Medición de la composición del complejo de señalización inductor de muerte CD95 y procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo

Resumen

Aquí, se presenta un flujo de trabajo experimental que permite la detección del procesamiento de caspasa-8 directamente en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y determina la composición de este complejo. Esta metodología tiene amplias aplicaciones, desde desentrañar los mecanismos moleculares de las vías de muerte celular hasta el modelado dinámico de las redes de apoptosis.

Resumen

La apoptosis extrínseca está mediada por la activación de receptores de muerte (DR) como CD95 / Fas / APO-1 o ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). La estimulación de estos receptores con sus ligandos cognados conduce al ensamblaje del complejo de señalización inductor de muerte (DISC). DISC comprende DR, la proteína adaptadora asociada a Fas con dominio de la muerte (FADD), procaspasas-8/-10 y proteínas inhibidoras de enzimas convertidoras de interleucina (IL)-1β similares a FADD celulares (c-FLP). El DISC sirve como plataforma para el procesamiento y la activación de la procaspasa-8. Este último ocurre a través de su dimerización/oligomerización en los filamentos del dominio efector de la muerte (DED) ensamblados en el DISC.

La activación de la procaspasa-8 es seguida por su procesamiento, que ocurre en varios pasos. En este trabajo se describe un flujo de trabajo experimental establecido que permite la medición de la formación de DISC y el procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo. El flujo de trabajo se basa en técnicas de inmunoprecipitación apoyadas por el análisis de western blot. Este flujo de trabajo permite un seguimiento cuidadoso de los diferentes pasos del reclutamiento de la procaspasa-8 para el DISC y su procesamiento y es muy relevante para investigar los mecanismos moleculares de la apoptosis extrínseca.

Introducción

Uno de los receptores de muerte (DR) mejor estudiados es CD95 (Fas, APO-1). La vía apoptótica extrínseca comienza con la interacción de la DR con su ligando cognado, es decir, CD95L interactúa con CD95 o TRAIL se une a TRAIL-Rs. Esto da como resultado la formación del DISC en el DR. DISC correspondiente consiste en cd95, FADD, procaspasa-8/-10 y proteínas c-FLIP^1,2. Además, el DISC se ensambla mediante interacciones entre proteínas que contienen dominio de muerte (DD), como CD95 y FADD, y proteínas que contienen DED como FADD, procaspasa-8/-10 y c-FLIP(Figura 1). La proca....

Protocolo

Los experimentos con células T se realizaron de acuerdo con el acuerdo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparación de células para el experimento

NOTA: El número promedio de células para esta inmunoprecipitación es de 1 × 10⁷_. Las células adherentes tienen que ser sembradas un día antes del experimento para que haya 1 × 10⁷ células el día del experimento.

1. Preparación de células adherentes para el experimento
   1. Sembra 5-8 × 10⁶ células adherentes en 20 mL de medio (ver la Tabla de Materiales para la composición) para cada condición en plat....

Resultados

Para analizar el reclutamiento de caspasa-8 para el DISC y su procesamiento en el DISC CD95, este documento describe un flujo de trabajo clásico, que combina IP del DISC CD95 con análisis de western blot. Esto permite la detección de varias características clave de la activación de la caspasa-8 en el DISC: el ensamblaje de la plataforma macromolecular activadora de la caspasa-8, el reclutamiento de procaspasa-8 en el DISC y el procesamiento de esta caspasa iniciadora(Figura 1 y

Discusión

Este enfoque fue descrito por primera vez por Kischkel et al.²⁷ y ha sido desarrollado con éxito desde entonces por varios grupos. Se deben considerar varias cuestiones importantes para la eficiencia de la inmunoprecipitación DISC y el monitoreo del procesamiento de la caspasa-8 en este complejo.

