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Artículo de método

De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

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DOI:

10.3791/62866

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22 de julio de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

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Resumen

Este trabajo describe la preparación de extracto celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en menos de 24 horas. La explicación del protocolo de autoinducción libre de células (CFAI) detalla las mejoras realizadas para reducir la supervisión del investigador y aumentar las cantidades de extracto celular obtenido.

Resumen

La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) ha crecido como una plataforma biotecnológica que captura maquinaria de transcripción y traducción in vitro. Numerosos desarrollos han hecho que la plataforma CFPS sea más accesible para los nuevos usuarios y han ampliado la gama de aplicaciones. Para los sistemas CFPS basados en lisado, se pueden generar extractos celulares a partir de una variedad de organismos, aprovechando la bioquímica única de ese huésped para aumentar la síntesis de proteínas. En los últimos 20 años, Escherichia coli (E. coli) se ha convertido en uno de los organismos más utilizados para apoyar CFPS debido a su asequibilidad y versatilidad. A pesar de los numerosos avances clave, el flujo de trabajo para la preparación de extractos de células de E. coli ha seguido siendo un cuello de botella clave para que los nuevos usuarios implementen CFPS para sus aplicaciones. El flujo de trabajo de preparación de extractos requiere mucho tiempo y requiere experiencia técnica para lograr resultados reproducibles. Para superar estas barreras, anteriormente informamos sobre el desarrollo de un flujo de trabajo de autoinducción sin celdas (CFAI) las 24 horas que reduce la entrada del usuario y la experiencia técnica requerida. El flujo de trabajo de CFAI minimiza la mano de obra y la habilidad técnica requerida para generar extractos de células, al tiempo que aumenta las cantidades totales de extractos de células obtenidas. Aquí describimos ese flujo de trabajo paso a paso para mejorar el acceso y apoyar la amplia implementación de CFPS basado en E. coli .

Introducción

El uso de la síntesis de proteínas libres de células (PPCS) para aplicaciones biotecnológicas ha crecido sustancialmente en los últimos años 1,2,3. Este desarrollo puede atribuirse en parte al aumento de los esfuerzos para comprender los procesos que ocurren en CFPS y el papel de cada componente 4,5. Además, la reducción de los costos atribuidos a las configuraciones optimizadas y las fuentes de energía alternativas han hecho que la tecnología sin celdas sea más fácil de implementar para los nuevos usuarios 6,7,8,9. Con el fin de implementar los factores de transcripción y traducción necesarios para la síntesis de proteínas, el extracto celular se utiliza a menudo para impulsar reacciones libres de células10. Las guías de usuario publicadas recientemente han proporcionado protocolos simples para producir extracto funcional, lo que facilita la implementación para usuarios nuevos y experimentados por igual 1,11,12,13,14. El extracto celular se suele obtener a través de la lisis de un cultivo celular, que se puede cultivar utilizando diferentes organismos dependiendo del uso específico deseado 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) se ha convertido rápidamente en uno de los organismos huésped más utilizados para producir extractos funcionales17. Se prefiere la cepa BL21 Star (DE3) porque elimina las proteasas de la membrana externa (proteasa OmpT) y el citoplasma (Proteasa lon), proporcionando un ambiente óptimo para la expresión de proteínas recombinantes. Además, el DE3 contiene el λDE3 que lleva el gen de la ARN polimerasa T7 (T7 RNAP) bajo el control del promotor lacUV5; el componente estrella contiene un gen RNasaE mutado que evita la escisión del ARNm 4,14,18,19. Bajo el promotor lacUV5, la inducción isopropil-tiogalactopiraside (IPTG) permite la expresión de T7 RNAP 20,21. Estas cepas se utilizan para cultivar y cosechar células, que dan materia prima para la preparación del extracto. La lisis celular se puede realizar utilizando una variedad de métodos, incluyendo el batido de perlas, la prensa francesa, la homogeneización, la sonicación y la cavitación de nitrógeno 1,11,12,22.

