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Artículo de método

Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células

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DOI:

10.3791/62753

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29 de octubre de 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.

Resumen

La expresión génica libre de células ofrece el poder de la biología sin las complicaciones de un organismo vivo. Aunque existen muchos de estos sistemas de expresión génica, la mayoría son bastante caros de comprar y / o requieren equipos especiales y experiencia finamente perfeccionada para producir de manera efectiva. Este protocolo describe un método para producir lisado libre de células bacterianas que admite altos niveles de expresión génica, utilizando solo equipos de laboratorio estándar y requiriendo un procesamiento mínimo. El método utiliza una cepa de Escherichia coli que produce una endolisina que no afecta el crecimiento, pero que lisa eficientemente un pellet celular cosechado después de un simple ciclo de congelación-descongelación. El único procesamiento adicional requerido es una breve incubación seguida de centrifugación para limpiar el autolisado de desechos celulares. Los circuitos genéticos dinámicos se pueden lograr a través de la expresión heteróloga de la proteasa ClpX en las células antes de la recolección. Una cepa de E. coli que carece del gen lacZ se puede utilizar para aplicaciones de biodetección de alta sensibilidad y libre de células utilizando una lectura colorimétrica o fluorescente. Todo el protocolo requiere tan solo 8-9 horas, con solo 1-2 horas de trabajo práctico desde la inoculación hasta la finalización. Al reducir el costo y el tiempo para obtener lisado libre de células, este método debería aumentar la asequibilidad de la expresión génica libre de células para diversas aplicaciones.

Introducción

La expresión génica en lisados libres de células tiene varias ventajas sobre el uso de células vivas1,2,3,4. Los lisados pueden modificarse bioquímicamente fácilmente y usarse en condiciones que podrían ser perjudiciales o imposibles de lograr en células vivas. Los circuitos de expresión génica no tienen que competir con los procesos biológicos del huésped, y probar nuevos circuitos genéticos es tan simple como agregar ADN. Por estas razones, la expresión génica libre de células ha encontrado diversas aplicaciones, desde biosensores5,6 hasta la rápida creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos7,8 y el desarrollo de células artificiales9. La mayoría de la expresión génica libre de células utiliza lisados celulares que han sido altamente procesados, generalmente requieren protocolos largos y complejos, equipos especializados y / o pasos sensibles que pueden conducir a una variación significativa entre los usuarios y los lotes10,11.

Este documento describe un método simple y eficiente para producir lisado libre de células que requiere un procesamiento y experiencia mínimos(Figura 1A)12. El método se basa en células de E. coli que están diseñadas para lisarse después de un simple ciclo de congelación-descongelación. Las células expresan una endolisina del fago lambda que degrada la pared celular. A medida que las células crecen, esta endolisina permanece en el citoplasma, secuestrada de la pared celular. Sin embargo, un simple ciclo de congelación-descongelación interrumpe la membrana citoplasmática, liberando la endolisina en el periplasma, donde degrada la pared celular, lo que resulta en una rápida lisis celular. El protocolo se puede completar con solo unas pocas horas de trabajo práctico y solo requiere un congelador, una centrífuga capaz de 30,000 × g (para obtener resultados óptimos; se pueden usar velocidades más bajas con más cuidado para no molestar el pellet), un mezclador de vórtice y una solución tampón simple. El lisado funcional puede incluso producirse mediante la liofilización de las células y su rehidratación in situ. Sin embargo, este método produce lisados con menor actividad, presumiblemente debido a los restos celulares restantes.

Los lisados son altamente activos para la expresión génica libre de células, y se pueden mejorar de varias maneras dependiendo del uso final. La tasa de síntesis de proteínas se puede aumentar aún más concentrando el lisado utilizando concentradores de espín estándar. El ADN lineal se puede proteger de la degradación mediante la adición de proteína GamS purificada. La degradación de proteínas, necesaria para una dinámica de circuitos más compleja como la oscilación, se puede lograr coexpresando un hexámero ClpX en la cepa productora de autolisato13. Finalmente, las lecturas visuales basadas en LacZ se habilitan mediante el uso de una tensión de autolisado que carece de lacZ. En general, este método produce lisado libre de células altamente activo que es adecuado para una amplia gama de aplicaciones.

