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Neuroscience

Dural उत्तेजना और Periorbital वॉन Frey सिर दर्द के एक Preclinical मॉडल के रूप में चूहों में परीक्षण

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

माइग्रेन का सबसे उल्लेखनीय लक्षण गंभीर सिर दर्द है, और यह परिकल्पना की जाती है कि यह संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो मेनिन्जेस को इनरवेट करते हैं। यहां, हम एक आउटपुट के रूप में चेहरे की अतिसंवेदनशीलता का उपयोग करते हुए एक न्यूनतम इनवेसिव तरीके से ड्यूरा पर पदार्थों को स्थानीय रूप से लागू करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

कपाल मेनिन्जेस, जिसमें ड्यूरा मेटर, अराक्नोइड और पिया मेटर शामिल हैं, को मुख्य रूप से तंत्रिका तंत्र के लिए संरचनात्मक कार्यों की सेवा करने के लिए सोचा जाता है। उदाहरण के लिए, वे खोपड़ी से मस्तिष्क की रक्षा करते हैं और कॉर्टेक्स की संवहनी और न्यूरोनल आपूर्ति को लंगर / व्यवस्थित करते हैं। हालांकि, मेनिन्जेस को माइग्रेन जैसे तंत्रिका तंत्र विकारों में भी फंसाया जाता है, जहां माइग्रेन के दौरान अनुभव किए गए दर्द को स्थानीय बाँझ सूजन और स्थानीय नोसिसेप्टिव अभिवाही के बाद के सक्रियण के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। मेनिन्जेस में परतों में से, ड्यूरा मेटर माइग्रेन के पैथोफिजियोलॉजी में विशेष रुचि रखता है। यह अत्यधिक संवहनी है, स्थानीय nociceptive न्यूरॉन्स बंदरगाहों, और इस तरह के प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में निवासी कोशिकाओं की एक विविध सरणी के लिए घर है। स्थानीय मेनिंगियल माइक्रोएन्वायरमेंट में सूक्ष्म परिवर्तन ड्यूरल पेरिवैस्कुलर नोसिसेप्टर्स के सक्रियण और संवेदीकरण का कारण बन सकते हैं, इस प्रकार माइग्रेन के दर्द का कारण बन सकते हैं। अध्ययनों ने यह पता लगाने की मांग की है कि विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, इमेजिंग तकनीकों, या व्यवहार मॉडल में या तो उपयोग करके ड्यूरल अभिवाही सक्रिय / संवेदनशील कैसे हो जाते हैं, लेकिन इन्हें आमतौर पर बहुत आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल चूहों में ड्यूरा मेटर पर यौगिकों के तुलनात्मक रूप से गैर-आक्रामक अनुप्रयोग के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है और ड्यूरल उत्तेजना के बाद पेरिऑर्बिटल वॉन फ्रे परीक्षण का उपयोग करके सिरदर्द जैसी स्पर्श संवेदनशीलता को मापने के लिए एक उपयुक्त विधि प्रस्तुत करता है। यह विधि ड्यूरा और खोपड़ी की अखंडता को बनाए रखती है और 0.65 मिमी संशोधित कैनुला के माध्यम से पदार्थों को इंजेक्ट करके आक्रामक तकनीकों से भ्रमित प्रभावों को कम करती है, जो अनफ्यूज्ड सैगिटल और लैम्बडोइड टांके के जंक्शन पर होती है। यह प्रीक्लिनिकल मॉडल शोधकर्ताओं को ड्यूरल उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला और माइग्रेन की पैथोलॉजिकल प्रगति में उनकी भूमिका की जांच करने की अनुमति देगा, जैसे कि नोसिसेप्टर सक्रियण, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण, संवहनी परिवर्तन, और दर्द व्यवहार, सभी खोपड़ी और मेनिन्जेस के लिए चोट-मुक्त स्थितियों को बनाए रखते हुए।

Introduction

माइग्रेन का दर्द दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा बना हुआ है। विश्व स्वास्थ्य संगठन इसे दुनिया में छठी सबसे प्रचलित बीमारी के रूप में रैंक करता है, जो पृथ्वीकी आबादी 1 के 15% से कम पीड़ित है और समाज 2,3 पर पर्याप्त सामाजिक आर्थिक बोझ पैदा करता है। उपचार के विकल्प और उनकी प्रभावकारिता सबऑप्टिमल रही है और केवल रोगसूचक राहत प्रदान करती है और pathophysiological घटनाओं को महत्वपूर्ण रूप से संशोधित नहीं करती है जो माइग्रेन की घटना 4,5 को कम करती है। उपचार की सफलता की कमी माइग्रेन के एक मल्टीफैक्टोरियल विकार होने के कारण होने की संभावना है, जिसकी विकृति को खराब तरीके से समझा जाता है, जिससे सीमित संख्या में चिकित्सीय लक्ष्य होते हैं। माइग्रेन पशु मॉडल में पूरी तरह से कब्जा करने के लिए भी चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से यह देखते हुए कि माइग्रेन का निदान उन रोगियों के साथ मौखिक संचार के आधार पर किया जाता है जो माइग्रेन हॉलमार्क जैसे आभा, सिरदर्द, फोटोफोबिया और एलोडिनिया के साथ अपने अनुभव का वर्णन करते हैं। इसके बावजूद, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि माइग्रेन उपचार में हाल ही में हुई प्रगति वर्तमान में कई न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के लिए उपचार कर रही है जो प्रीक्लिनिकल मॉडल द्वारा अच्छी तरह से मान्य की गई है। उदाहरण के लिए, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और छोटे अणु जो कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड को लक्षित करते हैं, या इसके रिसेप्टर माइग्रेन पीड़ितों के जीवन की गुणवत्ता में सुधार करने में बहुत सफल रहे हैं और संभावित रूप से माइग्रेन के नैदानिक प्रबंधन को बदल सकते हैं। जबकि इस विकार को समझने में प्रगति हुई है, अभी भी बहुत कुछ स्पष्ट नहीं किया गया है।

