Este trabajo describe la preparación de extracto celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en menos de 24 horas. La explicación del protocolo de autoinducción libre de células (CFAI) detalla las mejoras realizadas para reducir la supervisión del investigador y aumentar las cantidades de extracto celular obtenido.
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Artículo de método
De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células
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Resumen
Resumen
La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) ha crecido como una plataforma biotecnológica que captura maquinaria de transcripción y traducción in vitro. Numerosos desarrollos han hecho que la plataforma CFPS sea más accesible para los nuevos usuarios y han ampliado la gama de aplicaciones. Para los sistemas CFPS basados en lisado, se pueden generar extractos celulares a partir de una variedad de organismos, aprovechando la bioquímica única de ese huésped para aumentar la síntesis de proteínas. En los últimos 20 años, Escherichia coli (E. coli) se ha convertido en uno de los organismos más utilizados para apoyar CFPS debido a su asequibilidad y versatilidad. A pesar de los numerosos avances clave, el flujo de trabajo para la preparación de extractos de células de E. coli ha seguido siendo un cuello de botella clave para que los nuevos usuarios implementen CFPS para sus aplicaciones. El flujo de trabajo de preparación de extractos requiere mucho tiempo y requiere experiencia técnica para lograr resultados reproducibles. Para superar estas barreras, anteriormente informamos sobre el desarrollo de un flujo de trabajo de autoinducción sin celdas (CFAI) las 24 horas que reduce la entrada del usuario y la experiencia técnica requerida. El flujo de trabajo de CFAI minimiza la mano de obra y la habilidad técnica requerida para generar extractos de células, al tiempo que aumenta las cantidades totales de extractos de células obtenidas. Aquí describimos ese flujo de trabajo paso a paso para mejorar el acceso y apoyar la amplia implementación de CFPS basado en E. coli .
Introducción
El uso de la síntesis de proteínas libres de células (PPCS) para aplicaciones biotecnológicas ha crecido sustancialmente en los últimos años 1,2,3. Este desarrollo puede atribuirse en parte al aumento de los esfuerzos para comprender los procesos que ocurren en CFPS y el papel de cada componente 4,5. Además, la reducción de los costos atribuidos a las configuraciones optimizadas y las fuentes de energía alternativas han hecho que la tecnología sin celdas sea más fácil de implementar para los nuevos usuarios
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Protocolo
1. Crecimiento de los medios
- Prepare 960 ml de medios CFAI como se describe en la Tabla 1 y ajuste el pH a 7.2 usando KOH.
- Transfiera los medios de cultivo a un matraz y autoclave desconcertados de 2,5 L durante 30 min a 121 °C.
- Prepare una solución de azúcar de 40 ml como se describe en la Tabla 1. Esterilizar con filtro la solución en un recipiente de vidrio en autoclave separado.
NOTA: La solución de azúcar se puede almacenar en una incubadora de 30 °C hasta su uso posterior. - Deje que el medio se enfríe completamente por debajo de 40 ° C después del autoclave.
- Antes de la inocula....
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Resultados
Al preparar los medios CFAI, la glucosa se intercambió por un aumento de lactosa y glicerol como principal sustrato energético en los medios. Además, también se aumentó la capacidad de almacenamiento en búfer de los medios CFAI. Estos componentes específicos se dan en la Tabla 1.
Las células se cultivaron a un OD600 de 10 y al estándar 2.5 en medios CFAI para mostrar consistencia con la calidad del extracto a pesar de las diferentes cantidades de extracto. El medio .......
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Discusión
La supervisión del investigador es tradicionalmente necesaria para dos acciones clave durante el crecimiento celular: la inducción de RNAP T7 y la recolección de células en un OD600 específico. CFAI evita ambos requisitos para disminuir el tiempo del investigador y la capacitación técnica requerida para preparar extractos celulares de alta calidad. La autoinducción de T7 RNAP se logra reemplazando la glucosa con lactosa como azúcar primaria en el medio, obviando la necesidad previa de monitorear activamente el.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Jennifer VanderKelen y Andrea Laubscher por su apoyo técnico. Los autores también desean agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington y Jillian Kasman por sus útiles discusiones. Los autores también reconocen el apoyo financiero del Fondo Bill y Linda Frost, la Subvención de Dotación de Investigación Aplicada de Chevron Biotechnology del Centro de Aplicaciones en Biotecnología, Cal Poly Research, Scholarly y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-1708919).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microfuga de 1,5 mL | Phenix | MPC-425Q | |
| Tubo de centrífuga de 1 L | Beckman Coulter | A99028 | |
| Centrífuga Avanti J-E | Beckman Coulter | 369001 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Citación Lector multimodo de imágenes de 5 células | Biotek BTCYT5F | ||
| D-Glucosa | Fisher | D16-3 | |
| D-Lactosa | Alfa Aesar | J66376 | |
| DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
| Ácido folínico | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| Glicerol | Fisher | BP229-1 | |
| Glycine Sigma-Aldrich | G7126-100G | ||
| HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
| K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
| L-Alanina | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
| L-Arginina | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
| L-Asparagina | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
| Ácido L-Aspártico | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
| L-Cisteína | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
| Ácido L-Glutámico | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
| L-Histadina | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
| L-Isoleucina | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
| L-Leucina | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
| L-Lisina | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
| L-fenilalanina | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
| L-Prolina | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-Serina | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
| L-Treonina | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
| L-Triptófano | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
| L-Tirosina | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
| Caldo Luria | ThermoFisher | 12795027 | |
| L-Valina | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
| Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
| Agua de Grado Molecular | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| NaCl | Alfa | Aesar A12313 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
| New Brunswick Innova 42/42R Incubadora | Eppendorf | M1335-0000 | |
| NH4(Glu) | Sigma-Aldrich | 09689-250G | |
| NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
| Ácido Oxálico | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
| PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
| Fosfato de Potasio Dibásico | Acros, Orgánicos | A0382124 | |
| Fosfato de Potasio Monobásico Acros | , Orgánicos | A0379904 | |
| PureLink HiPure Kit de Preparación de Plásmidos | ThermoFisher K210007 | ||
| Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
| Espermidina | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
| Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| ARNt | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| Tryptone Fisher | Bioreagents | 73049-73-7 | |
| Tunair 2.5L Frasco de batido con deflector | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
| Procesador | ultrasónicoQSonica | Q125-230V/50HZ | |
| Extracto de levadura | Fisher Bioreactivos | 1/2/8013 |
Referencias
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics.....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
