Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Samtidig Brightfield, fluorescens, og optisk sammenhæng Tomografisk Imaging af kontraherende Hjerte Trabeculae Ex Vivo

Published: October 2, 2021 doi: 10.3791/62799
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1,2
1Auckland Bioengineering Institute, University of Auckland, 2Department of Engineering Science, University of Auckland

Summary

Denne protokol præsenterer en samling af sarkomere, calcium og makroskopiske geometriske data fra en aktivt ordregivende hjerte trabecula ex vivo. Disse samtidige målinger muliggøres ved integrering af tre billedbehandlingsmetoder.

Abstract

I hjertemusklen aktiverer intracellulære Ca2+ transienter kontraktile myofilaments, hvilket forårsager sammentrækning, makroskopisk afkortning og geometrisk deformation. Vores forståelse af de interne relationer mellem disse begivenheder har været begrænset, fordi vi hverken kan 'se' inde i musklen eller præcist spore spatio-temporal karakter excitation-sammentrækning dynamik. For at løse disse problemer har vi konstrueret en enhed, der kombinerer en række billedbehandlingsmetoder. Specifikt, det integrerer et lysfelt mikroskop til at måle lokale ændringer af sarkomere længde og væv stamme, en fluorescens mikroskop til at visualisere Ca2 + forbigående, og en optisk sammenhæng tomograph at fange vævets geometriske ændringer i hele tiden løbet af en hjertecyklus. Vi præsenterer her billedbehandlingsinfrastrukturen og de tilhørende dataindsamlingsrammer. Data indsamles fra isolerede stanglignende vævsstrukturer kendt som trabeculae carneae. I vores instrument holder et par positionsstyrede platinkroge hver ende af en ex vivo muskelprøve, mens den kontinuerligt superfunderes med næringsrig saltvandsopløsning. Krogene er under uafhængig kontrol, hvilket tillader realtidskontrol af muskellængde og kraft. Oversættelse i længderetningen gør det muligt at scanne prøven i det samme og overvinde de begrænsninger, der er forbundet med mikroskopets billedvindues relative størrelse (540 μm med 540 μm) og længden af en typisk trabecula (>2000 μm). Platinelektroder i hver ende af muskelkammeret stimulerer trabecula ved en brugerdefineret hastighed. Vi udnytter stimuleringssignalet som en udløser til synkronisering af data fra hvert billedvindue til at rekonstruere hele prøvetrækning under konstante tilstandsforhold. Anvendelse af billedbehandlingsteknikker på disse brightfield imaging data giver væv forskydning og sarkomere længde kort. En sådan indsamling af data vil, når den indarbejdes i en eksperimentmodelleringspipeline, give en dybere forståelse af muskelkontraktil homogenitet og heterogenitet i fysiologi og patofysiologi.

Introduction

Superfusion af isolerede hjertemuskelvævspræparater er en standard og udbredt protokol til undersøgelse af hjerteionisk aktivering ogmekanik 1. Især har isoleringen af trabeculae, stanglignende strukturer fra ventrikulære vægge gjort det muligt at vurdere fænomener, herunder den længdeafhængige aktivering af sammentrækning2, strækafhængig reaktion af sammentrækning3,4og diastolisk viskoelasticitet5 af hjertevæv. Ter Keurs, initiativtageren til denne teknik til superfusing isoleret trabeculae, oprindeligt brugt en kombination af fluorescens imaging for Ca2 + målinger og laser diffraktion til bestemmelse af sarkom længder2,5. Siden disse tidlige undersøgelser er det blevet mere og mere almindeligt at udtrække sarkomere længdeoplysninger med en større rumlig opløsning ved hjælp af 2D hurtige Fourier transform (FFT)-baserede teknikker6 på brightfield mikroskopibilleder. De to billeddannelsessystemer gør det muligt delvis at vurdere det underliggende forhold mellem Ca2+-udløsning og sarkomkom-afhængig kraftproduktion.

Hjertemusklen er striated, med den synlige banding forbundet med en underliggende serie af kontraktile enheder bestående af tykke og tykke filamenter. Samspillet mellem disse bestanddele filamenter, der udgør sarkomenter ligger til grund kraft generation, som begynder som følger: en depolarizing elektrisk signal, eller virkning potentiale, forårsager spænding-afhængige L-type Ca2 + kanaler i cellemembranen til at åbne; den efterfølgende cellulære tilstrømning af Ca2+ fremkalder frigivelsen af Ca2+ fra sarcoplasmic reticulum (SR), en intracellulær Ca2+ butik, i en proces, der kaldes Ca2+-induceret Ca2+ release7; denne pludselige stigning i intracellulær Ca2+-koncentration fra nanomolar til mikromolar-sortiment gør det muligt at producere kraft Ca2+ pumper ekstruderer kontinuerligt Ca2+ ud af cytosolen tilbage i SR og ekstracellulært rum; når den intracellulære Ca2 + koncentration vender tilbage til nanomolar rækkevidde, kraftproduktion ophører, og musklen slapper af. Under kraftproduktion glider komponenten tykke og tynde filamenter over hinanden. Sarkomlængden dikterer det relative omfang af overlapning og dermed potentialet for kraftproduktion af musklen makroskopisk.

I dette papir udvider vi disse fluorescens-brightfield imaging teknikker til at omfatte optisk sammenhæng tomografi (OCT). OCT udnytter det fysiske princip om interferens og er i stand til at samle den geometriske deformation af væv for at forstå muskelkontraktil heterogenitet8. Vores enhed (Figur 1) bruger et Spektraldomæne OCT (SD-OCT) system. I SD-OCT opdeler en stråledeler lyset fra et kortbåndslængde superluminescerende diode i reference- og målearme. Referencearmen indeholder et fast spejl, og målearmen indeholder et 2D-galvanometer til at styre lyset. Lys, der sprøjtes ud af prøven, indsamles og forstyrrer det reflekterede lys i referencearmen for at danne et interferensmønster. Dybdeinformationen er kodet i frekvensen af spektral frynserne. For at udtrække oplysningerne sendes signalet gennem et spektrometer, og der påføres en omvendt FFT på resultatet. Det tilsvarende 1D-signal repræsenterer strukturerne på forskellige dybder, svarende til ændringer i brydningsindeks9 (A-scanning). Ved at styre laseren i en enkelt akse, kan man konstruere et tværsnit af stikprøven af interesse (B-scanning), og på samme måde, ved at gentage processen i et trin-klog mønster i den resterende akse, en tre-dimensionel billede kan genereres (C-scanning). I forlængelse heraf kan man indsamle en række B-scanninger på et enkelt udsnit for en gentaget tids-varierende emne baseret på en ekstern udløser og gentag for at generere en tre-dimensionel scanning, der repræsenterer en tids-varierende planar billede10.