प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल और मानव अध्ययन के आधार पर, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि माइग्रेन सिरदर्द मेनिंग्स के भीतर nociceptive फाइबर के अनियमित सक्रियण द्वारा शुरू किया जाता है जो ट्राइजेमिनल और ऊपरी गर्भाशय ग्रीवा पृष्ठीय-रूट गैन्ग्लिया 6,7,8,9,10 के माध्यम से संकेत देता है। इस सिद्धांत के बावजूद, कई अध्ययन अभी भी माइग्रेन में अंतर्निहित योगदान तंत्र को समझने के लिए दवाओं के प्रणालीगत प्रशासन का उपयोग करते हैं। जबकि दवाओं की प्रणालीगत खुराक ने हमारी समझ को काफी हद तक मजबूत किया है, ये निष्कर्ष सीधे आकलन नहीं करते हैं कि ब्याज के लक्ष्य ऊतक के भीतर स्थानीय क्रियाएं माइग्रेन में भूमिका निभाती हैं या नहीं। इसके विपरीत, कई अध्ययनों ने ड्यूरा को उत्तेजित करने के लिए एक दृष्टिकोण लिया है; हालांकि, इन प्रयोगों को एक आक्रामक क्रैनियोटॉमी और विस्तारित वसूली समय11,12 के माध्यम से कैनुला आरोपण की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं के कारण, हमने स्थानीय रूप से ड्यूरा को उत्तेजित करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण विकसित किया है जहां क्रैनियोटॉमी की कमी पोस्ट-सर्जिकल रिकवरी को समाप्त करती है और जागने वाले जानवरों में तत्काल परीक्षण की अनुमति देतीहै 12,13,14। इन इंजेक्शनों को प्रकाश आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के तहत किया जाता है और चूहों में सैगिटल और लैम्बडोइड टांके के जंक्शन पर प्रशासित किया जाता है।

कृन्तकों 15 में nociceptive व्यवहार प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। त्वचीय एलोडिनिया को लगभग 80% माइग्रेन पीड़ितोंमें 16,17 में रिपोर्ट किया गया है और कृन्तकों में उपयोग के लिए एक संभावित ट्रांसलेशनल समापन बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है। प्रीक्लिनिकल मॉडल में, कृंतक पंजे के प्लांटर क्षेत्र में वॉन फ्रे फिलामेंट्स के आवेदन का उपयोग प्रीक्लिनिकल माइग्रेन मॉडल में दर्द के व्यवहार का आकलन करने के लिए किया गया है। इस दृष्टिकोण की प्राथमिक सीमा यह है कि यह सेफलिक क्षेत्र का परीक्षण नहीं करता है। चेहरे के ग्रिमेस स्कोरिंग का उपयोग दर्द उत्तेजनाओं18,19 के प्रेरण के बाद चेहरे के भावों का विश्लेषण करके कृन्तकों में दर्द के व्यवहार को पकड़ने के लिए किया गया है। हालांकि, इसकी सीमाओं में केवल तीव्र उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं को कैप्चर करना शामिल है और पुरानी ओरोफेशियल दर्द की स्थिति नहीं है। चेहरे की ग्रूमिंग और कम पालन को भी माइग्रेन20,21 के प्रीक्लिनिकल मॉडल में व्यवहारिक प्रतिक्रियाओं के आउटपुट माना जाता है। पूर्व की सीमाओं में सामान्य नियमित सौंदर्य और खुजली जैसी अन्य संवेदनाओं से दर्द प्रतिक्रियाओं को अलग करने में कठिनाई शामिल है। उत्तरार्द्ध के मामले में, पालन व्यवहार आमतौर पर उपन्यास वातावरण में कृन्तकों की शुरुआत के बाद जल्दी से कम हो जाते हैं। यद्यपि इन व्यवहारिक समापन बिंदुओं में से प्रत्येक विभिन्न तंत्रों की समझ में मूल्यवान है जो दर्द की स्थिति में योगदान करते हैं, लेकिन माइग्रेन जैसे दर्द विकारों के प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है ताकि समापन बिंदु को शामिल किया जा सके जो विशेष रूप से सेफलिक अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं को कैप्चर करते हैं। ड्यूरल उत्तेजना के बाद पेरिऑर्बिटल त्वचा की स्पर्श अतिसंवेदनशीलता का आकलन करना एक ऐसी विधि है जो माइग्रेन में योगदान देने वाले तंत्र में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है जहां संवेदी लक्षण मुख्य रूप से प्रकृति में सेफलिक होते हैं। यहां, हम माइग्रेन के प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में माउस ड्यूरा पर पदार्थों को प्रशासित करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। ड्यूरल एप्लिकेशन के बाद, हम डिक्सन अप-डाउन विधि में लागू कैलिब्रेटेड वॉन फ्रे फिलामेंट्स का उपयोग करके पेरिऑर्बिटल स्पर्श अतिसंवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए एक विस्तृत विधि भी प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को डलास में टेक्सास विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के पूर्व अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया था। इस अध्ययन में 6-8 सप्ताह की आयु के आईसीआर (सीडी -1) (30-35 ग्राम) और सी 57 / बीएल 6 (25-30 ग्राम) चूहों का उपयोग किया गया था।

