Aislamiento de núcleos y microscopía de iluminación estructurada de superresolución para examinar las alteraciones de las nucleoporinas en la neurodegeneración humana

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo optimizado para el aislamiento de núcleos y la microscopía de iluminación estructurada de superresolución para evaluar nucleoporinas individuales dentro del nucleoplasma y NPC en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas y tejidos humanos postmortem.

Resumen

El complejo de poros nucleares (NPC) es una estructura macromolecular compleja compuesta por múltiples copias de ~ 30 proteínas nucleoporinas (Nups) diferentes. En conjunto, estas Nups funcionan para regular la organización del genoma, la expresión génica y el transporte nucleocitoplasmático (NCT). Recientemente, se han identificado defectos en la NCT y alteraciones en Nups específicos como patologías tempranas y destacadas en múltiples enfermedades neurodegenerativas, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), la Enfermedad de Alzheimer (EA)/Demencia Frontotemporal (DFT) y la Enfermedad de Huntington (EH). Los avances en microscopía óptica y electrónica permiten un examen exhaustivo de las estructuras subcelulares, incluida la NPC y sus constituyentes Nup, con mayor precisión y resolución. De las técnicas comúnmente utilizadas, la microscopía de iluminación estructurada (SIM) de superresolución ofrece una oportunidad sin precedentes para estudiar la localización y expresión de Nups individuales utilizando estrategias convencionales de etiquetado basadas en anticuerpos. El aislamiento de los núcleos antes de la SIM permite la visualización de las proteínas Nup individuales dentro de la NPC y el nucleoplasma en un espacio 3D reconstruido de forma completa y precisa. Este protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de núcleos y SIM para evaluar la expresión y distribución de Nup en células del SNC humanas derivadas de iPSC y tejidos postmortem.

Introducción

La prevalencia de enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad está aumentando a medida que la población envejece¹. Si bien los fundamentos genéticos y las características patológicas están bien caracterizados, los eventos moleculares precisos que conducen a la lesión neuronal siguen siendo poco conocidos^{2,3,4,5,6,7,8,9,}

Protocolo

Todas las muestras de sangre para la generación de iPSC y las colecciones de tejido con autopsia están aprobadas por el IRB de Johns Hopkins con la supervisión ética de Johns Hopkins. Toda la información del paciente cumple con HIPPA. El siguiente protocolo se adhiere a todos los procedimientos de bioseguridad de Johns Hopkins.

1. Preparación de portaobjetos para inmunotinción e imagen

1. Coloque un portaobjetos de microscopio de vidrio cargado positivamente en un citembudo vacío y dibuje un círculo con un bolígrafo de barrera hidrofóbica para delinear un área para depositar los núcleos.
2. ....

Resultados

Para examinar la distribución y expresión de NPC y nucleoplásmica de POM121 en núcleos neuronales humanos, se diferenciaron las iPSN de control y C9orf72 como se describió anteriormente¹⁵. La corteza motora humana postmortem y las iPSN del día 32 se lisaron y se sometieron a aislamiento de núcleos e inmunotinción como se describió anteriormente. Se obtuvieron imágenes de núcleos aislados positivos de NeuN mediante microscopía de iluminación estructurada de superresolución (SIM) utilizando un micro.......

Discusión

Dada la reciente identificación de los déficits de NCT como un fenómeno temprano y prominente en múltiples enfermedades neurodegenerativas 16,27,28,30,31, existe una necesidad crítica de examinar a fondo el mecanismo por el cual ocurre esta patología. Dado que la NPC y sus proteínas Nup individuales controlan críticamente la N.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos cónicos de 50 mL	Fisher Scientific	14-959-49A
Ultracentrífuga Beckman	Beckman Coulter
Raspadores de células	Sarstedt	83.183
Colágeno	Advanced Biomatrix	5005
cubrecubreobjetos	MatTek	PCS-170-1818
Citoembudo	Thermo Fisher Scientific
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003
Homogeneizadores Dounce DWK	Ciencias de la Vida	357542
TDT	Sigma Aldrich	D0632
Tubos Eppendorf	Fisher Scientific	05-408-129
Cabra Anti-Pollo Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21449
Cabra Anti-Ratón Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11029
Cabra Anti-Ratón Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11031
Cabra Anti-Ratón Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21236
Cabra Anti-Conejo Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034
Cabra Anti-Conejo Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11036
Cabra Anti-Conejo Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21245
Cabra Anti-Rata Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A-11006
Cabra Anti-Rata Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A-11077
Cabra Anti-Rata Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A-21247
Hemacitómetro	Fisher Scientific	267110
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
Vector de suero de cabra normal	Labs	S-1000
Nuclei PURE Prep Kit de aislamiento de núcleos	Sigma Aldrich	NUC201	contiene tampón de lisis, 10% Triton X-100, gradiente de sacarosa de 2 m, solución de cojín de sacarosa y tampón de almacenamiento de núcleos; Referenciado en el protocolo como "kit de aislamiento de núcleos"
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
PFA	Electrónica Microscopy Sciences	15714-S
Prolong Gold Antifade	Invitrogen	P36930	Referenciado en el protocolo como "medio de montaje rígido antidecoloración"
SW 32 Ti Ultracentrífuga Rotor	Beckman Coulter	369694	Referenciado en el protocolo como "rotor ultracentrífugo"
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	15-250-061
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	344058
Anticuerpos primarios			de nucleoporinaLos anticuerpos primarios adecuados para la detección inmunofluorescente de nucleoporinas individuales están disponibles en múltiples compañías

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