En primer lugar, es esencial seguir todos los pasos de lavado durante la inmunoprecipitación. Especialmente importantes son los pasos finales de lavado de las cuentas de sefalr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12,5% Gel SDS	autofabricado		para dos geles separadores: 3,28 mL destilado H2O 2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 mL acrilamida 100 µ L 10% SDS 100 y micro; L 10% APS 7.5 y micro; L TEMED para dos geles colectores: 3,1 mL de H2O 1,25 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 mL de acrilamida 50 y micro; L 10% SDS 25 µ L 10% APS 7.5 y micro; L TEMED
Placas de celda de 14,5 cm	Greiner	639160
acrilamida	Carl Roth	A124.1
Puntas de pipeta con filtro de alta recuperación y orificio ancho	VWR	46620-664 (Norteamérica) o 732-0559 (Europa)	Se utiliza para pipetear perlas en el lisado
antiactina Ab	Sigma Aldrich	A2103	dilución: 1:4000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por Enzo	ALX-805-038-C100	utilizado solo para la inmunoprecipitación
anti-caspasa-10	Ab Biozol Biozol	MBL-M059-3	dilución: 1:1000 en PBST + 1:100 NaN3
3 Señalización	9662 S	: 1:2000 en PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasa-8 Ab C15	proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-804-242-C100	dilución: 1:20 en PBST + 1:100 NaN3
>anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	dilución: 1:2000 en PBST + 1:100 NaN3
>anti-c-FLIP NF6 Ab	proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-804-961-0100	dilución: 1:10 en PBST + 1:100 NaN3
>anti-FADD 1C4 Ab	proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ADI-AAM-212-E	dilución: 1:10 en PBST + 1:100 NaN3
>anti-PARP Ab	señalización	9542	dilución: 1:1000 en PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
CD95L	proporcionado en estos experimentos por el Prof. P. Krammer o puede ser comprado por ENZO	ALX-522-020-C005
detector de quimioluminiscencia Chem Doc XRS+	Bio Rad
cCóctel completo de inhibidores de protesa (PIC)	Sigma Aldrich	11 836 145 001	preparado según las instrucciones del fabricante
DPBS (10x) sin Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	dilución 1:10 con H2O, almacenamiento en la nevera
tampón de eletroforesis	de fabricación		propia10x tampón de electroforesis: 60,6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O dilución 1:10 antes de usar
glicina	Carl Roth	3908.3
Cabra Anti-Ratón IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	dilución 1:10.000 en PBST + 5% leche
Cabra Anti-Ratón IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	dilución 1:10.000 en PBST + 5% leche
Cabra Anti-Conejo IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	dilución 1:10.000 en PBST + 5% leche
Interleucina-2 Humana(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	para la activación de células T
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
tampón de carga 4x Tampón de muestra Laemmli, 10 mL	Bio Rad	161-0747	preparado según las instrucciones del fabricante
Luminata Forte Western HRP sustrato	Millipore	tampón
fabricación	propia		13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 mL de NaCl; 5 M 10 mL de EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 añadir 960 mL H2O
para células adusibles DMEM F12 (1:1) con glutamina estable,  2.438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	añadiendo 10% FCS, 1% Penicilina-Estreptomicina y 0,0001% Puromicina al
medio medio para linfocitos T primarios	gibco de Life Technologie	21875034	añadiendo 10% FCS y 1% Penicilina-Estreptomicina al medio
leche en polvo	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	de fabricación		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilución 1:20 antes de usar
PBST + 5% de leche	propia		50 g de leche en polvo + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	para la activación de las células T
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	uso entre 3-5 y micro; L
Proteína A Sepharose CL-4B perlas	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	perlas de resina de afinidad preparadas según las instrucciones del fabricante
raspador	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
agitador	Heidolph
azida sódica	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo pilas de transferencia de tamaño mini	Bio Rad	170-4270	usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
TransBlot Turbo 5x Tampón de transferencia	Bio Rad	10026938	preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante
TransBlot Turbo Membrana de nictrocelulosa de tamaño mini	Bio Rad	170-4270	utilizado según las instrucciones del fabricante
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000

de células Ab de lisis WBLUFO500 de propia