Ved integrationen af de tre billeddannelsessystemer har vi overvejet følgende to principper. For det første bør billedsensorer ikke registrere lys fra en alternativ billedbehandlingsmodalitet, og for det andet bør det fysiske design indeholde ledig plads til mindst tre samtidige billedplaner. For at imødekomme det første krav bruger brightfield-mikroskopet en 660 nm bølgelængde-LED til at belyse prøven i en omvendt konfiguration. Fluorescensmikroskopet er i en epifluorescenskonfiguration, hvor den samme objektive linse anvendes til både excitation og indsamling af det udsendte lys. Excitationslyset har en bølgelængde på mellem 340 nm og 380 nm, og et fotomultiplierrør (PMT) måler det udsendte lys ved en bølgelængde på 510 nm. Et par dichroic spejle gør det muligt for disse to optiske stier til at dele den samme fysiske fodaftryk uden at forstyrre den modsatte måling (Figur 2). Endelig anvender OLT bredbåndslys (100 nm spektral bredde) med en central bølgelængde på 840 nm, der adskiller sig fra de to andre modaliteter. På grund af lysets lave sammenhæng vil alt spredt lys fra lysfelt-fluorescenskilderne ikke bidrage til det interferensmønster, der koder dybdeinformation. For det andet krav har boligdesignet til kapillærrøret tilgængelige optiske veje til prøvens forreste, ringere og overlegne planer. Under forsøg holder to platinkroge en trabecula i et kapillærrør perfunderet med iltet Krebs-Henseleit (KH) opløsning. OLT's galvanometerhoved er ortogonalt orienteret mod den lysefield-fluorescensbilleddannelsesvej for at drage fordel af det tredje ortogonale optiske plan (figur 3).

Dette papir skitserer design overvejelser for at opbygge en enhed i stand til samtidig billeddannelse calcium, sarkomere længde, og muskel geometri. For at demonstrere disse måleevner beskriver vi processen med at isolere en ventrikulær trabecula, forberedelsen af de nødvendige bufferopløsninger sammen med de kritiske trin, der er involveret i håndtering og fluorescensbelastning af en ex vivo trabecula. Endelig skitserer dette papir de processer, der kræves for at oversætte datasættet til mere nyttige visualiseringer.

Protocol

University of Aucklands dyreetikkomité godkendte håndtering af rotter og fremstilling af vævsprøver.

1. Billedkalibrering

  1. Kalibrering af Brightfield-mikroskoppixel
    1. Fyld målekammeret med destilleret vand.
    2. Placer en diffraktionsriste med kendte linjer pr. μm i målekammeret.
    3. Tryk på F1 for at aktivere optagelsen, og juster billedhastigheden [Hz], indtil diffraktionsristet er tydeligt synligt (Figur 4A). Sørg for, at diffraktionsristet løber parallelt med rammens kant. Tryk på F1 igen for at stoppe optagelsen.
    4. Angiv det samlede antal billeder, der skal hentes?
    5. Åbn ImageJ, og importer diffraktionsristebilledet (Fil > Åbn > Vælg kalibreringsbillede). Hold skift, tegne en linje, der omfatter 20 lyse og mørke bånd af diffraktion rist.
    6. Kalibrer billedet (Analyser > Angiv skala). Længden af linjen fra trin 1.1.5 angiver værdien Afstand i pixel. Angiv værdien for Kendt afstand til 20 gange linjerne pr. μm-måling og længdeenheden til μm. Skalaens inverse er antallet af mikrometre, der repræsenteres af en pixel.
  2. Kalibrering af OLT-dybdeopløsning
    1. Mål tykkelsen af et glasmikroskop dias ved hjælp af Vernier calipre.
    2. Tænd for OCT-laserkilden.
    3. Dæk galvanometerhovedet, og klik på Hent BG for at måle baggrundsinterferensmønsteret og trække det fra målingen (Figur 4B).
    4. Fastspænd den målte glasmikroskoprutsjebane (fra trin 1.2.1) i OLT's målearm.
    5. Klik på Live Stream for at få vist OLT-billedet. Juster glasmikroskopets dias, indtil det er synligt i B-scanningen.
    6. Hvis du vil hente B-scanningsbilledet, skal du indstille Område Y (Trin) til et, klikke på Stream B-scan Data?og klikke på Hent.
    7. Importer B-scanningsbilledet til ImageJ (File > Open > Select B-scan). Hold skift, tegne en linje mellem grænserne af glasset mikroskop dias.
    8. Angiv skalaen (Analyser > Angiv skala). Angiv kendt afstand til den måling, der er indsamlet i trin 1.2.1.
    9. Hvis du vil beregne dybdeopløsningen i luften, skal du korrigere for mikroskopdiasets brydningsindeks (nglas = 1,5175)11 ved at gange målingen pr. pixelværdi med nglas.
      BEMÆRK: Det citerede n-glas er til borosilikatglas. Mikroskop dias kan laves af forskellige materialer. Brug det relevante brydningsindeks for det målte dias.
    10. Hvis du vil skalere dybdeopløsningen for myokardie, skal du dividere værdien fra trin 1.2.9. af nmyokardie = 1,38 (værdi rapporteret tidligere12).

