales en este protocolo que determinan la confiabilidad y precisión de los resultados. Todos los pasos relacionados con FITC-dextrano deben realizarse en una habitación oscura. Las soluciones de FITC-dextrano/solución salina deben almacenarse a 4 °C y envolverse con papel de aluminio. Además, las arterias coronarias deben ligarse, como se ilustra en la Figura 1, para que el miocardio pueda reperfundirse inmediatamente después de aflojar el asa. Los investigadores pueden elegir suturas de polietileno 5-0 o 6-0 porque las cuerdas más delgadas por debajo de 7-0 tienen más probabilidades de cortar las fibras y los vasos miocárdicos. Es importante destacar que la solución trazadora debe inyectarse en las venas femorales y no en las venas de la cola. Cada corazón debe estar bien perfundido y bien enjuagado con solución salina helada antes y después de ser sacrificado, respectivamente.

Muchos investigadores especializados en MIRI se inclinan por estudiar la estructura subcelular alterada del endotelio en la etapa más temprana de la reperfusión miocárdica (la formación de cuerpos apoptóticos, la inflamación de las mitocondrias y las uniones intercelulares anormales) para demostrar la hiperpermeabilidad del endotelio a través de un examen de microscopía electrónica. La inmunotransferencia también se ha utilizado para medir la permeabilidad microvascular porque la disminución de los niveles de proteínas de conjunción estrecha se considera el mecanismo central de la lesión endotelial y el mal funcionamiento de la barrera endotelial con el tiempo. Por ejemplo, la VE-cadherina²⁰ y la β-catenina²¹ son elementos clave de las uniones de adhesión endotelial de célula a célula, y estas conexiones contribuyen al mantenimiento de la integridad vascular²². Las uniones estrechas, como JAM-A^23,24 y ocludina²⁵, también participan cooperativamente en la construcción de la barrera endotelial en el sistema circulatorio.

En la actualidad, un número cada vez mayor de estudios sugiere que la función mitocondrial y la homeostasis mitocondrial podrían ser objetivos clave de las vías protectoras contra la lesión por reperfusión. Como se ha informado en estudios fisiopatológicos y farmacológicos, la mitofagia puede desempeñar un papel importante en la muerte celular del endotelio y el miocardio inducida por IR²⁶. Además, la fisión mitocondrial, la proteostasis mitocondrial y el control de calidad mitocondrial pueden proteger el miocardio de alto riesgo en áreas reperfundidas^27,28. Los métodos anteriores se centran más en demostrar los diferentes mecanismos o causas de la hiperpermeabilidad que en mostrar la permeabilidad endotelial de forma directa y visual. Además, la preparación de la muestra para el examen de microscopía electrónica es complicada y peligrosa. Las soluciones de glutaraldehído, acetona y ácido ósmico utilizadas en microscopía electrónica probablemente volatilizan y erosionan la mucosa, la conjuntiva y la piel, incluso amenazando vidas si se usan en entornos no controlados.

En comparación con estos métodos indirectos y potencialmente mortales, este método, que mide la intensidad de fluorescencia emitida por la extravasación de FITC-dextrano, es ideal para evaluar la permeabilidad microvascular cardíaca. En primer lugar, el FITC-dextrano 70.000 Da no puede penetrar a través del endotelio en condiciones fisiológicas normales, pero puede entrar en el espacio intersticial miocárdico bajo IR, lo que permite una clara diferenciación entre ratas bajo diferentes tratamientos. Además, la solución de FITC-dextrano se inyecta en la sangre a través de las venas femorales, lo que garantiza que todo el líquido se inyecte en la circulación de la rata. Por el contrario, la inyección de la vena de la cola es más difícil en las ratas porque la vena de la cola es indistinta y está cubierta por un estrato grueso. Además, a diferencia de la fijación regular de paraformaldehído y la inclusión de parafina, el tratamiento del tejido miocárdico se simplifica y optimiza utilizando la técnica de sección patológica de congelación rápida utilizada en este estudio. El corto tiempo de almacenamiento, el entorno a prueba de luz y la criopreservación pueden aliviar en conjunto el apagado por fluorescencia de FITC.

Más importante aún, este método puede minimizar el sesgo de selección durante el análisis estadístico. Realizamos suficiente perfusión cardíaca con solución salina para garantizar que casi toda la sangre mezclada con FITC-dextrano se elimine del miocardio y de las cámaras cardíacas, lo que puede eliminar la fluorescencia emitida por cualquier FITC que quede en los vasos. Si este no es el caso, la fluorescencia fusionada con los capilares debe excluirse y recortarse artificialmente. Al recolectar tejido de las áreas de interés, no se observó ningún límite visual entre el miocardio isquémico y el miocardio remoto, especialmente después de la tinción con colorante EB. Esto dificultó la recolección de muestras de estas áreas representativas. Utilizando el método descrito en este documento, los investigadores pueden obtener imágenes de secciones enteras y analizar la intensidad de fluorescencia utilizando un escáner deslizante cuantitativo.