1. Dural infuser

  1. एक गैर-धात्विक फ्यूज्ड सिलिका प्लास्टिक कैप के साथ एकतरफा इंजेक्शन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आंतरिक प्रवेशनी और इनफ्यूजर को संशोधित करके माउस इनफ्यूजर / इंजेक्टर बनाएं जो समायोज्य है और 0.18 मिमी के आंतरिक व्यास (आईडी) और 0.35 मिमी (चित्रा 1 ए) के बाहरी व्यास (ओ.डी.) के साथ 28 जी गाइड कैनुला के नीचे / नीचे तक फैलता है।
  2. 0.6 मिमी की लंबाई के लिए infuser पर फ्यूज्ड सिलिका प्लास्टिक टोपी को समायोजित करने के लिए एक कैलिपर या अन्य मापने वाले उपकरण का उपयोग करें; सिलिका प्लास्टिक टोपी के किनारे के लिए infuser की नोक से मापा.
    1. प्लास्टिक की टोपी को समायोजित करते समय इन्फ्यूजर को मोड़ने या सुस्त करने के लिए सावधानी बरतें।
    2. अन्य माउस उपभेदों के लिए जो पहले ड्यूरल इंजेक्शन के लिए उपयोग नहीं किए गए हैं, 0.6 मिमी की लंबाई निर्धारित करके और स्याही या डाई के साथ पायलट इंजेक्शन का संचालन करके इष्टतम इन्फ्यूजर लंबाई निर्धारित करें, जब तक कि यह नहीं देखा जाता है कि डाई केवल ड्यूरा मेटर में है और मस्तिष्क या खोपड़ी पर नहीं है।
  3. प्लास्टिक टयूबिंग (पंप ट्यूबिंग, 2-स्टॉप, आईडी 0.19 मिमी, लंबाई 406 मिमी) के लिए समायोजित इनफ्यूजर के लंबे अंत (या अंत जिसे 0.6 मिमी नहीं मापा गया था) को संलग्न करें।
    1. टयूबिंग को 8 की न्यूनतम लंबाई में काटें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि 5 μL की मात्रा को पकड़ने के लिए पर्याप्त रेखा है।
    2. सुनिश्चित करें कि टयूबिंग धातु के हिस्से और इन्फ्यूजर पर स्थित प्लास्टिक स्टॉपर के शीर्ष को कवर करता है। यह लाइन में जमा होने से हवा के बुलबुले को रोकने में मदद करेगा।
  4. टयूबिंग के दूसरे छोर को 10 μL ग्लास माइक्रोसिरिंज (गैस-तंग; सीमेंटेड सुई; 10 मिमी प्रक्षेपण के साथ 21 जी) से जोड़ें, फिर से, सिरिंज के धातु भाग पर एक तंग सील होना सुनिश्चित करें (चित्रा 1 ए)।
  5. एक बार लाइन कनेक्ट होने के बाद, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस), सिंथेटिक अंतरालीय तरल पदार्थ (एसआईएफ), या पसंद के अन्य वाहनों के 5 μL के साथ सिरिंज को बैकफिल करें ताकि हवा के बुलबुले को बनने से रोका जा सके।
    1. यदि लाइन में हवा के बुलबुले देखे जाते हैं, तो बुलबुले के विलुप्त होने तक वाहन के साथ लाइन को बाढ़ दें।
      नोट: यह लाइन से जुड़ने से पहले वाहन के साथ सिरिंज को भरने में मदद कर सकता है और फिर एक बार कनेक्ट होने के बाद लाइन के माध्यम से तरल पदार्थ को धक्का दे सकता है।
  6. लाइन वाहन के 5 μL के साथ backfilled है और कुशलता से काम कर रहा है के बाद, हैमिल्टन सिरिंज में दवा / समाधान के 5 μL लोड (स्याही या डाई दवा के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है /
    1. सुनिश्चित करें कि ड्यूरा पर प्रशासित सभी वाहन समाधान पीएच 7.4 पर बनाए रखे जाते हैं और 310 की ऑस्मोलिटी के लिए मापा जाता है। यह ड्यूरा के भीतर एसिड-सेंसिंग आयन चैनलों और अन्य osmosensitive चैनलों के संभावित सक्रियण को कम करता है।
  7. चूहों में परीक्षण की गई अधिकतम मात्रा जो मस्तिष्क में लीक होने का कारण नहीं बनती है, वह लगभग 10 μL है। इस मात्रा के साथ इंजेक्शन के बाद व्यवहारिक प्रभावों का परीक्षण नहीं किया गया है। इस कारण से, ड्यूरा पर समाधान के केवल 5 μL का प्रशासन करें।
    नोट: ये अवलोकन माउस उपभेदों / उम्र / वजन 6-8 सप्ताह पुराने CD1 / ICR चूहों पर आधारित हैं।

2. Dural इंजेक्शन

  1. एक बार सिरिंज तैयार हो जाने और दवा लोड होने के बाद, एक माउस को अपने पेट पर फ्लैट रखें और इसे नाककोन के माध्यम से 0.5-1 एल / मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ संक्षिप्त 3% आइसोफ्लुरेन के तहत एनेस्थेटिक करें।
    1. माउस अब एक चुटकी पलटा प्रदर्शित करने के बाद, संज्ञाहरण को समायोजित करें और इसे 1.5% आइसोफ्लुरेन पर बनाए रखें।
  2. एक बार anesthetized, आंखों के लिए बाँझ opthalmic मरहम लागू होते हैं और जानवर के सिर मुंडा, तो पोविडोन-आयोडीन और इथेनॉल के साथ त्वचा कीटाणुरहित. इसके बाद, एक सफल इंजेक्शन के लिए अनुकूल स्थिति में जाओ।
  3. जानवर के सिर को स्थिर करने के लिए एक हाथ का उपयोग करें और दूसरे हाथ से इनफ्यूजर को पकड़ें।
  4. ध्यान से जांच और माउस की खोपड़ी पर sagittal और lambdoidal टांके के जंक्शन का पता लगाने (चित्रा 1B, सी).
    1. त्वचा के माध्यम से इस विचारशील जंक्शन का पता लगाने के लिए, खोपड़ी की स्थलाकृतिक विशेषताओं का उपयोग करें और धीरे से इनफ्यूजर के साथ जंक्शन के सामान्य स्थान की जांच करें।
    2. खोपड़ी के साथ infuser को फिर से तैनात करके जंक्शन की स्थिति को सत्यापित करें और सटीक स्थान के लिए महसूस करें।
  5. एक बार जब सीवन स्थित होता है और इनफ्यूजर जगह में होता है, तो बहुत धीरे-धीरे और धीरे-धीरे इन्फ्यूज़र को आगे और पीछे घुमाते हुए जब तक कि यह त्वचा के माध्यम से छेद नहीं करता है और प्लास्टिक स्टॉपर तक सभी तरह से जंक्शन में नीचे गिर जाता है।
    नोट: जंक्शन में infuser के पूरे 0.6 मिमी टिप डालने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. सटीकता को सत्यापित करने के लिए, स्याही या डाई का उपयोग इंजेक्शन समाधान के रूप में करें और माउस को euthanize और decapitate करें।
    1. ड्यूरा मेटर (चित्रा 1 सी) के भीतर डाई की कल्पना करने के लिए खोपड़ी की टोपी को हटा दें।
      नोट: डाई को मस्तिष्क या खोपड़ी के बाहरी हिस्से पर नहीं देखा जाना चाहिए। इसी तरह, किसी भी प्रयोग में चूहों को इंजेक्शन की सटीकता को सत्यापित करने के लिए पोस्टमार्टम की जांच की जानी चाहिए और साथ ही यह सुनिश्चित करने के लिए कि ड्यूरा मेटर की अखंडता को नुकसान नहीं हुआ था।
  7. इंजेक्शन के बाद, माउस को संज्ञाहरण से हटा दें, चेतना प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें और फिर इसके पिंजरे में लौटें या वांछित assays शुरू करने के लिए इसे एक परीक्षण कक्ष में रखें।
    नोट: माउस को किसी भी व्यवहार प्रयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए संज्ञाहरण से पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दें।