2. Forberedelse af muskelprøve

  1. Gør dissektionsriggen klar.
    1. Hæld noget af dissektionsopløsningen (beskrevet i tabel 1)i en lille metalskål og læg den i fryseren ca. en time før hjerteekscision.
    2. Opsæt en dissektionsrig, der sikrer dissektionsopløsning, er iltet (100% ilt) og har skyllet gennem hver af slangelinjerne. Fyld dissektionskammeret med iltet dissektionsopløsning og bind 3/0 suturen løst omkring perfusionskateteret.
  2. Punktafgifter hjertet.
    1. Bedøve 8-10 uger gamle Wistar rotte ved hjælp af gasformige isoflurane (< 5% i ilt). Bekræft anæstesi ved hale klemme.
    2. Bedøvet rotte anbringes i liggende stilling, og der injiceres subkutant i abdominalområdet med heparinopløsning (1000 IE/kg). Opretholde anæstesi i fem minutter mere for at tillade heparin at cirkulere.
    3. Hent metalskålen med dissektionsopløsning fra fryseren, og læg den i nærheden af aflivningsbænken.
      BEMÆRK: Undgå at fryse dissektionsopløsningen helt for at muliggøre fuldstændig nedsænkning af det dissekerede hjerte.
    4. Overfør den bedøvede rotte til aflivningsbænken og aflives ved livmoderhalskræft dislokation.
    5. Åbn rottekisten med en saks, skær først kropsvæggen langs undersiden af brystkassen, derefter mellemgulvet, før du fortsætter langs brystkassens laterale grænser. Løft brystet af vejen.
    6. Grib hjertet med den ene hånd, mens den anden hånd bruger en buet saks til at skære forbindelseskarrene (aorta, vena cava osv.).
    7. Hurtigt nedsænke hjertet i den kolde dissektion løsning.
  3. Isoler en trabecula.
    1. Identificer aorta, mens hjertet er i metalskålen, og overfør derefter hjertet til dissektionskammeret. Brug to buede pincet, træk aorta over perfusionsbeholderen.
    2. Hold aorta på plads med en tang. I mellemtiden skal du åbne slangelinjen for at lade dissektionsopløsningen strømme gennem perfusionsbeholderen.
      BEMÆRK: Tilstræbe at fuldføre perfusion inden for minut efter hjertet excision.
    3. Når koronarvakulturen er renset for blod, og hjertet er helt perfunderet med dissektionsopløsningen, skal du stoppe perfusionsstrømmen og sikre aortaen på plads ved hjælp af suturen. Tænd for strømmen igen, og perfuse det cannulated hjerte.
    4. Roter kanylen, så den venstre kranspulsåre er synlig på den overlegne overflade. Fastgør hjertets spids til bunden af dissektionskammeret (Figur 5A). Afskåret både atria(figur 5B).
    5. Med et sæt fjedersaks skæres langs højre side af septum til hjertets spids (som angivet på figur 5B). Fastgør den åbnede venstre hjertekammer til bunden af dissektionskammeret. Skær derefter langs venstre side af septum, åbn højre ventrikel, og pin det til bunden af dissektion kammer, også(Figur 5C).
      BEMÆRK: For at fastgøre hjertekamrene i en åben position, skal nogle papillære muskler skæres. Identificer en fritløbende trabecula i højre hjertekammer (Figur 5D-E).
    6. Brug fjedersaksen og en tang, skær vægvævet omkring trabecula, og skær derefter vægvævet i halvt ortogonalt til retningen af trabecula. Trim vægvævet, indtil dets dimension er passende for den anvendte monteringskonfiguration. I dette tilfælde ca. halvdelen af størrelsen af et sesamfrø (Figur 5F).
      BEMÆRK: Trabeculae kan dissekeres fra højre og venstre hjertekamre, men dem fra venstre er typisk mere uklare og mindre anvendelige til sarkom og geometri målinger.
    7. Lad den punkterede trabecula stå i dissektionskammeret, og superfusing kontinuerligt med dissektionsopløsningen.

3. Eksperimentel protokol

BEMÆRK: Den enhed13, der blev brugt til dette eksperiment, blev bygget internt og bruger brugerdefineret kontrolkode. De nødvendige overvejelser for udformningen af en enhed, der er bygget til at replikere disse data, er to uafhængigt aktiverede monteringskroge, et målekammer med tre optisk klare akser (Figur 3) og en ekstern udløserlinje, der synkroniserer brightfield- og OCT-kameraerne med stimulatoren. PMT spænding og kraft signal blev indsamlet ved hjælp af analoge DAQ-kort, billederne fra OCT og brightfield mikroskop blev indsamlet ved hjælp af Camera Link frame-grabber kort, og stimulus-signalet blev indsamlet ved hjælp af et digitalt I / O-kort. Data blev gemt offline ved hjælp af et sæt producentforbrugersløjfer for at opretholde tidsmæssig tilpasning.

