Las vesículas extracelulares (EV) contribuyen a la biología celular y las comunicaciones intercelulares. Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de EV por las células. El protocolo actual propone el ensayo de captación de EV mediante la utilización de imágenes de fluorescencia tridimensional a través de microscopía confocal, después del aislamiento de EV por un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración.
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Artículo de método
Ensayo de captación de vesículas extracelulares mediante análisis de imágenes con microscopio confocal
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Resumen
Resumen
Existe la necesidad de ensayos prácticos para visualizar y cuantificar la absorción de vesículas extracelulares (EV) de las células. La absorción de EV juega un papel en la comunicación intercelular en varios campos de investigación; biología del cáncer, neurociencia y administración de fármacos. Muchos ensayos de captación de EV han sido reportados en la literatura; sin embargo, hay una falta de metodología experimental práctica y detallada. La absorción de EV se puede evaluar mediante el etiquetado fluorescente de EV para detectar su ubicación dentro de las células. Distinguir entre los EV internalizados en las células y los EV superficiales en las células es difícil, pero crítico, para determinar con precisión la absorción de EV. Por lo tanto, en este trabajo se propone un ensayo que cuantifica eficientemente la absorción de EV a través de la microscopía confocal de fluorescencia tridimensional (3D). Los EV marcados fluorescentemente se prepararon utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, visualizados por microscopía confocal 3D y luego analizados a través de un software avanzado de procesamiento de imágenes. El protocolo proporciona una metodología robusta para analizar los vehículos eléctricos a nivel celular y un enfoque práctico para un análisis eficiente.
Introducción
Las vesículas extracelulares (EV) son partículas de tamaño nanométrico unidas a la membrana lipídica que se clasifican por sus tamaños: ectosomas (100-500 nm) y exosomas (50-150 nm)1. Los EV contienen varias biomoléculas, como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Estas biomoléculas se originan en las células antes de ser encapsuladas como carga y liberadas en el espacio extracelular a través de EV1,2,3.
Debido a la variedad de su carga, se cree que los vehículos eléctricos desempeñan un papel activo en la comunica....
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Protocolo
1. Aislamiento ev y etiquetado EV inmunofluorente en chip
- Recolección de medios de cultivo celular (MCC) y preprocesamiento de MCP para aislamiento de EV
- Semilla de células PC3 al 30% de confluencia en un matraz de cultivo celular de 75 cm2 . Permita que las células de control crezcan hasta un 90% de confluencia (~ 48 h) en medios estándar y suplementos específicos de la línea celular.
NOTA: Para evitar que los componentes que contienen EV afecten la absorción celular (es decir, suero bovino fetal), use medios y suplementos agotados por exosomas. - Cosechar el MCP.
- Centrifugue el CCM a 1000 x g durante 10 mi....
- Semilla de células PC3 al 30% de confluencia en un matraz de cultivo celular de 75 cm2 . Permita que las células de control crezcan hasta un 90% de confluencia (~ 48 h) en medios estándar y suplementos específicos de la línea celular.
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Resultados
Utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, los EV se aislaron de PC3 CCM y se etiquetaron con un anticuerpo ev específico conjugado con fluoróforos (CD63) (Figura 1). Los EV etiquetados fueron visualizados con éxito por la microscopía confocal 3D (Figura 2). Los EV marcados se incubaron con células durante varias horas en medios agotados por exosomas. Después de la incubación, las células se lavaron con medios agotados de exosomas. Los EV .......
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Discusión
Un ensayo de captación de EV basado en imágenes de fluorescencia 3D a través de microscopía confocal proporciona una metodología eficiente y un análisis sensible. Este etiquetado fluorescente EV facilita la visualización de evs y realiza con éxito un ensayo preciso de captación de EV. Se han notificado métodos anteriores para etiquetar los EV y eliminar el colorante residual mediante la eliminación de la precipitación mediante ultracentrifugación (CU); sin embargo, la CU puede co-precipitar los EV, y el tinte in.......
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Divulgaciones
Y.-K. Cho es inventor de las patentes del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración, Exodisc, que tienen licencia para Labspinner (Ulsan, Corea). Todos los demás autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los números de subvención del NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 y CA143055 a K. J. P. Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de I + D de Tecnología de la Salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de subvención: HI19C1122). Obra de J. Kim y Y.-K. Cho fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R020-D1), financiado por el Gobierno de Corea. Los autores agradecen a los miembros actuales y pasados del Instituto Urológico Brady, especialmente a los miembros del laboratori....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-humano Anticuerpo CD63 | Biolegend | 353038 | Anticuerpo específico EV conjugado con colorante fluorescente |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Reactivo de marcaje fluorado de célula viva (citoplasma) |
| CFI Apo Lambda S 40XC | WI Nikon | MRD77400 Objetivo para imágenes confocal, NA=1.25 | |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objetivo para la obtención de imágenes confocal, NA=0,75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | Un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración para el aislamiento de vehículos eléctricos |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Dispositivo de operación para |
| Exodisc FBS con depleción de exosomas | Thermo Fisher Scientific | A2720801 Nutriente de los medios de cultivo celular para la colección de EV derivados de líneas celulares PC3 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutriente para el cultivo celular |
| IgG anti-ratón de cabra H& L abcam | preadsorbido ab7063 | Anticuerpo IgG de ratón para el control negativo del etiquetado EV | |
| Ibidi USA U DISH μ-Plato 35 mm | Ibidi | 81156 | Plato de cultivo para imagen confocal |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Software de procesamiento posterior a la imagen |
| Sistema de incubadora+ CO2/O2/N2 mezclador de gas | Instrumento de célula viva | TU-O-20 Sistema de | incubadora para la adquisición de imágenes de células vivas |
| Cámara Nikon A1 HD25 / A1R HD25 | Nikon | NA | Cámara para imagen confocal |
| Microscopio Nikon Eclipse Ti | Nikon | NA | Microscopio invertido para imagen confocal |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Software de procesamiento de imágenes para microscopio Nikon |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Dispositivo de medición para la concentración de EV |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Software de gráficos |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibióticos para el cultivo celular |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Medios de cultivo celular para el cultivo de líneas celulares PC3 |
| SYTO RNASelect Green Tinción celular fluorescente - 5 mM Solución en DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | Tinción de ARN con colorante fluorescente para el marcaje |
Referencias
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
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Reimpresiones y permisos