El proceso de cultivo y recolección de bacterias es consistente en la mayoría de las plataformas cuando se usa E. coli, pero requiere varios días y una intensa supervisión del investigador 1,11,13. Este proceso generalmente comienza con un cultivo de semillas durante la noche en caldo LB, que al crecer durante la noche se inocula en un cultivo más grande de 2xYTPG (levadura, triptona, tampón de fosfato, glucosa) al día siguiente. El crecimiento de este cultivo más grande se monitorea hasta que alcanza la fase logarítmica temprana a media, a una densidad óptica (OD) de 2.514,20. Se requiere una medición constante ya que se ha demostrado previamente que los componentes de la transcripción y la traducción son altamente activos en la fase logarítmica temprana a media23,24. Si bien este proceso puede crear extracto reproducible, nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente un nuevo método utilizando medios de autoinducción libre de células (CFAI), que reduce la supervisión del investigador, aumenta el rendimiento general del extracto para un litro determinado de cultivo celular y mejora el acceso a la preparación de extractos basados en E. coli tanto para usuarios experimentados como nuevos (Figura 1 ). Aquí proporcionamos la guía paso a paso para implementar el flujo de trabajo de CFAI, para pasar de una placa rayada de células a una reacción CFPS completa dentro de las 24 horas.

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Protocolo

1. Crecimiento de los medios

  1. Prepare 960 ml de medios CFAI como se describe en la Tabla 1 y ajuste el pH a 7.2 usando KOH.
  2. Transfiera los medios de cultivo a un matraz y autoclave desconcertados de 2,5 L durante 30 min a 121 °C.
  3. Prepare una solución de azúcar de 40 ml como se describe en la Tabla 1. Esterilizar con filtro la solución en un recipiente de vidrio en autoclave separado.
    NOTA: La solución de azúcar se puede almacenar en una incubadora de 30 °C hasta su uso posterior.
  4. Deje que el medio se enfríe completamente por debajo de 40 ° C después del autoclave.
  5. Antes de la inoculación de los medios CFAI, agregue la solución de azúcar directamente al medio CFAI.
  6. Para inocular el medio, deslice un bucle de colonias de una placa de E. coli BL21 Star (DE3) previamente rayada e insértelo directamente en el medio. Gire el bucle en el medio, pero evite tocar los lados del recipiente. Asegúrese de que la placa de rayas esté fresca, con células viables.
  7. Coloque el matraz con el medio inoculado en una incubadora de 30 °C mientras agita a 200 rpm. Permita que la cultura crezca de la noche a la mañana. Si las células se inoculan por la noche, el cultivo alcanzará una densidad óptica aproximada, medida a 600 nm (OD600), de 10 la mañana siguiente. Los tiempos de inoculación y cosecha se pueden ajustar según sea necesario.

2. Cosecha de células

  1. Prepare el búfer S30 con anticipación y manténgalo frío. Prepare el tampón S30 de acuerdo con la Tabla 2, a un pH final de 8.2.
    NOTA: El búfer S30 se puede preparar días antes de la cosecha de células. Si se hace esto, preparar sin ditiotreitol y conservar a 4 °C. Agregue dithiothreitol justo antes de usar.
  2. A partir de este momento, mantenga todas las soluciones y materiales en hielo. Transfiera 1 L de soporte a una botella de centrífuga de 1 L y centrífuga a 5.000 x g entre 4-10 °C durante 10 min. Decantar y desechar el sobrenadante. Usando una espátula estéril, transfiera el pellet a un tubo cónico de 50 ml preenfriado y previamente pesado.
  3. Lavar una vez con 30-40 mL de tampón S30 frío resuspensando el pellet a través de vórtice en ráfagas de 30 s con períodos de descanso en hielo.
    NOTA: Debido a un mayor volumen de pellets, dividir el pellet celular en dos tubos cónicos de 50 ml puede ser útil para el paso de lavado. El almacenamiento de células en alícuotas más pequeñas también proporciona flexibilidad para el procesamiento posterior.
  4. Centrifugar la resuspensión celular a 5000 x g entre 4-10 °C durante 10 min.
  5. Deseche el sobrenadante y limpie cualquier exceso de las paredes interiores del tubo cónico de 50 ml con un pañuelo limpio, evite tocar el pellet en sí. Pesa y congela el pellet en nitrógeno líquido. Conservar a -80 °C hasta su uso posterior.
    NOTA: Es posible que los pellets no requieran congelación instantánea si el usuario planea continuar con el protocolo de preparación del extracto.