  1. Gør kardiomyometeret klar.
    1. Skyl varmt (~60 °C) vand, destilleret vand (stuetemperatur), og derefter superfusate opløsning gennem målekammeret. Bobler kontinuerligt den superfusate opløsning med carbogen.
    2. Tænd lysfeltets mikroskopbelysningskilde, og tryk på F1 for at aktivere indfangning (Figur 4A). Juster manuelt den nedstrømskrog, indtil den er centreret i brightfield-billedet. Klik på Nul downstream-akse, derefter Downstream deaktiveret for at aktivere motoren (Figur 4C). Flyt skyderen DS Setpoint [um] indtil slutningen af krogen flugter med kanten af det standardområde, der er af interesse.
      1. Nulstil downstream-aksen igen, og flyt derefter skyderen DS Setpoint [um] til 1000. Gentag processen med upstream-krogen, men flyt ikke skyderen US Setpoint [um].
    3. Klik på Flyt til tilslutning (Figur 4C).
    4. Start lysstofbelysningssystemet ved at skifte lampekontakten, før du hurtigt tænder for controllerundersystemerne ved at skifte hovedkontakten.
      BEMÆRK: Nogle UV-lyskilder producerer store mængder ozon. Hvis dette er tilfældet, skal du tilslutte en ozonudsugning til lyskildens udgangsventil og sikre, at den kører, inden lysstofbelysningskilden tændes.
    5. Skift driftstilstand til Turbo-Blanking ved at trykke på knappen Tilstand på frontpanelet efterfulgt af 2og derefter 1. Tryk på knappen On-line for at give kontrolkoden mulighed for at informere om driften.
  2. Monter trabeculaen.
    1. Sæt superfusate flow gennem målekammeret. Fyld monteringskammeret med dissektionsopløsningen.
    2. Ved hjælp af en 1 mL sprøjte transporteres trabecula fra dissektionskammeret til monteringskammeret (Figur 5G).
    3. For at overføre trabecula skal sprøjten placeres lodret og i kontakt med overfladen af monteringskammeropløsningen. Lad trabeculaen falde ned i monteringskammeret via tyngdekraften (Figur 5H).
    4. Sænk væskeniveauet i monteringskammeret, så det er i niveau med midten af krogene.
    5. Juster afstanden mellem krogene for at afspejle trabeculas slæklængde ved at flytte DS Setpoint [um] skyderen.
    6. Ved hjælp af et mikroskop til at støtte visualisering, let greb et af stykkerne af endevæv med pincet og montere den på opstrøms krog. Det andet stykke endevæv monteres på krogen neden for floden (Figur 5I).
    7. Når trabeculaen er monteret sikkert, skal du flytte den tilbage i målekammeret (Figur 5J) ved at trykke på Flyt til kammer ( Figur4C). Genoptag superfusate flow og væskeudsugning.
    8. Indstil stimulusfrekvensen [Hz] til 1, stimulusvarigheden [ms] til 10 og stimulusspændingen til 10. Start stimulering ved at trykke på Stimulus On?.
  3. Gør trabeculaen klar.
    1. Efter ca. 1 time akklimatisering skal stimulusspændingen og stimulusvarigheden gradvist reduceres i henholdsvis 1 V og 1 ms trin. Et typisk sæt værdier er 3 V og 3 ms.
    2. Tænd for lysfeltbelysningssystemet. Tryk på F1, og vælg et interesseområde, der omslutter et overstøvret område på brugergrænsefladen. Klik på Compute SL? for at beregne den gennemsnitlige sarkomlængde i det fremhævede område. Forøg muskellængden, indtil den gennemsnitlige sarkomlængde er 2,32 μm ved at øge pauseskyderen .eks.
      BEMÆRK: Compute SL? bruger en 2D FFT, der er beskrevet i trin 4.3. Den interesseregion, der anvendes til at beregne den gennemsnitlige sarkomlængde, er typisk en kvadratisk længde på 100 μm til 150 μm. Derfor, som musklen nærmer sig optimal sarkom længde, 43 til 65 sarkomere bruges til at beregne den gennemsnitlige sarkom længde.
    3. Flyt musklen ved at justere centersætpunktet på fanen "Center- og adskillelseskontrol (Figur 4C), så kanten af den nedstrømskrog er lige synlig i det lysefeltsbillede. Indsaml fluorescensoplysningerne for ti ryk.
    4. Forøg center setpoint [um] værdi med 200 og indsamle yderligere ti ryk værd af fluorescens oplysninger. Gentag denne proces, indtil brightfield-billedet indeholder upstream-krogen. Indsaml det sidste vindues fluorescensoplysninger.
    5. Sæt trabecula tilbage til en central placering ved at indstille centersætpunktets værdi til 0.
    6. Reducer stimulusfrekvensen til 0,2 Hz, og skift fra KH-superfusatet til Fura-2-lasteopløsningen (beskrevet i tabel 1).
    7. Mål lysstofsignalet hvert 10. minut ved at klikke på Aktivér fluorescenskilde under fanen Stim og data. Visualiser fluorescenssignalet under fanen YDELSE-signal.
    8. Efter at 360 nm-signalet er steget med en faktor på 10, eller varigheden af belastningsproceduren er overskredet 2 timer, returneres stimulusfrekvensen til 1 Hz og skiftes tilbage til KH superfusate-opløsningen.
    9. Kontroller forholdsmålingen hvert 10. minut, indtil forholdsmålingen stabiliseres, hvorefter dataindsamlingen kan begynde.
  4. Indsamle data om lysfelt- og fluorescensbilleddannelse.
    1. Returner musklen til den position, hvor kanten af downstream krogen er lige til stede i brightfield billedet. Begynd at streame hardwaredata ved at klikke på Stream Data til Disk under fanen Stim og Data i brugergrænsefladen til hardwarestyring. Hent fluorescensoplysninger ved at klikke på Aktivér fluorescenskilde.
    2. På brugergrænsefladen til brightfield imaging skal du indstille hentningstilstanden til en ekstern udløser, øge billedhastigheden til 100 Hz og indstille antallet af billeder, der skal hentes, til 100. Tryk på Ctrl + Skift + S efterfulgt af F1 for at registrere brightfield-billeddataene for dette vindue.
    3. Forøg værdien for Midtersætpunkt [um] med 200, og gentag trin 3.4.2. Fortsæt med scanningsprotokollen, indtil billeddataene er indsamlet for det sidste vindue fra trin 3.3.4.
    4. Sæt trabecula tilbage til en central placering ved at indstille centersætpunktets værdi til 0.
  5. Indsaml OLT-billeddata.
    1. Tænd for OCT-laserkilden ved at dreje hovednøglen til | symbolet, trykke på tænd/sluk-knappen efterfulgt af sld-knappen.
    2. Dæk galvanometerhovedet, og klik på Hent BG for at måle baggrundsinterferensmønsteret og trække det fra målingen (Figur 4B).
    3. Indstil billedoptagelsestilstanden til livevisning.
    4. Juster y-positionen, indtil B-scanningsbilledet kun indeholder upstream-krogen. Divider muskellængden på kontrolpanelet (Figur 4B) med to, og træk den aktuelle y-positionfra. Angiv denne værdi i inputtet"y-offset". Juster værdien "x-offset", indtil tværsnit af trabeculaen er centreret i rammen.
    5. Med trabecula centreret, scanne langs y-aksenved at justere y-positionfor at finde de positioner, der svarer til opstrøms og nedstrøms kroge. Bemærk disse positioner ned. Angiv område Y (trin) til den absolutte forskel mellem disse værdier divideret med ti.
    6. Angiv billedoptagelsestilstanden til Stimulus udløst?, Område X (trin) til 100, og klik på knappen Angiv aktive parametre.
    7. Klik på Stream B-Scan Data?, og hentderefter .
      BEMÆRK: Den indhegnede billedprotokol kræver 200 ryk for at fange hele muskelgeometrien for en prøve 2 mm i længden, hvilket svarer til en indfangningstid på ~ 3 min 20 s.