Curiosamente, el colorante EB puede ser una alternativa, aunque subóptima, al FITC-dextrano. En comparación con las condiciones de almacenamiento relativamente duras del FITC-dextrano, el polvo EB o su solución pueden permanecer estables a temperatura ambiente durante mucho tiempo. Además, el EB es relativamente barato para la mayoría de las instituciones. No obstante, ciertas desventajas podrían limitar su aplicación. En primer lugar, la tinción EB muestra una sensibilidad más baja que el FITC-dextrano, lo que puede subestimar las diferencias entre los grupos y aumentar el tamaño de la muestra de cada grupo. Además, EB muestra una mayor adhesión a las proteínas. El endocardio y el epicardio se tiñen más fácilmente con EB, lo que puede influir en los resultados de la densidad de fluorescencia. Además, los defectos de relleno evidentes en el área de reperfusión reducen notablemente la calidad de la imagen, lo que puede limitar el uso de EB.

Para extender la aplicación de este método en un modelo de IM, el método se probó en un modelo de IM. En primer lugar, se inyectó FITC-dextrano en los vasos sanguíneos después de la ligadura de la DA. Como era de esperar, se emitió un bajo nivel de fluorescencia desde el corte porque el FITC-dextrano en el flujo sanguíneo no puede pasar a través del sitio ligado, y ningún FITC-dextrano entró en el área isquémica. También se aplicó FITC-dextrano 5 min antes de la ligadura para asegurar el paso de FITC-dextrano a todos los órganos. En consecuencia, el FITC-dextrano logró penetrar en el endotelio microvascular, probablemente porque ninguna presión de perfusión en los vasos sanguíneos ligados puede conducir el FITC-dextrano a través del endotelio. En general, este método probablemente requiere significativamente más modificaciones para satisfacer su aplicación en el modelo de IM.

A pesar de las ventajas anteriores, este método tiene limitaciones. En primer lugar, este protocolo no se probó en modelos IR de otros animales, lo que puede limitar su aplicación en estudios preclínicos y clínicos. En segundo lugar, los tintes marcados con FITC son más caros que otros tintes comunes como el EB. Sin embargo, a diferencia de la EB, como la solución de FITC-dextrano al 10% p/v, diluida con suero, rara vez cambia el color del miocardio, la tinción con FITC-dextrano y la tinción dual de EB/2,3,5-cloruro de trifeniltetrazol (TTC) pueden realizarse en el mismo corazón, lo que puede recortar el presupuesto con respecto al número de animales y los colorantes utilizados. Por último, es posible que el escáner de portaobjetos utilizado en este estudio, el escáner cuantitativo de portaobjetos e instrumentos similares, no esté disponible en algunos laboratorios. En resumen, este protocolo presenta un método simplificado, fiable y visual para la detección de la permeabilidad endotelial microvascular cardíaca en un modelo de IR en ratas utilizando un ensayo de fluorescencia basado en un sistema automatizado de imagen de patología cuantitativa. Este protocolo demuestra que el FITC-dextrano 70.000 Da se comporta mejor que el EB en la evaluación funcional de la barrera endotelial de los microvasos cardíacos tras una lesión IR.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
16 G Angiocather	Becton Dickinson, EE. UU.	2089312
3-0 sutura de polipropileno, aguja cónica	Ethicon, EE. UU.	KGP693
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Invitrogen, EE. UU	D3571	Alternativa al medio de montaje con sutura de
polipropileno DAPI 6-0, aguja redonda	Ethicon, EE. UU	KGJ656
Portaobjetos de microscopio adhesivos	CITOTEST, China	188105
Ventilador ALC-V8S	Shanghai Alcott Biotech, China	Sistema de calentamiento a temperatura constante ALC-V8S
		de
		F12005-10
FITC-dextran, 70,000Da	Sigma-Aldrich, EE. UU	53471
Crema Depilatoria	Nair, EE. UU	/A Jeringa
insulina, 1ml	Becton Dickinson, EE. UU.	8155672
Soportes de microagujas	RWD ciencias de la vida, China	F31047-12
Pinzas para mosquitos-CVD	RWD ciencias de la vida, China	F22007-12
Medio de montaje con DAPI	ZSGB-BIO, China	ZLI-9557
Sistema de iluminación de fibra óptica multiposición	RWD ciencias de la vida, China	76301
Tijeras de operación	RWD ciencias de la vida, China	S14014-12
Pannoramic SCAN	3DHISTECH, Budapest, Hungría	SC150-211305	Escaneo de diapositivas alternativo a Vectra Polaris
Fenográfico 1.0.8	PerkinElmer, EE. UU.	N/A	Software de visor de diapositivas
Solución salina tamponada con fosfato	HyClone, EE. UU.	SH30256.01
Retractores, 30 mm Extensión, 5 cm	RWD Ciencias de la vida, China	F22005-45
SP8 Microscopio confocal	Leica, alemán	TCS-SP8 SR	Alternativa a Vectra Polaris
Cinta quirúrgica	3M, EE. UU.	1527C-0
Tissue-Tek O.C.T. Compuesto	SAKURA, Japón	0822-00
Tongxinluo polvo superfino	Yiling, China	Z19980015
Cortadora de congelación ultravioleta	Leica, alemán	CM1950
Software Vectra Polaris 1.0.7	PerkinElmer, EE. UU	/A	Software de escaneo de diapositivas
Vectra Polaris Escáner de portaobjetos cuantitativo	PerkinElmer, Estados Unidos	VP1814N1068