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Protocolo

1. Prepare medios y búferes.

  1. Preparar el medio 2xYTPG.
    1. Mezcle 62 g de polvo de 2xYT, 5,99 g de fosfato de potasio monobásico, 13,93 g de fosfato de potasio dibásico y agua desionizada a 2 L.
    2. Autoclave en ciclo líquido con un tiempo de exposición de 30 min14.
    3. A 400 ml de medios 2xYTP de 1.1.2, agregue 7.2 g de D-glucosa (dextrosa) y mezcle hasta que se disuelva.
    4. Filtro-esterilizar a través de un filtro de 0,2 μm.
  2. Prepare el búfer de S30A.
    1. Mezcle Tris-HCl (pH 7.7, concentración final de 50 mM), glutamato de potasio (60 mM final) y glutamato de magnesio (14 mM final).
    2. Ajuste el pH a 7,7 usando 10 M KOH.
  3. Preparar la Solución 1 (consulte la Tabla 1).
    1. Resuspend ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinatanosulfónico (HEPES) en 2 ml de agua.
    2. Ajuste el pH a 8.0 usando KOH.
    3. Agregue todos los demás componentes de la Tabla 1.
    4. Ajuste el pH a 7.6 usando 10 M KOH. Filtro-esterilización.
  4. Preparar la solución de premezcla 2.5x (ver Tabla 2).
    1. Mezclar todos los componentes de la Tabla 2.
    2. Ajuste el pH a 7.5 usando KOH.
    3. Alícuota y congelación a -80 °C.
      NOTA: Una reacción de 20 μL utiliza 8,9 μL de premezcla.

2. Preparar las celdas.

  1. Rayar las células autolisadas en placas de agar LB que contienen 50 μg/ml de ampicilina utilizando un bucle inocular y crecer a 37 °C (ver Nota 1).
  2. Elija una sola colonia en un cultivo iniciador de LB / medio de ampicilina usando una punta de pipeta y crezca a 37 ° C durante la noche.
  3. Inocular 400 mL de medio 2xYTPG que contenga 50 μg/ml de ampicilina con 400 μL de cultivo iniciador, y crecer a 37 °C en un matraz Erlenmeyer de 1 L, agitando a 300 rpm.
  4. Mida periódicamente la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD600)utilizando un espectrofotómetro para leer una cubeta óptica con una longitud de trayectoria de 1 cm. Cuando el OD600 exceda 1, comience a diluir el cultivo 5 veces antes de las mediciones para asegurarse de que las mediciones permanezcan dentro del rango lineal de un espectrofotómetro de laboratorio típico. Continuar cultivando las células hasta que el cultivo diluido de 5 veces alcance OD600 de 0.3 (correspondiente a un cultivo OD600 de 1.5).

3. Preparar el lisado.

  1. Prepare el tampón S30A suplementado con ditiotreitol (TDT) de 2 mM. Mezclar 3 ml de tampón S30A con 6 μL de solución madre de TDT a 1 M. Colocar sobre hielo para su uso en el paso 3.7.
  2. Cosechar las células centrifugando a 1800 × g durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Deseche el sobrenadante vertiéndolo y usando una pipeta para eliminar cualquier líquido restante.
  4. Resuspend el pellet en 45 ml de tampón S30A frío (4-10 °C) utilizando un mezclador de vórtice.
  5. Pese un tubo centrífugo vacío de 50 ml, transfiera las células a él y repita los pasos 3.2-3.3 para lavar las células.
  6. Pesar el pellet, restando el peso de un tubo vacío de 50 mL. Asegúrese de aspirar cuidadosamente cualquier sobrenadante restante para garantizar una medición precisa del peso del pellet.
    NOTA: Un rendimiento típico es de ~ 1.3 g de pellet celular de 400 ml de cultivo de producción.
  7. Agregue 2 volúmenes de tampón S30A frío suplementado con 2 mM de ditiotreitol, es decir, 2 ml de tampón por cada 1 g de gránulo celular, y resuspenda las células mediante una mezcla vigorosa de vórtice.
  8. Congelar las células. Coloque el tubo de 50 ml que contiene las células en un congelador de -20 °C o -80 °C hasta que el pellet esté completamente congelado.
    NOTA: El paso de congelación es un buen punto de parada para el día.
  9. Descongele las celdas en un baño de agua a temperatura ambiente.
  10. Vórtice vigorosamente durante 2-3 min.
  11. Incubar a 37 °C durante 45 min con agitación a 300 rpm.
  12. Limpie la muestra de desechos celulares pesados centrifugando en tubos de centrífuga transparentes a 30.000 × g durante 45 min a 4 °C.
    NOTA: Si no se dispone de una centrífuga capaz de 30.000 x g, centrífuga durante 45 min a 21.000 × gy tenga precaución adicional en el paso 3.13, ya que el pellet será menos compacto.
  13. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo con una pipeta, evitando molestar el pellet tanto como sea posible. Si el sobrenadante transferido está contaminado con material del pellet, repita el paso anterior.
  14. Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrífuga una vez más a 21.000 × g (o la velocidad máxima de una centrífuga de mesa) durante 5 minutos.
  15. Alicuar el autolisado desaclarado en los volúmenes deseados, evitando cuidadosamente cualquier pellet restante, y congelar a -80 ° C o usar inmediatamente.
    NOTA: Una sola reacción de 20 μL utiliza 8 μL de autolisato.