3. Periorbital वॉन Frey

  1. लगभग 16-20 चूहों के एक समूह के साथ अध्ययन शुरू करें।
  2. habituation से एक दिन पहले, कम से कम 5 मिनट के लिए प्रत्येक माउस को संभालें।
  3. हैंडलिंग के लगभग 24 घंटे बाद, चूहों को परीक्षण कक्ष की स्थिति और वॉन फ्रे परीक्षण उपकरण (चित्रा 2 ए) की आदत डालें।
    नोट: ऐक्रेलिक परीक्षण उपकरण ढक्कन के साथ अलग-अलग डिब्बों के होते हैं जो एक्स 5 में लगभग 3.5 में x 3.5 में (डब्ल्यू एक्स एच एक्स डी) होते हैं और एल्यूमीनियम द्वारा समर्थित होते हैं जो 19 जी वर्ग जस्ती स्टील जाल तार में 0.25 के माध्यम से जुड़े होते हैं।
    1. चूहों को एक क्षैतिज रूप से रखे गए 4-ऑउंस सफेद पेपर कप के अंदर रखें जो गंधहीन है और इसमें पॉलीथिन या पैराफिन मोम नहीं होता है।
      नोट: इन प्रकार के कपों को पसंद किया जाता है क्योंकि यह चूहों में जठरांत्र संबंधी परेशान को कम करता है यदि निगला जाता है (चित्रा 2 बी)।
  4. जबकि जानवर अपने संबंधित कक्षों में हैं, जानवरों को शांत करने के लिए प्रत्येक माउस के व्यक्तिगत कक्ष में सामान्य चाउ आहार का एक छर्रा रखें और जानवरों के लिए किसी भी अनावश्यक तनाव से बचा जाता है। किसी भी वॉन फ्रे व्यवहार परीक्षण से पहले 3 दिनों के लिए ऐसा करें।
    1. सुनिश्चित करें कि हर बार जब चूहे कक्ष में होते हैं तो भोजन तक पहुंच होती है।
    2. संख्या और परीक्षण रैक में एक ही स्थान के लिए प्रत्येक जानवर असाइन करें। माउस को परीक्षण अवधि के हर दिन एक ही कप में रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक जानवर अपने परीक्षण वातावरण के अनुकूल हो जाए।
      नोट: चूहों कप पर कुतरना होगा और बाद में कप को नष्ट कर देगा। यदि ऐसा होना चाहिए, तो कप को बदलें और इसे संबंधित माउस नंबर के साथ लेबल करें।
  5. habituation के शुरुआती 3 दिनों के बाद, चूहों को उनके व्यक्तिगत कक्षों में रखें।
    1. जानवरों को किसी भी वॉन फ्रे परीक्षण से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए परीक्षण कक्ष और कक्षों में acclimate करने की अनुमति दें ताकि चूहों को शांत करने की अनुमति मिल सके और बाद में परीक्षण करना आसान हो।
  6. परीक्षण के दिन कमरे में प्रवेश करने के बाद, अपने संबंधित कक्ष से अपने कप में अभी भी एक माउस को हटा दें।
    1. क्षैतिज स्थिति में कप को बनाए रखें ताकि माउस अपने वजन को समान रूप से वितरित रखने में मदद करने के लिए फोरपाव्स और हिंद पंजे दोनों पर हो।
      नोट: असमान वजन वितरण जानवरों की प्रतिक्रियाओं को बदल सकता है और यहां तक कि जानवरों को प्रतिक्रिया देने से भी रोक सकता है।
  7. अवशोषक पैड पर परीक्षण रैक के नीचे टेबल पर माउस के साथ कप को अंदर रखें।
  8. पेरिऑर्बिटल वॉन फ्रे परीक्षण के लिए, 0.07 ग्राम वॉन फ्रे फिलामेंट को सीधे चेहरे के केंद्र में और आंखों के बीच रखें।
  9. वॉन फ्रे बालों को "सी" आकार के गठन में मोड़ने के लिए फिलामेंट पर पर्याप्त दबाव लागू करें।
    1. क्षेत्र के साथ संपर्क बनाए रखें कम से कम 3 s लेकिन 5 s से अधिक नहीं या जब तक माउस अपने सिर को वापस नहीं लेता है और अपने पंजे के साथ फिलामेंट पर स्वाइप नहीं करता है।
      नोट: यदि फिलामेंट स्लिप या फिलामेंट की नोक से अधिक परीक्षण के दौरान जानवर को छूता है, तो किसी भी प्रतिक्रिया को नहीं गिना जाना चाहिए। ये प्रतिक्रियाएं ब्रश के जवाब में हो सकती हैं जो विभिन्न मेकानोरिसेप्टर्स द्वारा सक्रिय होती हैं और इसलिए सटीक परिणामों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती हैं।
    2. डिक्सन "अप-डाउन" विधि22,23 के अनुसार वॉन फ्रे फिलामेंट्स लागू करें।
      1. प्रारंभ में, वॉन फ्रे फिलामेंट लागू करें जिसका वजन 0.07 ग्राम है। इस अध्ययन में सबसे कम संभव फिलामेंट और उच्चतम परीक्षण किए गए फिलामेंट क्रमशः 0.008 ग्राम और 0.6 ग्राम के वजन के साथ फिलामेंट्स हैं।
      2. इस परख को करने के लिए 0.008 ग्राम, 0.02 ग्राम, 0.04 ग्राम, 0.07 ग्राम, 0.16 ग्राम, 0.4 ग्राम, और 0.6 ग्राम वजन के फिलामेंट्स का उपयोग करें।
      3. इस विधि में, यदि कोई जानवर फिलामेंट के लिए प्रतिक्रिया प्रदर्शित नहीं करता है, तो अगले उच्च ग्राम वजन के फिलामेंट को लागू करें।
      4. यदि माउस एक फिलामेंट का जवाब देता है, तो उस माउस को उस फिलामेंट के लिए उत्तरदायी माना जाता है। यदि यह मामला है, तो अगले कम ग्राम वजन के फिलामेंट को लागू करें।
      5. इस पैटर्न को दोहराएं जब तक कि प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बाद जानवर का 4 बार परीक्षण नहीं किया जाता है या जानवर को परख में परीक्षण किए गए किसी भी फिलामेंट्स के लिए अनुत्तरदायी होने के लिए निर्धारित किया जाता है।
        नोट: हाथ या कलाई से उपजी किसी भी अतिरिक्त दबाव को लागू करने से बचें। फिलामेंट के अनुप्रयोग का अभ्यास करने के लिए एक पैमाने का उपयोग किया जा सकता है।