4. Behandl datasættet til brightfield-billeder

  1. Forbered billederne til analyse.
    1. Importer billeder til ImageJ (Importer > > billedsekvens > Vælg billede).
    2. Forøg billedkontrast (Billede > Juster > lysstyrke/kontrast > Flyt minimum- og maksimumskydekontroller for at centralisere billedets histogram).
    3. Gør billederne skarpere(Filtre > > Uskarp maske > indstille Radius (Sigma) til 1,0 pixel og maskevægt (0,1-0,9) til 0,6).
    4. Eksporter billedsekvensen (Gem som > billedsekvens > Angiv formatet til PNG, Start ved 0 og Cifre (1-8) til 4).
  2. Sy billederne, mål den lokaliserede forskydning, og beregn de lokale sarkomlængder.
    1. Åbn "TrabeculaProcessing.m" (kan rekvireres), og indstil Variablen FolderPath til den hovedmappe, der indeholder alle dataene, og ImagePath til den mappe, hvor billedsekvensen fra trin 4.1.4 blev gemt. Angiv sektioner til antallet af billedvinduer og rammer til det antal rammer, der hentes pr. vindue.
    2. Kør koden.
      BEMÆRK: Outputtene findes i den sti til outputmappen, der er angivet af brugeren. Stien er som standard angivet til FolderPath/Output.
  3. FFT sarkom længde teknik
    1. Brug billedbehandlingssoftware til at udføre en FFT på en region af billedet, hvor sarkomenter er meget synlige.
    2. Multiplicer pixel pr. μm kalibreringsresultater fra trin 1.1.6 med 1,6 μm og 3,0 μm, før du beregner det inverse for at få området med rumlige frekvenser af interesse.
    3. Tilpas en eksponentiel til FFT-resultatet, og ignorer frekvensoplysningerne i det frekvensområde, der er beregnet i trin 4.3.2, og træk dem fra transformeringsresultatet for at fjerne DC-termen.
    4. Sæt en gaussisk kurve på frekvensbåndet af interesse.
    5. Beregn det modsatte af toppen af den gaussiske kurve. Dette er den gennemsnitlige sarkomlængde for den region, der er af interesse.
      BEMÆRK: FFT-beregningen og monteringen af de eksponentielle og gaussiske ligninger blev udført ved hjælp af brugerdefineret LabVIEW-kode.

5. Behandle fluorescensdataene

  1. Træk den vinduesafhængige autofluorescens fra det respektive vindue, og beregn kvotienten af de signaler, der er forbundet med bølgelængderne 340 nm og 380 nm.

6. Behandl OLT-billeddata

  1. Forbered OLT-billedsættet til segmentering.
    1. Åbn ImageJ, og importer billederne (File > Import > Image Sequence). I stifindervinduet åbnes dette, finder billederne, markerer et og klikker på Åbn.
      BEMÆRK: Hvis kontrolkoden for OLT ikke gemmer billederne i et format, der kan læses af ImageJ, skal du konvertere dem til PNG.
    2. Du kan lette visualiseringen ved at organisere billedsekvensen i en hyperstack (Image > Hyperstacks > Stack to Hyperstack). I den dialogboks, der åbnes, skal du indstille antallet af udsnit til antallet af B-scanninger pr. skive og X til antallet af skiver langs længden af trabecula.
    3. Tegn et rektangel, der omslutter trabecula. Bekræft, at den omslutter hele lydstyrken til tiden ved hjælp af skyderne i hyperstackvinduet. Beskær billedet til vinduet (Billede > Beskær).
    4. Fjern skiver, der indeholder billeder af monteringskrogene (Stakke > Værktøjer > Slice Keeper). Vælg det udsnitsområde, der kun indeholder trabecula-oplysninger.
  2. Træn WEKA segmentering.
    1. Åben WEKA segmentering (Plugins > Segmentering > Trainable Weka Segmentering).
    2. Angiv markeringstilstanden til Frihånd.
    3. Klik på Indstillinger, og juster klassificerings- og kursusindstillingerne. (Til denne model blev følgende træningsfunktioner brugt: Gaussisk sløring, Sobel-filter, Hessian, Forskel på gaussere, membranprojektioner, Bilateral og Lipschitz. Membrantykkelse blev sat til 1, Membran patch størrelse til 8, Minimum sigma til 1, og Maksimal sigma til 32. Klassificeringen blev indstillet til FastRandomForest, og klassificeringsindstillingerne blev angivet til: batchSize 100, maxDepth til 32, numFeatures til 32, antaltelæsninger til 0 og antaltræer til 200.)
    4. Segmenter billeder manuelt, indtil træningen resulterer i tilfredsstillende segmenteringer.
    5. Gem klassificeringen.
  3. Segmenter de behandlede B-scanninger
    1. Start WEKA segmentering efter trin 6.2.1.
    2. Indlæs klassificeringen fra trin 6.2.5.
    3. Klik på Opret resultat.
    4. Konverter billederne til 8-bit(billede > skriv > 8-bit).
    5. Konverter billederne til binære (Process > Binary > Make Binary > Default method og standardbaggrund).
    6. Gem som billedsekvens (PNG).
  4. Beregn den gennemsnitlige CSA i de segmenterede B-scanningsbilleder.
    1. Tæl antallet af hvide pixel i et binært B-scanningsbillede.
    2. Multiplicer pixelområdet med den kalibrerede dybdeopløsning (fra trin 1.2) og 10 μm (afstanden mellem de nærliggende A-scanninger).
    3. Gentag for alle B-scanninger mellem krogene og gennemsnittet af målingerne.
  5. Konverter segmenteret billede til en maske.
    1. Åbn "OCTmain.m" (kan rekvireres), og indstil imageDirectory til den mappe, der indeholder outputtet fra trin 6.3.6. Angiv OutputPath efter behov.
    2. Angiv udsnit til værdien "Område Y (trin)" (trin 3.5.5) og rammer til værdien "Gentag X" (trin 3.5.6), z_dim dybdeopløsningen (trin 1.2.10) og x_dim &y_dim til den værdi, der er tildelt 10.
    3. Klik på Kør.

Representative Results

For at fange de regionale Ca2 + og brightfield oplysninger for hele længden af trabecula præsenteret her, syv muskel positioner var påkrævet. Figur 6 antyder, at rykkraften var uforstyrret af dette forslag, hvilket afslørede, at der ikke var nogen positionsafhængighed af den aktive kraftproduktion.