4. Expresión génica libre de células

NOTA: El autolisado ya está listo para cualquier uso final deseado. El siguiente es un ejemplo de protocolo estándar para la expresión génica libre de células.

  1. Para una reacción de 20 μL, mezclar sobre hielo 8 μL de autolizado y 8,9 μL de premezcla. Ver NOTA al final de la sección de protocolo con respecto a la optimización de las concentraciones de glutamato de magnesio y PEG 8000.
  2. Añadir ADN (por ejemplo, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 a una concentración final de 8 nM), cualquier otro reactivo y agua a 20 μL.
  3. Coloque la reacción en una microplaca de 384 pocillos y mida el curso del tiempo de fluorescencia y / o los puntos finales utilizando un lector de placas. Para la proteína verde fluorescente (GFP), utilice una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.

5. Modificaciones del protocolo

Nota : las siguientes modificaciones del protocolo le permiten servir a otras aplicaciones.

  1. Expresión génica libre de células utilizando plantillas lineales de ADN
    1. Realice los pasos de la sección 4, complementando la reacción con 2,2 μM de proteína GamS purificada (expresada y purificada como se describe12)antes de la adición del ADN lineal.
  2. Expresión génica libre de células que incorpora degradación de proteínas
    1. En el paso 2.1, utilice células autolizadas que contengan el plásmido pACYC-FLAG-dN6-His (consulte la Tabla de materiales). En todos los medios de crecimiento, además, se incluyen 34 μg/ml de cloranfenicol.
    2. En el paso 2.3, incluir 40 μM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el medio de crecimiento para inducir la expresión del plásmido.
    3. Repita los pasos 3.2-3.4 (lavado) dos veces adicionales (para un total de tres lavados) para garantizar la eliminación completa del cloranfenicol, que es un inhibidor de la traducción. Para los dos primeros lavados (paso 3.4), sustituya el tampón S30A por solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4).
    4. En el paso 4.2, complemente con un ATP adicional de 3 mM (agregado de una solución madre de 100 mM ATP en agua, pH 7.2) y 4.5 mM de glutamato de magnesio (utilizando una solución madre de 1 M en agua) (concentraciones finales) para compensar el alto uso de ATP por ClpXP, así como la quelación de magnesio por el ATP adicional.
  3. Expresión génica libre de células utilizando lecturas basadas en LacZ (incluyendo colorimétricas)
    1. En el paso 2.1, utilice celdas de autolisado que no expresen LacZ de forma nativa (consulte la Tabla de materiales).
  4. Alternativamente, prepare el lisado directamente de las células liofilizadas.
    1. Realice todos los pasos de 1.1 a 3.7.
    2. Mezclar 8 μL de suspensión celular con 8,9 μL de premezcla.
    3. Agregue ADN plásmido (si lo desea), otros reactivos personalizados y agua para alcanzar un volumen final de 20 μL.
    4. Transfiera la reacción a una microplaca de 384 pocillos y séquela con liofilización.
      NOTA: Las muestras liofilizadas se pueden almacenar hasta por una semana y posiblemente más.
    5. Para comenzar la reacción, rehidrate con 18 μL de agua desionizada suplementada con cualquier ADN deseado u otros reactivos.
    6. Siga la dinámica de fluorescencia en un lector de placas.

NOTA 1: Las células de autolisado están diseñadas para lisarse en un ciclo de congelación-descongelación, por lo que es particularmente importante usar crioprotector al hacer existencias congeladas. Congelamos las existencias en un 24% en peso/vol de glicerol y las almacenamos a -80 °C.