3. Preparación del extracto

  1. Combine el pellet congelado con 1 ml de tampón S30 por cada 1 g del pellet celular y deje descongelar en hielo durante aproximadamente 30-60 min. Resuspend pellet descongelado a través de vórtices en ráfagas de 30 s con períodos de descanso sobre hielo. Vórtice hasta que no queden grupos visibles de células.
    NOTA: Los grupos más pequeños se pueden resuspendiendo mezclando con una pipeta.
  2. Transferir alícuotas de 1,4 ml de resuspensión celular a tubos de microfugio de 1,5 ml para la lisis celular. Sonicar cada tubo con una frecuencia de 20 kHz y 50% de amplitud durante tres ráfagas de 45 s con 59 s de reposo por ciclo rodeado de un baño de hielo. Invierta el tubo entre ciclos y agregue inmediatamente 4,5 μL de 1 M de ditiotreritotol después del último ciclo de sonicación.
    NOTA: Debido al calor liberado por la sonicación, es extremadamente importante asegurarse de que todas las alícuotas se mantengan en hielo cuando no se sonicen. El baño de hielo debe reponerse constantemente o ser lo suficientemente grande como para mantenerse fresco durante todo el proceso de sonicación.
  3. Centrifugar cada tubo a 18.000 x g y 4 °C durante 10 min. Recupere el sobrenadante y la alícuota en tubos de microfugio de 1,5 ml en alícuotas de 600 μL. Congelar alícuotas flash y conservar a -80 °C hasta su uso posterior. Se debe tener cuidado de pipetear solo el sobrenadante.

4. Síntesis de proteínas libres de células

  1. Descongele una alícuota de extracto del paso anterior para realizar 15 μL de reacciones de síntesis de proteínas libres de células en tubos de microfugio de 1,5 ml en cuadruplicato.
  2. Prepare cada reacción combinando 240 ng de ADN (concentración final de 16 μg/mL), 2,20 μL de Solución A, 2,10 μL de Solución B, 5,0 μL de extracto y un volumen variable de agua de grado molecular para llenar la reacción a 15 μL. Esta reacción se puede escalar a volúmenes más altos. Véanse los coeficientes en el cuadro 3 .
    1. Preparar la Solución A y B de acuerdo con la Tabla 4. Cada solución puede prepararse en lotes de 100 μL a 1 ml, alicitarse y almacenarse a -80 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: La cantidad de ADN puede variar dependiendo de la proteína de interés. En este caso, el plásmido utilizado, pJL1-sfGFP, se ha optimizado para funcionar a 16 μg/mL, o 597 μM.
  3. Deje que las reacciones duren al menos 4 h a 37 °C.

5. Cuantificación de la proteína reportera, súper carpeta proteína fluorescente verde (sfGFP)

  1. Usando una placa de poliestireno negro de 96 pocillos de área media, combine 2 μL de cada producto de reacción de síntesis de proteínas libres de células con 48 μL de tampón HEPES de 0,05 M a pH 7.2. Se recomiendan de tres a cuatro réplicas de cada tubo de reacción.
  2. Cuantificar la intensidad de fluorescencia del sfGFP con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm.
  3. Para la conversión de unidades de fluorescencia relativas al rendimiento volumétrico (μg/mL) de sfGFP, establezca una curva estándar utilizando pJL1-sfGFP purificado.