B-scanninger indsamlet ved hjælp af optisk sammenhæng tomografi med en hastighed på 100 Hz blev segmenteret ved hjælp af ImageJ plugin WEKA14 (Figur 7A). Hvert tværsnit synes forvrænget på grund af forskellen mellem lateral (10 μm) og dybde (1,73 μm (i myokardie)) opløsninger. Denne forvrængning blev korrigeret ved at skalere billedets dybdeakse med forholdet mellem sideopløsning og dybde. Figur 7B,C viser, at efter skalering af den rå C-scanning af trabecula er det omtrent cylindrisk i geometri. Refleksionen af målekammervæggen kan undertiden overlappe muskeldataene (Figur 7A, B), men segmenteringssoftwaren kan trænes til at tage højde for dette ( Figur7D,E). Når det er segmenteret, kan tværsnitsarealet langs musklens længde beregnes i hele ryk (Figur 7F). Bemærk, at denne særlige trabecula har et lille vedhæng forgrening fra det. Bevægelsen af filialen er tydelig ~ 0,75 mm langs trabecula. Endelig kan de segmenterede billeder omdannes til masker for at hjælpe med at bygge geometriske modeller (Figur 7G).

Billeddata, der blev indsamlet på hver af de forskellige trabecula-positioner med en hastighed på 100 fps, blev syet sammen for at skabe et enkelt komplet billede af trabecula (Figur 8A). Opløsningen af disse billeder er 0,535 μm/pixel. Brugen af lineære vægtningsfunktioner i de overlappende områder af tilstødende vinduer hjælper med visualisering og minimerer virkningen af vignet, der er til stede i lysfeltbillederne. For at måle lysstofrøret belyses et 540 μm med 540 μm vindue i trabeculaen cyklisk med 340 nm, 365 nm og 380 nm bølgelængdelys med en hastighed på 600 Hz. Forholdet mellem den udledte fluorescens, der er forbundet med 340 nm og 380 nm excitationslys, korrelerer med det intracellulære calcium, efter at trabeculaen er fyldt med Fura-2. Da denne måling er et forhold, er den effektive målehastighed 200 Hz. De gennemsnitlige (n = 10) intracellulære Ca2+ transienter fra hvert vindue er justeret efter det område, de blev afbildet (Figur 8B). Mens toppen af transienterne synes rimeligt konsistent, er den diastoliske [Ca2+] lavere i regionen mellem 900 μm og 1800 μm langs trabecula. På samme måde viser resultaterne af beregningerne af forskydningssporing (figur 8C) og sarkomlængde (figur 8D) også tilstedeværelsen af regionale variabilitet. Den anvendte markørløse sporingsteknik er i stand til at behandle forskydningen af hver pixel, givet nok kontrast. Ved kortlægning af fordelingen af sarkomlængder i stolpe blev der anvendt et krydskorrelationsområde på 128 pixel med 128 pixel (~67 μm med 67 μm) til at beregne den regionale sarkomlængde. Dette område indkapsler ca. 29 sarkomenter, når prøven lukkes, er tæt på optimal sarkomlængde. Trinstørrelsen (i både x- og y-retninger)mellem centroiden af hvert krydskorrelationsvindue blev indstillet til 50 pixel (~26 μm) til behandling af disse data. Egnetheden af sarkomere længde skøn blev testet baseret på bredden og amplituden af gaussiske pasform til FFT signal. Disse betingelser var ikke opfyldt i muskelregionen mellem 0 μm og 500 μm, så der kunne ikke beregnes sarkomlængdeoplysninger der. I betragtning af de tilknyttede forskydninger er det sandsynligt, at sarkomerne i denne region aflange i kontraktilefasen. I overensstemmelse med denne spekulation forkortes de gennemsnitlige sarkomlængder på højre side af trabecula i denne periode. Ved at kombinere oplysningerne fra hvert af panelerne ser det ud til, at regionen med det største tværsnitsareal ikke producerer den mest betydningsfulde kraft. Ud fra den antagelse, at den regionale variation af Ca2+-transienter har en omtrent glat gradient, angiver figur 8B, at den største amplitude Ca2+ forbigående forekommer et sted mellem 1300 μm og 1600 μm langs trabecula. Forskydningskortet angiver, at den region, der gennemgår mindst bevægelse, flugter godt med toppen Ca2+ forbigående. Denne region har dog de mindste tværsnitsområder i stikprøven. Med disse data i tankerne kunne man udlede, at denne region genererede mest stress.

