Imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica

Resumen

Este protocolo presenta una técnica para el mapeo de alta resolución de sitios de replicación en cromatina estructuralmente preservada in situ que emplea una combinación de etiquetado EdU-streptavidin-Nanogold preincrustante y ChromEMT.

Resumen

Los principios del plegamiento del ADN en el núcleo celular y sus transformaciones dinámicas que ocurren durante el cumplimiento de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, segregación, etc.) siguen siendo poco conocidos, en parte debido a la falta de enfoques experimentales para la visualización de alta resolución de loci de cromatina específicos en núcleos estructuralmente conservados. Aquí presentamos un protocolo para la visualización de dominios replicativos en cultivo celular monocapa in situ, combinando el etiquetado EdU de ADN recién sintetizado con la posterior detección de etiquetas con amplificación ag-amplificación de partículas Nanogold y tinción ChromEM de cromatina. Este protocolo permite el etiquetado preincrustante de alto contraste y alta eficiencia, compatible con la fijación tradicional de glutaraldehído que proporciona la mejor preservación estructural de la cromatina para el procesamiento de muestras a temperatura ambiente. Otra ventaja del etiquetado de preincrustación es la posibilidad de preseleccionar celdas de interés para el seccionamiento. Esto es especialmente importante para el análisis de poblaciones celulares heterogéneas, así como la compatibilidad con los enfoques de tomografía electrónica para el análisis 3D de alta resolución de la organización de la cromatina en los sitios de replicación, y el análisis del reordenamiento de la cromatina post-replicativa y la segregación de cromátidas hermanas en la interfase.

Introducción

La replicación del ADN es un proceso biológico básico requerido para la copia fiel y la transmisión de la información genética durante la división celular. En eucariotas superiores, la replicación del ADN está sometida a una estrecha regulación espacio-temporal, que se manifiesta en la activación secuencial de los orígenes de replicación¹. Los orígenes de replicación vecinos que se activan sincrónicamente forman grupos de replicons². A nivel de microscopía óptica, los sitios de replicación continua del ADN se detectan como focos de replicación de varios números y tamaños. Los focos de replicación muestran patrones especí....

Protocolo

El protocolo está optimizado para células adherentes y se probó en líneas celulares HeLa, HT1080 y CHO.

1. Etiquetado y fijación celular

1. Celdas de placa en fundas limpias con ácido en una placa de Petri de 3 cm. Cultivar las células en los medios recomendados para la línea celular que se está utilizando al 70% de confluencia.
2. Añadir EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) de 10 mM de stock a 10 μM de concentración final y colocar las células en la incubadora durante 10 min o más (dependiendo del objetivo del experimento). Para pulsos más cortos (hasta 2 min), prepare una placa de Petri con medios de cultivo fres....

Resultados

Los focos de replicación en los núcleos celulares de mamíferos muestran patrones distintos de distribución dentro del núcleo dependiendo de la progresión de la fase S. Estos patrones se correlacionan con la actividad transcripcional de los loci que se replican. Dado que el método presentado aquí utiliza un procedimiento de fijación bastante fuerte, es bastante sencillo utilizar el etiquetado de pulsos replicativos para la detección específica de loci de cromatina en varios estados transcripcionales, incluso en condicione.......

Discusión

El método descrito aquí tiene varias ventajas sobre los protocolos publicados anteriormente. En primer lugar, el uso de Click-chemistry para etiquetar el ADN replicado elimina la necesidad de un requisito previo de desnaturalización del ADN para la detección de BrdU con anticuerpos, preservando así mejor la ultraestructura de la cromatina.

En segundo lugar, la utilización de la biotina como ligando secundario que se genera después de la fijación del glutaraldehído y el enfriamiento adecuado d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU)	Thermo Fisher	A10044
2-(4-morfolino)etano Ácido sulfónico (MES)	Fisher Scientific	BP300-100
AlexaFluor 555-azida	Termo Fisher	A20012
biotina-azida	Lumiprobe	C3730
Albúmina sérica bovina	Boval	LY-0080
DDSA	SPI-CHEM	26544-38-7
DMP-30	SPI-CHEM	90-72-2
DRAQ5	Thermo Scientific	62251
Monómero de resina epoxi	SPI-CHEM	90529-77-4
Glutaraldehído (25%, grado EM)	TED PELLA, INC	18426
Goma arábiga	ACROS Organics	258850010
Cloruro de magnesio	Panreac	141396.1209
NaBH4	SIGMA-ALDRICH	213462
NMA	SPI-CHEM	25134-21-8
N-galato de propilo	SIGMA-ALDRICH	P3130
PBS	MP Biomedicals	2810305
Lactato de plata	ALDRICH	359750-5G
Estreptavidina-AlexaFluor 488 conjugado	Termo Fisher	S11223
Conjugado estreptavidina-nanooro	Nanosondas	2016
ácido tetracloroáurico	SIGMA-ALDRICH	HT1004
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	CHEM-IMPEX INT'L	298
Triton X-100	Fluka Chemica	93420
Instruments
Carbon Coater	Hitachi
Copper rejillas de una sola ranura	Ted Pella	1GC10H
Cy5 juego de filtros de fluorescencia (Ex620/60 DM660 Em700/75)	Nikon	Cy5 HQ	Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus
Cuchillo de diamante Ultra Wet 45o	Diatome	DU	Alternativas: Ted
Pella Microscopio fluorescente	Nikon	Ti-E	Alternativas: Zeiss, Leica, Olympus
Portamuestras de alta inclinación	Jeol
Rotator	Biosan	Multi Bio RS-24
Microscopio electrónico de transmisión que funciona a 200 kV en modo EFTEM, con goniómetro de alta inclinación	Jeol	JEM-2100	Alternativas: FEI, Pinzas Hitachi
	Ultramicrótomo Ted Pella	523
Leica		UltraCut-E	Alternativas: RMC
Software
Image	acquisition Open Source	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Procesamiento de imágenes	Open Source	IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)