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Resultados

Al preparar los medios CFAI, la glucosa se intercambió por un aumento de lactosa y glicerol como principal sustrato energético en los medios. Además, también se aumentó la capacidad de almacenamiento en búfer de los medios CFAI. Estos componentes específicos se dan en la Tabla 1.

Las células se cultivaron a un OD600 de 10 y al estándar 2.5 en medios CFAI para mostrar consistencia con la calidad del extracto a pesar de las diferentes cantidades de extracto. El medio ...

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Discusión

La supervisión del investigador es tradicionalmente necesaria para dos acciones clave durante el crecimiento celular: la inducción de RNAP T7 y la recolección de células en un OD600 específico. CFAI evita ambos requisitos para disminuir el tiempo del investigador y la capacitación técnica requerida para preparar extractos celulares de alta calidad. La autoinducción de T7 RNAP se logra reemplazando la glucosa con lactosa como azúcar primaria en el medio, obviando la necesidad previa de monitorear activamente el...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Jennifer VanderKelen y Andrea Laubscher por su apoyo técnico. Los autores también desean agradecer a Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington y Jillian Kasman por sus útiles discusiones. Los autores también reconocen el apoyo financiero del Fondo Bill y Linda Frost, la Subvención de Dotación de Investigación Aplicada de Chevron Biotechnology del Centro de Aplicaciones en Biotecnología, Cal Poly Research, Scholarly y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-1708919).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microfuga de 1,5 mLPhenixMPC-425Q
Tubo de centrífuga de 1 LBeckman CoulterA99028
Centrífuga Avanti J-EBeckman Coulter369001
CoASigma-AldrichC3144-25MG
Citación Lector multimodo de imágenes de 5 célulasBiotek BTCYT5F
D-GlucosaFisherD16-3
D-LactosaAlfa AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
Ácido folínicoSigma-AldrichF7878-100MG
GlicerolFisherBP229-1
Glycine Sigma-AldrichG7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-AlaninaSigma-AldrichA7627-100G
L-ArgininaSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparaginaSigma-AldrichA0884-25G
Ácido L-AspárticoSigma-AldrichA7219-100G
L-CisteínaSigma-AldrichC7352-25G
Ácido L-GlutámicoSigma-AldrichG1501-500G
L-GlutaminaSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadinaSigma-AldrichH8000-25G
L-IsoleucinaSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucinaSigma-AldrichL8000-25G
L-LisinaSigma-AldrichL5501-25G
L-MetioninaSigma-AldrichM9625-25G
L-fenilalaninaSigma-AldrichP2126-100G
L-ProlinaSigma-AldrichP0380-100G
L-SerinaSigma-AldrichS4500-100G
L-TreoninaSigma-AldrichT8625-25G
L-TriptófanoSigma-AldrichT0254-25G
L-TirosinaSigma-AldrichT3754-100G
Caldo LuriaThermoFisher12795027
L-ValinaSigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
Agua de Grado MolecularSigma-Aldrich7732-18-5
NaClAlfaAesar A12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R IncubadoraEppendorfM1335-0000
NH4(Glu)Sigma-Aldrich09689-250G
NTPsThermoFisherR0481
Ácido OxálicoSigma-AldrichP0963-100G
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
Fosfato de Potasio DibásicoAcros, OrgánicosA0382124
Fosfato de Potasio Monobásico Acros, OrgánicosA0379904
PureLink HiPure Kit de Preparación de PlásmidosThermoFisher K210007
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
EspermidinaSigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
ARNtSigma-Aldrich10109541001
Tryptone FisherBioreagents73049-73-7
Tunair 2.5L Frasco de batido con deflectorSigma-AldrichZ710822
ProcesadorultrasónicoQSonicaQ125-230V/50HZ
Extracto de levaduraFisher Bioreactivos1/2/8013

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Reimpresiones y permisos

Erratum


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

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Extractos de E coliexpresi n libre de c lulasingenier a de prote naslisis celularm todo de sonicaci ncuantificaci n de la fluorescenciatamp n S30educaci n en biotecnolog a
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