Microscopía de fluorescencia para internalización de ATP mediada por macropinocitosis en células tumorales humanas y ratones xenoinjertados con tumores

Corinne M. Nielsen; Yanrong Qian; Subhodip Adhicary; Yunsheng Li; Pratik Shriwas; Xuan Wang; Lindsey Bachmann; Xiaozhuo Chen

doi:10.3791/62768

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Artículo de método

Microscopía de fluorescencia para internalización de ATP mediada por macropinocitosis en células tumorales humanas y ratones xenoinjertados con tumores

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DOI:

10.3791/62768

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30 de junio de 2021

Corinne M. Nielsen^*¹^,²^,³ , Yanrong Qian^*⁴ , Subhodip Adhicary¹^,⁵ , Yunsheng Li⁴ , Pratik Shriwas¹^,²^,⁴ , Xuan Wang¹^,²^,⁴ , Lindsey Bachmann⁶ , Xiaozhuo Chen¹^,²^,⁴^,⁷

¹Department of Biological Sciences, Ohio University, ²Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, ³Neuroscience Program, Ohio University, ⁴Edison Biotechnology Institute, Ohio University, ⁵Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, ⁶Honors Tutorial College, Ohio University, ⁷Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Desarrollamos un método reproducible para visualizar la internalización del trifosfato de adenosina fluorescente no hidrolizable (ATP), un sustituto de ATP, con alta resolución celular. Validamos nuestro método utilizando ensayos independientes in vitro e in vivo: líneas celulares tumorales humanas y ratones inmunodeficientes xenoinjertados con tejido tumoral humano.

Resumen

Se ha demostrado que el trifosfato de adenosina (ATP), incluido el ATP extracelular (eATP), desempeña un papel importante en varios aspectos de la tumorigénesis, como la resistencia a los medicamentos, la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y la metástasis. La eATP intratumoral es de 10^{a 3} a 10⁴ veces mayor en concentración que en los tejidos normales. Si bien eATP funciona como un mensajero para activar la señalización purinérgica para la inducción de EMT, también es internalizado por las células cancerosas a través de la macropinocitosis regulada al alza, un tipo específico de endocitosis, para realizar una amplia variedad de funciones biológicas. Estas funciones incluyen proporcionar energía a las reacciones bioquímicas que requieren ATP, donar grupos fosfato durante la transducción de señales y facilitar o acelerar la expresión génica como cofactor transcripcional. El ATP está fácilmente disponible, y su estudio en el cáncer y otros campos sin duda aumentará. Sin embargo, el estudio eATP se encuentra en una etapa temprana, y las preguntas no resueltas siguen sin respuesta antes de que las actividades importantes y versátiles desempeñadas por eATP y ATP intracelular internalizado puedan desentrañarse por completo.

Las contribuciones de los laboratorios de estos autores a estos primeros estudios de eATP incluyen imágenes microscópicas de ATP fluorescente no hidrolizable, junto con dextrans fluorescentes de alto y bajo peso molecular, que sirven como trazadores de macropinocitosis y endocitosis, así como varios inhibidores de endocitosis, para monitorear y caracterizar el proceso de internalización de eATP. Esta modalidad de imagen se aplicó a líneas celulares tumorales y a ratones inmunodeficientes, xenoinjertados con tumores de cáncer humano, para estudiar la internalización de eATP in vitro e in vivo. Este artículo describe estos protocolos in vitro e in vivo, con énfasis en la modificación y el ajuste fino de las condiciones del ensayo para que los ensayos de internalización eATP mediados por macropinocitosis / endocitosis se puedan realizar con éxito en diferentes sistemas.

Introducción

La absorción oportunista de nutrientes extracelulares intratumorales (es decir) ha sido nombrada recientemente un sello distintivo clave para el metabolismo del cáncer¹. Uno de estos nutrientes importantes es el ATP, ya que la concentración de ieATP es 10³ y 10⁴ veces mayor que la que se encuentra en los tejidos normales, en el rango de varios cientos de μM a mM bajo^2,^3,^4,^5. Como molécula clave de energía y señalización, el ATP juega un papel central en el metabolismo celular en células cancerosa....