4. बेसलाइन वापसी थ्रेसहोल्ड के लिए परीक्षण

  1. एक प्रयोग में शामिल करने से पहले, सुनिश्चित करें कि चूहे 0.5-0.6 ग्राम के बीच एक बेसलाइन निकासी सीमा तक पहुंचते हैं।
    1. एक माउस बेसलाइन तक पहुंचता है यदि वे चरण 3.9.2.2 (0.07 ग्राम, 0.16 ग्राम, 0.4 ग्राम, और 0.6 ग्राम) में उल्लिखित श्रृंखला में परीक्षण किए गए किसी भी फिलामेंट का जवाब देने में विफल रहते हैं।
  2. बेसलाइन निकासी थ्रेसहोल्ड स्थापित करते समय दैनिक चूहों का परीक्षण करें।
    1. परीक्षण जानवरों को परीक्षण की स्थिति और वॉन फ्रे फिलामेंट्स के दबाव के अनुकूल होने की अनुमति देता है।
    2. यदि चूहे अभी भी परीक्षण के तीसरे दिन के बाद बेहद अतिसंवेदनशील हैं, तो फिर से परीक्षण करने से पहले 1 या 2 दिन इंतजार करने का प्रयास करें।
      नोट: परीक्षण के दिनों के बीच बहुत अधिक समय के परिणामस्वरूप जानवर अपने पेरिऑर्बिटल क्षेत्र पर फिलामेंट के वजन को समायोजित करने में विफल हो सकता है, इस प्रकार लक्षित वापसी सीमा तक नहीं पहुंच सकता है।
  3. यह निर्धारित करने से पहले लगभग 7 दिनों के लिए चूहों का परीक्षण करें कि कौन से जानवर एक प्रयोग के लिए शामिल मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं।
    नोट: लगभग 70% चूहे लक्षित आधार रेखा स्तर तक पहुंच जाएंगे।
    1. ड्यूरल उत्तेजना से पहले, किसी भी माउस को बाहर करने के लिए बेसलाइन डेटा का विश्लेषण करें जो 0.5-0.6 ग्राम या उससे अधिक के बेसलाइन मान तक नहीं पहुंचा है।
    2. बहिष्करण के बाद, यादृच्छिक रूप से प्रत्येक शेष माउस को एक परीक्षण समूह को आवंटित करें। एक कप से बाहर ड्राइंग या एक समूह के लिए संख्याओं को यादृच्छिक करने के लिए एक स्प्रेडशीट पर एक स्क्रिप्ट लिखने से इसे प्राप्त करें।

5. वॉन फ्रे परिणामों का विश्लेषण

  1. एक बार प्रतिक्रियाओं की श्रृंखला प्राप्त होने के बाद, डेल्टा, के मान, 50% सीमा, और पहले से प्रकाशित विधियों के अनुसार ग्राम में निकासी सीमानिर्धारित करें।
  2. इस सूत्र का उपयोग करके निकासी थ्रेशोल्ड की गणना करें WT = 10(x* F +B), जहां WT = निकासी थ्रेशोल्ड, F = पंजा निकासी थ्रेशोल्ड Chaplan विधि के माध्यम से गणना की जाती है, और B = लॉग का रैखिक प्रतिगमन (झुकने बल) = x * फिलामेंट संख्या + B।
  3. डेटा को या तो 50% निकासी थ्रेशोल्ड या ग्राम में औसत निकासी थ्रेशोल्ड के रूप में प्लॉट करें।

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Representative Results

इस इंजेक्शन विधि का उपयोग चूहों के ड्यूरा पर उत्तेजनाओं को प्रशासित करने के लिए किया जाता है ताकि बाद में व्यवहार परीक्षण हो सके। इस मॉडल के साथ मापा गया सबसे आम व्यवहार आउटपुट वॉन फ्रे12,13,14 के माध्यम से मूल्यांकन किया गया त्वचीय चेहरे की अतिसंवेदनशीलता है। यहां हम दिखाते हैं कि इस मॉडल का उपयोग माइग्रेन पैथोलॉजी (चित्रा 3) में संभावित सेक्स-विशिष्ट योगदान का आकलन करने के लिए कैसे किया जा सकता है।

इस प्रक्रिया का उपयोग यांत्रिक रूप से उत्पन्न चेहरे की अतिसंवेदनशीलता14 (चित्रा 3) पर ड्यूरल प्रोलैक्टिन (पीआरएल) के प्रभावों की जांच करने के लिए किया गया है। इस अध्ययन के परिणामों से पता चला है कि मादा आईसीआर चूहों ने ड्यूरल प्रोलैक्टिन (चित्रा 3 ए) के 5 μg के जवाब में चेहरे की वापसी थ्रेसहोल्ड को काफी कम कर दिया है। प्रोलैक्टिन (पीआरएल) के 0.5 μg की दस गुना कम खुराक ने भी पीआरएल (चित्रा 3 बी) की उच्च खुराक के समान प्रतिक्रियाओं को दिखाया।

इन इंजेक्शनों को सहज दर्द से संबंधित व्यवहारों का उत्पादन करने के लिए भी दिखाया गया है, जो कि ग्रिमस के माध्यम से मूल्यांकन किए गए हैं। PRL के ड्यूरल 0.5 μg ने मादा चूहों (चित्रा 3 C) में महत्वपूर्ण grimacing का कारण बना, आगे महिला माइग्रेन जैसे व्यवहारों में ड्यूरल PRL के लिए एक स्पष्ट भूमिका का प्रदर्शन किया। हम वॉन फ्रे फिलामेंट्स के साथ सभी परीक्षण करने से पहले grimace assays प्रदर्शन किया.

Figure 1
चित्रा 1: ड्यूरल इनफ्यूज़र और इंजेक्शन प्लेसमेंट( A) इंजेक्टर / इनफ्यूजर में एक संशोधित कैनुला होता है जो ~ 0.5 मिमी - 0.65 मिमी की लंबाई में समायोजित होता है और टाइल टयूबिंग के माध्यम से 10 μL गैस-तंग सिरिंज पर सीमेंटेड सुई से जुड़ा होता है। (बी) माउस के सिर पर चिह्नित इंजेक्शन साइट स्थान का हवाई दृश्य। (C) (बाएँ पैनल) ड्यूरल इंजेक्शन के स्थान का आरेख. इंजेक्शन का प्लेसमेंट लैम्बडोइड के जंक्शन पर होता है और ब्रेग्मा के पीछे लगभग 4.8 मिमी पर सैगिटल टांके होते हैं। (मध्य पैनल) नीले इंजेक्शन डाई के 5 μL के ड्यूरल इंजेक्शन के बाद एक माउस खोपड़ी का पोस्टमार्टम हवाई दृश्य। (दायाँ पैनल) माउस स्कलकैप का मस्तिष्क से पृथक्करण. मस्तिष्क पर नीले इंजेक्शन डाई का कोई अवलोकन योग्य रिसाव नहीं था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वॉन फ्रे परीक्षण कक्षों. (ए) वॉन फ्रे परीक्षण कक्ष एक तार जाल रैक पर रखे ढक्कन के साथ व्यक्तिगत ऐक्रेलिक कक्षों में x 3.5 में 3.5 से बना है। ये 2 पंक्तियों में आयोजित 10 कक्षों के स्तंभों के माध्यम से जुड़े हुए हैं। (बी) वॉन फ्रे परीक्षण कक्षों के अंदर रखे गए उनके व्यक्तिगत कप में चूहों का उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोलैक्टिन के ड्यूरल अनुप्रयोग चूहों में व्यवहारिक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है। महिला चूहों में पीआरएल (5 μg या 0.5 μg) के ड्यूरल आवेदन के बाद यांत्रिक निकासी थ्रेसहोल्ड का मूल्यांकन किया गया था। (ए) पीआरएल के 5 μg का अनुप्रयोग (n = 7 PRL, n = 6 वाहन) वाहन की तुलना में प्रेरित चेहरे की अतिसंवेदनशीलता। (बी) पीआरएल के 0.5 μg का अनुप्रयोग (एन = 5 पीआरएल, एन = 4 वाहन) लंबे समय तक चलने वाले चेहरे की अतिसंवेदनशीलता को प्रेरित करता है। (सी) ग्रिमस का मूल्यांकन उसी चूहों में भी किया गया था जो प्रत्येक समय बिंदु पर पीआरएल के 0.5 μg के साथ इलाज किया गया था। इन चूहों ने वाहन के साथ इलाज किए गए चूहों की तुलना में काफी अधिक गंभीर स्कोर का प्रदर्शन किया। सांख्यिकी: दो तरह से एनोवा Bonferroni एकाधिक तुलना पोस्ट-हॉक विश्लेषण के बाद के बाद. डेटा को SEM ± साधन के रूप में दर्शाया जाता है। * p < 0.05, ****p < 0.0001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ड्यूरा में स्थानीय nociceptive प्रणाली में maladaptive परिवर्तन ऊतक चोट25,26 की कमी के बावजूद माइग्रेन के हमलों के सिरदर्द चरण के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता माना जाता है। यहां अध्ययन एक ऐसी विधि प्रस्तुत करता है जिससे ड्यूरा की न्यूनतम इनवेसिव उत्तेजना चेहरे के स्पर्श अतिसंवेदनशीलता को प्रेरित कर सकती है। क्रैनियम और ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना ड्यूरल नोसिसेप्टर सक्रियण में शामिल तंत्र और घटनाओं को स्पष्ट करना एक प्रीक्लिनिकल मॉडल में माइग्रेन तंत्र को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित कर सकता है।

क्रैनियोटॉमी और कैनुला आरोपण का उपयोग लंबे समय से उन कार्यों और तंत्रों का आकलन करने के लिए किया जाता है जो माइग्रेन के दर्दमें योगदान करते हैं 11,12। हालांकि, यह बताया गया है कि एक क्रैनियोटॉमी ड्यूरल मास्ट कोशिकाओं के सक्रियण को प्रेरित कर सकता है और कृन्तकों में पियाल संवहनी पारगम्यता को बढ़ा सकताहै। यह देखते हुए कि ड्यूरा में मस्तूल सेल सक्रियण अत्यधिक माइग्रेन 7,8,28,29 में फंसा हुआ है, इस तकनीक में प्रमुख चेतावनी हैं जो व्याख्या को तिरछा कर सकती हैं। सैगिटल और लैम्बडोइडल टांके के जंक्शन के माध्यम से पदार्थों का प्रशासन प्रभावी रूप से क्रैनियोटॉमी-प्रेरित मस्तूल सेल सक्रियण द्वारा मध्यस्थता वाले नोसिसेप्टर्स के सक्रियण को कम करता है। इसके अलावा, गैर-इनवेसिव ड्यूरल उत्तेजना को पोस्ट-सर्जिकल रिकवरी और एनाल्जेसिक के प्रशासन की आवश्यकता नहीं होती है जो परिणामों की व्याख्या को बदल सकती है। ड्यूरा पर पदार्थों का स्थानीय अनुप्रयोग शोधकर्ताओं को इस विशिष्ट लक्ष्य ऊतक पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है, जैसा कि दवाओं के प्रणालीगत प्रशासन के विपरीत है जहां कार्रवाई की साइट आसानी से निर्धारित नहीं की जाती है 12,13,14। जबकि नाइट्रोग्लिसरीन और कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड जैसे पदार्थों का प्रणालीगत प्रशासन मनुष्यों में प्रयोगात्मक हमलों को ट्रिगर करता है जो माइग्रेन के समान हैं, वे कृंतक मॉडल में कार्रवाई के स्थान के मूल्यांकन की अनुमति नहीं देते हैं; अधिक लक्षित ऊतक-विशिष्ट मॉडल एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