Figure 1
Figur 1: Kommenteret billede af kardiomyometeret. Hver af de vigtigste optiske komponenter er skitseret. Indsat inset indeholder et nærbillede, bagfra, af mikroskopet mål in situ, under målekammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Optisk vej til samtidig mikroskopi og fluorescens. Lyskilden til fluorescensmikroskopet er en Xenon-lysbuelampe, hvis effekt skiftes cyklisk mellem 340 nm, 365 nm og 380 nm lys. Lysbuelampens udgangsbane indeholder et dichroic spejl med en afskæringsbølgelængde på 409 nm, der reflekterer UV-lyset på et spejl, der leder lyset ind i et fluorescensmikroskopmål. Linsen fokuserer excitationslyset på prøven og samler det udsendte lys, som har en længere bølgelængde på 510 nm. Dette udsendte lys passerer gennem det første dichroic spejl, men ikke det andet, da det har en afskåret bølgelængde på 552 nm. Et felt linse derefter fokuserer det reflekterede lys på sensoren af PMT. I mellemtiden er belysningskilden (660 nm LED) for brightfield-mikroskopet placeret over prøven. Det transmitterede lys fokuseres på prøven af en kondensatorlinse, og målet om 20× fluorescens indfanger det resulterende transmissionsbillede. Bølgelængden, der bruges til lysfeltbelysning, overstiger den afskårne bølgelængde for hvert dichroic spejl, så det passerer gennem dem begge, før billedet er fokuseret på sensoren på et CMOS-kamera. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Udformning afmålekammerholderens konstruktion. Lysfeltbelysningen sker fra den overlegne overflade(z-akse); fluorescensbelysningen sker fra den ringere overflade (z-akse), og målearmen OLT-signalet er ortogonalt til den anden belysningsakse ( y-akse). Under forsøget holder to platinkroge en trabecula i et glaskapillærrør, der fungerer som målekammer. Voice-coil motorer styrer hver krog, og deres positioner måles ved hjælp af laserinterferometri. Den aktuelle position sammenlignes med et brugerdefineret sætpunkt, og ved hjælp af en PID-controller, der er kodet i en FPGA, minimeres fejlen. (B) Målekammer på stedet med lysfeltbelysningen tændt. Baggrundsvisningen er vist i figur 1 indsat. (C) Skematisk over det superfusate flow gennem målekammerholderen. Superfusate kommer ind i bagsiden af blokken og flyder i den retning, der er angivet med pile. Opstrøms- og nedstrømselektroderne etablerer feltstimulationen for at fremkalde sammentrækning af en monteret trabecula i målekammeret. Blå skygge angiver de områder, hvor superfusatet flyder under et eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Frontpanel af billedanskaffelses- og kontrolsoftwaren. (B) Brugergrænseflade til OLT-billedbehandling. (C) Brugergrænseflade til hardwarekontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Trabecula dissektion og montering protokol. (B ) Det samme hjerte med atrierne fjernet. Stiplede linjer angiver excision bane for at åbne hjertekamrene. (C) Et åbnet hjerte til at udsætte det indre af begge hjertekamrene. Den stiplede boks angiver det område, hvor trabeculae typisk findes. D) Punktafgiftsfrit højre ventrikulær vægregion (det samme som angivet i den stiplede kasse i C). Stiplede linjer fremhæver tre trabeculae. (E) En trabecula udvalgt blandt de tre i D. (F) Trabecula fra panel E med vægvævet fjernet. g)Den isolerede trabecula i slutningen af en 1 mL sprøjte. (H)Trabecula i monteringskammeret. (I) De trabecula monteret mellem to platin kroge. (J) Trabecula, monteret mellem kroge, i målekammeret (figur 3B). Den grønne plet er en artefakt fra det første dichroic filter. (K) Sekundær vinkel på den monterede trabecula i målekammeret. Afstanden mellem trabecula og mikroskop mållinsen er ca 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Kraftmålingens positionsafhængighed. Den kraft, der produceres af musklen fra hver af billeddannelsespositionerne (n = 7) overlejret. Den gennemsnitlige produktion af aktiv kraft var 0,527 mN ± 0,003 mN, tid til 50 % nedgang 77,1 ms ± 0,3 ms og tid til 50 % afslapning 328,1 ms ± 0,9 ms (alle data præsenteres som gennemsnittet ± SE). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Analyse af OLT-billeddiagnostik. (A) Eksempel på WEKA-segmentering. Den segmenterede tværsnit af musklen er fremhævet med rødt, og baggrunden er fremhævet med grønt. (B) Overlegen opfattelse af de rå C-scanningsdata for en trabecula. Den lyse vinklede linje mod toppen af billedet er afspejlingen af målekammervæggen. (C) Lateral visning af de rå C-scanningsdata for en trabecula. d) Overlegen visning af de segmenterede OLT-data. (E) Lateral visning af de segmenterede OLT-data. (F) Tværsnitsarealet langs længden af trabecula (x-aksen)gennem tiden (y-akse). Det gennemsnitlige tværsnitsareal langs muskellængden var 0,0326 mm2 ± 0,0005 mm2 (middel ± S.E.) g)En maske af trabecula. Masken er blevet omtrent afstemt med tværsnitsarealet i panel F. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Analyse aflysfelt og fluorescensbilleddannelse. (A) Syet billede (syv billedvinduer) af trabecula. (B) Ca2+ transienter langs trabeculaens længde. (C) Gennemsnitlig x-forskydning fra hvert billedvindue. En positiv forskydning repræsenterer en bevægelse til højre og negativ til venstre. (D) Gennemsnitlige sarkomlængder fra hvert billedvindue, der havde den nødvendige billedkontrast. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Oversigt over løsninger Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi en konfiguration, der gør det muligt at samle tre optiske systemer, der kombinerer lysfelt, fluorescens og OLT-billeddannelse, for at indsamle data fra en aktivt kontraherende ex vivo-hjerte trabecula (figur 1 og figur 2). En sådan orkestreret integration er mulig på grund af målekammerets udformning (figur 3) for at gøre det muligt for OLT at arrangere det ortogonale arrangement med lysfelt-fluorescensaksen. Muskelmonteringssystemet spiller en lige så vigtig rolle i succesen med samtidige kvantificeringer af nøgleindekser til karakterisering af hjertemuskeludringssammentrækningsdynamik. Dens nyhed ligger i at muliggøre muskelscanning procedurer uden tilsyneladende forstyrrelse af den mekaniske ydeevne af musklen (Figur 6). Med den kombinerede billeddannelse konfiguration og motoriseret-hook system til kraft måling, kan dette system vurdere regionale heterogenitet i Ca2 + forbigående, forskydning, og sarkomere længde, sammen med makroskopisk geometrisk information om en ordregivende trabecula hele tiden løbet af træk(Figur 7 og Figur 8).

I betragtning af allestedsnærværende lysfelt-epifluorescens imaging systemer inden for hjerteforskning laboratorier, reproduktion af disse resultater kan opnås med nogle mindre hardware overvejelser. Her præsenterer vi billedbehandlingsværktøjssættet til at kombinere brightfield-epifluorescens og OCT, hvilket er afgørende for at analysere den underliggende kontraktil heterogenitet. Integrationen af OLT kræver en uhindret optisk sti, mens den indhegnede billeddannelse kræver en ekstern udløserlinje mellem stimulus og både OCT- og brightfield-billedkameraet og muskelmonteringskroge, der er i stand til at flytte prøven gennem målekammeret. Den nødvendige efterbehandling software og metoder er frit tilgængelige. Især segmentering software, der anvendes, WEKA14, er open source. Teknikken med markørløs sporing af materialepunkter8, sarkomlængde, indhegnet volumetrisk billeddannelse10og mesh-genereringskoder er ligeledes tilgængelige og kan stilles til rådighed efter anmodning fra den tilsvarende forfatter.

Muskel levedygtighed, optimal belastning af Fura-2, og billedfokus er de tre søjler, der danner grundlaget for et vellykket eksperiment. Ved hjælp af en dissektionsopløsning, der indeholder BDM for at forhindre kontraktur, transport af musklen i en sprøjte, kontinuerlig iltning af opløsningen og forberedelse af nye eksperimentelle løsninger på dagen for et eksperiment, bidrager alle til en høj muskelkraft. Før trabecula lastes med Fura-02:00, skal autofluorescens indsamles for hver betingelse man er interesseret i at studere, da det kan have en betydelig effekt på den målte Ca2 + forbigående15. Iltning af Fura-2AM loading løsning kompliceres af den nødvendige inddragelse af overfladeaktive pluronic-F127 at støtte farvestof lastning. For at bekæmpe den resulterende overskydende bobledannelse forårsaget af dette overfladeaktive middel giver en lille dråbe antiskum i lasteopløsningen brugeren mulighed for at øge iltningshastigheden og derved forbedre chancen for, at trabecula opretholder funktionel levedygtighed under hele belastningsprocessen. Endelig skal billeddiagnostik fokus være ensartet langs muskellængde for at maksimere signalet til støj-forholdet af brightfield og fluorescens oplysninger.