NOTA 2: Los iones de magnesio y PEG 8000 son críticos para el rendimiento del lisado. La premezcla base 2.5x, basada en datos publicados anteriormente, contiene 6 mM de glutamato de magnesio y 4.8% en peso / vol PEG 8000, que se convierten en 2.4 mM y 1.9%, respectivamente, en la reacción final. El autolizado preparado con el protocolo aquí generalmente funciona mejor con un Mg-glutamato adicional de 5 mM y 1.5% PEG 8000 en la reacción final. Sin embargo, esto se puede optimizar en el rango de un glutamato adicional de 0-10 mM Mg y un 0-3% adicional de PEG 8000 (en comparación con la premezcla base). Para preparar la premezcla con los 5 mM Mg-glutamato adicionales recomendados y 1,5% PEG 8000 (concentraciones finales), mezcle 380 μL de premezcla con 4,75 μL de glutamato de magnesio a 1 M y 36,1 μL de PEG 8000 al 40% de peso/volumen.

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Resultados

Los resultados representativos se pueden observar mediante el uso de autolisado para expresar GFP a partir de un plásmido que expresa constitutivamente, aquí pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, y registrando un curso de tiempo de fluorescencia de GFP en un lector de placas (Figura 1B). Una serie de dilución de ADN plásmido encontró una fuerte expresión incluso a 1 nM de ADN. En comparación con un lisado disponible comercialmente, el autolisato puede producir un mayor rendimiento total y lograr...

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Discusión

El protocolo descrito aquí produce lisado bacteriano altamente activo para la expresión génica libre de células. La clave es utilizar células portadoras del plásmido pAD-LyseR, que expresa el fago lambda endolisina citosólicamente. Estas células se potencian para lisarse a sí mismas tras la permeabilización de la membrana interna, permitiendo el acceso de la endolisina a la pared celular, lo que el método logra a través de un simple ciclo de congelación-descongelación. Debido a que las células se lisan efectivamente, el ...

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Divulgaciones

J.H. es cofundador de GenCirq Inc, que se centra en la terapéutica del cáncer. Está en el Consejo de Administración y tiene participación en GenCirq.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Zachary Sun y Richard Murray (Instituto de Tecnología de California) por proporcionar amablemente el plásmido P_araBAD-gamS, y a Kaeko Kamei (Instituto de Tecnología de Kyoto) por proporcionar amablemente una centrífuga de enfriamiento de alta velocidad. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y del programa ARO MURI y fue apoyado en parte por la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes, MEXT, Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2xYT mediosEMD Millipore4.85008o equivalente
3-PGASigma AldrichP8877o unidad de
filtro centrífugo Amicon Ultra-15 equivalente, corte de 3 kDaMillipore SigmaUFC900308opcional, se puede utilizar para concentrar lisado, seleccione la capacidad del concentrador adecuada para el volumen a concentrar
ampicilinaSigma AldrichA0166-5Go carbenicilina, una variante más estable
ATPSigma AldrichA8937o
equivalente cAMPSigma AldrichA9501o equivalente
CoASigma AldrichC4282o equivalente
CTPUnited States Biosciences14121o
equivalente D-glucosa (dextrosa)Fisher ScientificAAA1749603o equivalente
ditiotreitol (DTT)Sigma AldrichD0632-1Go
E. coli equivalente BL21-Gold (DE3) portador de pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) y Delta; lacZ portador de pAD-LyseRAddgene99245
Ácido folínicoSigma AldrichF7878o equivalente
GTPUnited States Biosciences16800o equivalente
HEPESSigma AldrichH3375-25Go medios LB equivalentes
Fisher Scientific DF0446075o
glutamatode magnesio equivalenteSigma Aldrich49605-250Go equivalente
NADSigma AldrichN6522o
equivalente glutamato de potasioSigma AldrichG1501-100Go equivalente
hidróxido de potasio (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gpara ajustar el pH
fosfato de potasio dibásicoFisher ScientificBP363-500o equivalente
fosfato de potasio monobásicoFisher ScientificBP362-500o equivalente
EspermidinaSigma Aldrich85558o equivalente
Tris-HClFisher Scientific9310500GMo mezcla de
ARNtRoche10109541001o equivalente
UTPUnited States Biosciences23160o equivalente
, , , equivalente

Referencias

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