यहां वर्णित इस तकनीक में जंक्शन के माध्यम से मेनिंग्स के ड्यूरा मेटर पर सीधे एक दवा या अन्य समाधान को इंजेक्ट करना शामिल है जहां खोपड़ी के सैगिटल और लैम्बडोइडल टांके मिलते हैं। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, आईसीआर (सीडी -1) या 6-8 सप्ताह की आयु के सी 57 / बीएल 6 चूहों का उपयोग इन प्रयोगों के लिए किया जाना चाहिए। छोटे चूहों का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, आईसीआर (सीडी -1) चूहों का उपयोग जो 8 सप्ताह से अधिक उम्र के हैं, की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि उनकी खोपड़ी प्लेट टांके आमतौर पर इस उम्र तक पूरी तरह से जुड़े होते हैं, जिससे खोपड़ी को नुकसान पहुंचाए बिना इंजेक्शन लगाना असंभव हो जाता है। प्रत्येक माउस के वजन / आकार पर विचार करना भी महत्वपूर्ण है जो इस प्रक्रिया से गुजरेगा। यह अनुशंसा की जाती है कि ये इंजेक्शन उन जानवरों पर किए जाते हैं जिनका वजन 19 ग्राम से अधिक होता है क्योंकि खोपड़ी आमतौर पर कम वजन पर बहुत पतली होती है और इंजेक्शन के दौरान लागू दबाव का सामना नहीं कर सकती है। महत्व के, ऐसे संभावित कारक भी हैं जो उम्र / वजन में योगदान करते हैं जिस पर खोपड़ी प्लेट संलयन होता है (उदाहरण के लिए, पशु सुविधाओं में उपयोग की जाने वाली लैब चाउ की संरचना)। इसलिए, प्रयोगकर्ताओं को अपनी शर्तों के तहत उपयुक्त आयु / वजन सीमा निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। अन्य माउस उपभेदों या जीनोटाइप के लिए विभिन्न आयु सीमाओं और जानवरों के वजन की आवश्यकता हो सकती है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि खोपड़ी की प्लेटें उन जानवरों में फ्यूज होती हैं, और इंजेक्शन के अनुकूलन की भी आवश्यकता हो सकती है।

इस तकनीक को सीखते या अभ्यास करते समय, यह अत्यधिक अनुशंसित है कि euthanized चूहों में सिवनी जंक्शन का पता लगाने के साथ आराम का एक स्तर प्राप्त किया जाता है। इन चूहों में खोपड़ी के साथ पहले अभ्यास करना सबसे अच्छा हो सकता है या छील दिया जा सकता है और धीरे-धीरे त्वचा के माध्यम से जंक्शन का पता लगाने के लिए आगे बढ़ना चाहिए। एक बार सटीक स्थान स्थापित करने के बाद, इंजेक्शन के स्थान की सटीकता और गहराई को सत्यापित करने के लिए स्याही और रंजक को ड्यूरा में इंजेक्ट किया जा सकता है। इस तकनीक को आईसीआर (सीडी -1) चूहों (30-35 ग्राम) और सी 57 / बीएल 6 चूहों (25-30 ग्राम) का उपयोग करके विकसित और अनुकूलित किया गया था। 0.5-0.6 मिमी की एक इन्फ्यूजर लंबाई 25-35 ग्राम की सीमा के भीतर वजन वाले माउस को इंजेक्ट करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, इनफ्यूज़र की लंबाई को कैलिब्रेट करने की आवश्यकता हो सकती है यदि इस तकनीक को अनुकूलित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों से काफी अलग चूहों को इंजेक्ट करना। उदाहरण के लिए, 25 ग्राम से छोटे माउस के परिणामस्वरूप एक इंफ्यूजर का उपयोग होगा जिसकी लंबाई 0.5 मिमी से कम है। इस तकनीक में महारत हासिल करने पर और जब उम्र-उपयुक्त चूहों में प्रदर्शन किया जाता है, तो इस इंजेक्शन की सफलता दर 100% के करीब हो सकती है; हालांकि, इंजेक्शन के साथ जटिलताएं इन्फ्यूजर डालने के लिए बहुत अधिक बल लगाने के साथ-साथ मेनिंगियल रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाने के कारण असामान्य रक्तस्राव के कारण खोपड़ी को तोड़ने जैसे मुद्दों से स्टेम हो सकती हैं।

स्पर्श संवेदनशीलता में परिवर्तन एक महत्वपूर्ण माप है जब कृन्तकों में दर्द व्यवहार का आकलन किया जाता है। यहां हम एक प्रीक्लिनिकल माइग्रेन मॉडल में इन व्यवहारों का आकलन करने के लिए पेरिऑर्बिटल वॉन फ्रे परीक्षण के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। माइग्रेन मॉडल में इस तकनीक का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि हम सिर की अतिसंवेदनशीलता का आकलन कर सकते हैं, जिसकी अन्य गैर-कपाल स्थानों जैसे पंजे की तुलना में अधिक प्रासंगिकता है। पुनरुत्पादक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि चूहों को पूरी तरह से बेसलाइन किया गया है। इसके लिए एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित प्रयोगकर्ता की आवश्यकता होगी जो वॉन फ्रे फिलामेंट्स को ठीक से लागू कर सकता है। यह संभावना है कि एक जानवर को बेसलाइन तक पहुंचने में लगभग 7 दिन लगेंगे। हालांकि, यह संभव है कि हर जानवर लक्षित आधार रेखा तक नहीं पहुंचेगा। हमारे अनुभव में, चूहों के साथ काम करने के लगभग 7 दिनों के बाद, केवल 60% -70% जानवर पेरिऑर्बिटल क्षेत्र में 0.6 ग्राम की आधार रेखा तक पहुंच जाएंगे, लेकिन यह जानवरों के समूह पर निर्भर है। इस समय पर एक प्रयोग शुरू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ड्रॉपआउट के लिए पर्याप्त संख्या का उपयोग किया जाता है और यह कि जानवर ड्यूरा को उत्तेजित करने के लिए इस गैर-इनवेसिव विधि का उपयोग करने के लिए उचित उम्र पोस्ट-बेसलाइन हैं। एक आधार रेखा निर्धारित करने के लिए चरणों को प्रोटोकॉल अनुभाग 4 में रेखांकित किया गया है।

वॉन फ्रे परीक्षण के लिए एक सीमा यह है कि दर्द प्रतिक्रियाओं और नियमित सौंदर्य / खुजली के बीच अंतर करना मुश्किल हो सकता है। सौंदर्य से दर्द को अलग करने में मदद करने के लिए, यह व्यवहार होने वाले समय की लंबाई को नोटिस करना महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, एक दर्द प्रतिक्रिया फिलामेंट एप्लिकेशन के बाद एक स्वाइप होती है, जबकि सौंदर्य व्यवहार लंबे समय तक होते हैं और कई सेकंड से मिनटों तक रह सकते हैं। यदि सौंदर्य/खुजली व्यवहार को एक अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया से अलग नहीं किया जा सकता है, तो इसे प्रतिक्रिया के रूप में रिकॉर्ड नहीं करना सबसे अच्छा है। इसके अतिरिक्त, अनुचित फिलामेंट प्लेसमेंट (जैसे, फिलामेंट फिसलने) के परिणामस्वरूप जानवर के लंबे समय तक संवारने में परिणाम हो सकता है, जिससे ठीक से परीक्षण करना मुश्किल हो जाता है। यदि ऐसा होता है, तो प्रयोगकर्ता को तब तक इंतजार करना चाहिए जब तक कि सौंदर्य बंद नहीं हो जाता है और माउस परीक्षण करने के लिए पर्याप्त शांत होता है। सौंदर्य व्यवहार की शुरुआत से पहले उपयोग किए जाने वाले एक ही फिलामेंट से जारी रखें। यदि माउस समय के बहुत लंबे मुकाबलों के लिए जारी रहता है, तो माउस को लगभग 5 मिनट के लिए परीक्षण कक्ष में वापस रखें। एक बार जब 5 मिनट बीत जाते हैं, तो माउस को फिर से परीक्षण करने का प्रयास करें। यदि यह व्यवहार बिना किसी समाधान के जारी रहता है, तो चूहों को अध्ययन से हटा दिया जाना चाहिए। महत्व की बात है, चेहरे पर फर को शेव करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या माउस त्वचा बालों को हटाने के बाद एक ही संवेदनशीलता को बनाए रखती है, और बालों को हटाने की प्रक्रिया (शेविंग, डिपिलेटरी क्रीम) भी त्वचा की संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकती है।

ज्यादातर स्थितियों में, माउस के बेसलाइन तक पहुंचने के बाद 24 घंटे से अधिक नहीं ड्यूरा पर पदार्थों को प्रशासित करने के लिए आदर्श है। यह अनुशंसा की जाती है कि चूहों को प्रति घंटे एक बार वॉन फ्रे फिलामेंट परीक्षण के अधीन किया जाता है। यदि संभव हो, तो हर दूसरे घंटे का परीक्षण जानवरों को परीक्षण के बाद शांत होने के लिए पर्याप्त समय देता है। इसके अतिरिक्त, प्रयोगों को उनके सर्कैडियन पैटर्न के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए समय दिया जाना चाहिए। चूहों में सर्कैडियन लय में परिवर्तन व्यवहारिक फेनोटाइप को बदल सकते हैं और अंततः अपरिवर्तनीय परिणामों में परिणाम दे सकते हैं।

Periorbital वॉन फ्रे परीक्षण प्रयोगात्मक निष्कर्षों को मजबूत करने के लिए अन्य व्यवहार assays के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। ग्रिमस स्केल18,19 प्रतिक्रियाओं के बजाय कृन्तकों में सहज चेहरे के भावों पर निर्भर करता है। तीव्र दर्द व्यवहार का आकलन और परिमाणित करते समय इस विधि में उच्च सटीकता और विश्वसनीयता होती है और माइग्रेन12,30 के कई प्रीक्लिनिकल मॉडल में उपयोग किया गया है। जब दोनों grimace और periorbital वॉन Frey assays का उपयोग कर, प्रयोगकर्ता माउस के periorbital क्षेत्र के लिए वॉन Frey फिलामेंट्स के आवेदन से पहले grimace के लिए स्कोरिंग पर विचार करना चाहिए. यह सुनिश्चित करता है कि grimacing व्यवहार सहज है और फिलामेंट आवेदन द्वारा उत्पन्न नहीं है। Hindpaw यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता भी periorbital वॉन Frey परीक्षण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. ग्रिमस स्कोरिंग के विपरीत, हिंद पंजा अतिसंवेदनशीलता का आकलन करने से पहले चेहरे की अतिसंवेदनशीलता का परीक्षण करना सबसे अच्छा है। Hindpaw परीक्षण की आवश्यकता है कि माउस periorbital वॉन Frey परीक्षण पूरा होने के बाद कप के बिना कक्ष में वापस रखा जाता है।

अंत में, पेरिऑर्बिटल वॉन फ्रे परीक्षण और चूहों में गैर-इनवेसिव ड्यूरल उत्तेजना माइग्रेन के प्रीक्लिनिकल मॉडल की वर्तमान सीमा में मूल्यवान विकल्प जोड़ती है। जब सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो यह तकनीक कृन्तकों में सिरदर्द जैसी फेनोटाइप उत्पन्न करने के लिए एक परिष्कृत दृष्टिकोण प्रस्तुत करती है, क्योंकि इसे कैनुला के सर्जिकल आरोपण की आवश्यकता नहीं होती है। चूहों में, कैनुला जीवाणु संक्रमण के लिए प्रवण होते हैं, भरे हुए हो सकते हैं, गिर सकते हैं, और प्रत्येक जानवर को एकल-स्थित होने की आवश्यकता होती है, जिससे जानवर पर अनावश्यक तनाव पैदा होता है। इसके अलावा, ड्यूरल उत्तेजना प्रोटोकॉल को आसानी से कई दवा अनुप्रयोगों के साथ उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। Periorbital वॉन फ्रे परीक्षण प्रतिमान भी सबसे अच्छा प्रयोगात्मक विनिर्देशों फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पेरिऑर्बिटल वॉन फ्रे परीक्षण का उपयोग अन्य ओरोफेशियल दर्द विकारों में किया जा सकता है। ये तकनीकें माइग्रेन दर्द के जटिल अंतर्निहित तंत्र को समझने में मदद करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NS104200 और NS072204 से GD) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा 173 माइग्रेन dura मेटर चेहरे अतिसंवेदनशीलता गैर आक्रामक उत्तेजना व्यवहार
Dural उत्तेजना और Periorbital वॉन Frey सिर दर्द के एक Preclinical मॉडल के रूप में चूहों में परीक्षण
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Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

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