Der er to begrænsninger at overveje med de metoder, der præsenteres her. For det første er den rumlige opløsning af fluorescensmikroskopet. Mens OLT's rumlige opløsninger og lysfeltsbilleddannelse er høje, er opløsningen af fluorescensmikroskopet begrænset til en integreret del af fluorescensen fra det volumen, der er fanget inden for et 540 μm med 540 μm billedvindue. Der er mulighed for at øge den rumlige opløsning af fluorescensmikroskopet ved at bruge et høj-gain opladningskoblet enhedskamera i stedet for en PMT til at opfange fluorescenssignalet på bekostning af signalet til støjforhold16. For det andet er diameteren af trabecula, der kan studeres i form af målbare sarkom længde og geometrisk dybde. Den vinduesbaserede FFT-tilgang til beregning af sarkomlængde udnytter fordelen ved forbedret rumlig opløsning, men er forbundet med reduceret robusthed (figur 8D). I tilfælde, hvor turbid eller stor diameter trabeculae skal undersøges, vil fft'ens opløsning blive stærkt reduceret på grund af den reducerede kontrast, der er forbundet med sarkomerisk stribe i større vævsprøver. På samme måde vil rygrefleksionerne fra en billeddybde på over 300 μm inden for OLT være for svage til at blive løst i segmenteringsfasen. Derfor er vores teknik begrænset til trabeculae med en diameter på mindre end 300 μm. Det anbefales dog ikke at studere prøver med stor diameter, da der kan være problemer med diffust iltning af muskelkernen under høje stimuleringshastigheder17.

Vores metode gør det muligt at vurdere ionisk mekanisk funktion i forbindelse med muskelgeometri i sunde og syge muskler, hvilket giver en kraftfuld tilgang til forståelse af hjertemuskelfysiologi, patofysiologi og farmakologi. Den billedbehandlingspipeline, der er skitseret her, udtrækker data, der vil være afgørende for at opnå en dybere forståelse af kontraktil heterogenitet. En vej til fuldt ud at realisere potentialet i et så rigt datasæt er i konstruktionen af matematiske modeller, der integrerer og fortolker disse data, og at lave forudsigelser, der kan testes eksperimentelt ved hjælp af vores enhed.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af Ph.d.-stipendier fra University of Auckland (tildelt JD og MC), Sir Charles Hercus Health Research Fellowships (20/011 og 21/116) fra Health Research Council of New Zealand (tildelt J-CH til KT, henholdsvis), et ph.d.-stipendium tildelt af National Heart Foundation (tildelt AA), Marsden Fast-Start tilskud (UOA1504 og UOA1703) fra Royal Society of New Zealand (tildelt J-CH og KT, henholdsvis), og en James Cook Research Fellowship fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT). Den oprindelige udvikling af dette instrument blev finansieret af et Marsden-tilskud (11-UOA-199) fra Royal Society of New Zealand (tildelt AT og PN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-Butanedione monoxime Acros Organics 150375000
20× microscope lens Nikon CFI Super Fluor 20× NA 0.75
2D Galvanometer Thorlabs GVSM002/M
50-50 beam splitter Thorlabs FC850-40-50-APC
90-10 beam-splitter Thorlabs TW850R2A2
Analogue input module National Instruments NI-9205 Records the PMT signal at 200 kHz
Brightfield imaging light source CoolLED PE-2 660 nm LAM
Broadband light source Superlum Broadlighter-840
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cameralink card National Instruments NI-1429 Brightfield imaging frame grabber
Carbogen 5 BOC Gas code: 181
Condensor lens Nikon LWD 0.52
D(+)-Glucose Merck 108337
DAQ National Instruments NI-6259 Triggers the galvanometer movement
Dichroic mirror 1 Semrock FF409-Di03
Dichroic mirror 2 Semrock FF552-Di02
Diffraction grating Wasatch Photonics 1200 lines/mm @840 nm
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Direct-Q 3 UV System Merck Millipore ZRQSVR3WW Distilled water machine
Dry bath Corning 6875-SB LSE digital dry bath
FIJI ImageJ Open-source image processing software
Fura-2AM pentapotassium salt Thermofisher F14186
Hardware FPGA card National Instruments NI-7813R Also controls the triggering of the brightfield capture
Heparin Pfizer 61024
HEPES PanReac AppliChem A1069
Inverted microscope Nikon TI-DH illumination pillar
Isofluorane MedSource VAPDRUGISO250
KCl Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Line-scan camera Basler spL2048-70km Spectrometer camera
Magnetic stirrer IKA 3810000 RCT basic
Matlab Mathworks Data processing code
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich M1880
NaCl Sigma-Aldrich 71376
NaH2PO4.2H2O Sigma-Aldrich 71505
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014
OCT FPGA card National Instruments NI-1483R
Oxygen tank BOC Gas code: 100D
pH meter Mettler Toledo MP220
Photomultiplier tube Hamamatsu H7422-20
Powerload Thermofisher P10020
Superluminescent diode Broadlighter D-840
Transimpedance amplifier Custom
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 252859
Wistar rat Vernon Jansen Unit 8 – 10 weeks
Xenon arc lamp Sutter Instrument DG-4 Lambda DG-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, J. -C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
  2. Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
  3. Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
  4. Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250 (2019).
  5. Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
  6. Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
  7. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  8. Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
  9. Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398 (2012).
  10. Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
  11. Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
  12. Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
  13. Taberner, A., et al. A dynamometer for nature's engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
  14. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  15. Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
  16. Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
  17. Han, J. -C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).

Tags

Bioengineering udgave 176
Samtidig Brightfield, fluorescens, og optisk sammenhæng Tomografisk Imaging af kontraherende Hjerte Trabeculae <em>Ex Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dowrick, J. M., Anderson, A. J.,… More

Dowrick, J. M., Anderson, A. J., Cheuk, M. L., Tran, K., Nielsen, P. M. F., Han, J. C., Taberner, A. J. Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo. J. Vis. Exp. (176), e62799, doi:10.3791/62799 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter