Este documento proporciona un protocolo detallado para preparar rejillas de muestra a temperaturas de hasta 70 ° C, antes de la congelación por inmersión para experimentos crio-EM.
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Artículo de método
Preparación de rejillas de muestra de alta temperatura para crio-EM
En este artículo
Resumen
Resumen
Las rejillas de muestreo para experimentos de criomicroscopía electrónica (crio-EM) se preparan generalmente a una temperatura óptima para el almacenamiento de muestras biológicas, principalmente a 4 °C y ocasionalmente a temperatura ambiente. Recientemente, descubrimos que la estructura de proteínas resuelta a baja temperatura puede no ser funcionalmente relevante, particularmente para proteínas de arqueas termófilas. Se desarrolló un procedimiento para preparar muestras de proteínas a temperaturas más altas (hasta 70 °C) para el análisis crio-EM. Demostramos que las estructuras de muestras preparadas a temperaturas más altas son funcionalmente relevantes y dependientes de la temperatura. Aquí describimos un protocolo detallado para preparar rejillas de muestra a alta temperatura, utilizando 55 ° C como ejemplo. El experimento utilizó un aparato de vitrificación modificado con un tubo centrífugo adicional, y las muestras se incubaron a 55 °C. Los procedimientos detallados se ajustaron para minimizar la condensación de vapor y obtener una fina capa de hielo en la rejilla. Se proporcionan ejemplos de experimentos exitosos y no exitosos.
Introducción
La tecnología crio-EM para resolver las estructuras de complejos proteicos ha continuado mejorando, particularmente en la dirección de la obtención de estructuras de alta resolución 1,2. Mientras tanto, el panorama de su aplicación también se ha ampliado variando las condiciones de la muestra, como el pH o los ligandos, antes del proceso de vitrificación3, que implica la preparación de rejillas de muestra seguidas de congelación por inmersión 4,5. Otra condición importante es la temperatura. Aunque los experimentos crio-EM, como....
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Protocolo
NOTA: Este protocolo tiene como objetivo utilizar un aparato de vitrificación comercial modificado para preparar las muestras de criomicroscopía electrónica (crio-EM) a temperaturas específicas, especialmente superiores a 37 °C. La configuración experimental general se muestra en la Figura 1. El protocolo utiliza 55 °C como ejemplo. Para las condiciones específicas a otras temperaturas, véase el cuadro complementario 2 en la referencia12.
1. Preparación del aparato de vitrificación
- Haga un orificio de 1 cm en un tubo de centrífuga de 50 ml en su extremo cerrado.
- Colo....
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Resultados
La descripción general de bajo aumento se muestra en la Figura 5A,B. El panel A es un ejemplo de una cuadrícula exitosa. Hay un gradiente de hielo desde la parte superior izquierda (más gruesa) hasta la parte inferior derecha (más delgada o vacía). Dicha cuadrícula hace que sea más fácil encontrar un espesor apropiado de la capa de hielo en el área media adecuada para la recopilación de datos, como las cajas azul y verde. La rejilla B está demasiado seca. Los cuadrados en la.......
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Discusión
En el paso 1 del protocolo, asegúrese de que el tubo de centrífuga se haya instalado bien y no se caiga cuando el experimento esté en curso. Debido a la acumulación de una gran cantidad de gotas de agua en la cámara, lo que podría cambiar la capacidad de adsorción del papel de filtro, se recomienda que el tiempo total del experimento no exceda los 30 minutos después de que la cámara del aparato de vitrificación haya alcanzado la temperatura de equilibrio. Si el tiempo de operación excede los 30 minutos, el operador debe .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Hervé Remigy de Thermo Fisher Scientific sus útiles consejos. Los experimentos crio-EM se realizaron en la Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM cuenta con el apoyo de la Academia Sínica (Subvención No. AS-CFII-108-110) y Taiwan Protein Project (subvención No. AS-KPQ-109-TPP2). Los autores también agradecen a la Sra. Hui-Ju Huang por la ayuda con la preparación de la muestra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo | Falcon | Falcon 352070 | tamaño: 50 mL |
| Papel de filtro | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20 mm, grado 595 |
| HI1210 | Baño de agua | Leica | |
| K100X | Microscopía electrónica Ciencias de | descarga incandescente | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Rejilla de Cu | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | imágenes de baja dosis |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Pinza Vitrobot | Ted Pella | 47000-500 |
Referencias
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al.
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Reimpresiones y permisos
