Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.
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Artículo de método
Inmunotinción flotante de cerebros de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La tinción inmunohistoquímica de cerebros de ratón es una técnica rutinaria comúnmente utilizada en neurociencia para investigar los mecanismos centrales subyacentes a la regulación del metabolismo energético y otros procesos neurobiológicos. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados de histología cerebral pueden variar entre los laboratorios. Para cada experimento de tinción, es necesario optimizar los procedimientos clave en función de las diferencias en especies, tejidos, proteínas objetivo y las condiciones de trabajo de los reactivos. Este documento demuestra un flujo de trabajo confiable en detalle, que incluye perfusión intraaórtica, seccionamiento cerebral, inmunotinción flotante, montaje de tejidos e imágenes, que pueden ser seguidos fácilmente por investigadores en este campo.
También se discute cómo modificar estos procedimientos para satisfacer las necesidades individuales de los investigadores. Para ilustrar la fiabilidad y eficiencia de este protocolo, las redes perineuronales se tiñeron con aglutinina Wisteria florbunda marcada con biotina (WFA) y arginina vasopresina (AVP) con un anticuerpo anti-AVP en el cerebro del ratón. Finalmente, se han abordado los detalles críticos para todo el procedimiento, y las ventajas de este protocolo en comparación con las de otros protocolos. En conjunto, este artículo presenta un protocolo optimizado para la inmunotinción flotante del tejido cerebral del ratón. Seguir este protocolo hace que este proceso sea más fácil para los científicos junior y senior para mejorar la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de los estudios de inmunotinción.
Introducción
La prevalencia de obesidad y comorbilidades asociadas ha alcanzado niveles epidémicos, causando una tremenda carga socioeconómica1,2. Se han desarrollado diversos modelos de ratón para comprender mejor los procesos biológicos responsables de la obesidad3,4. Debido a que los mecanismos centrales son importantes para la regulación de la homeostasis energética en estos modelos animales, los estudios neuroanatómicos de cerebros de ratón se han convertido en una técnica necesaria en este campo. Sin embargo, la calidad, confiabilidad y reproducibilidad de la....
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Protocolo
En el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos (8-16 semanas de edad). El cuidado de todos los animales y todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Baylor College of Medicine.
1. Perfusión
NOTA: Los pasos 1.1 a 1.6 se realizan en una campana extractora de humos.
- Anestesia
- Vierta 5 ml de isoflurano (consulte la Tabla de materiales) sobre una toalla de papel colocada en la parte inferior de un desecador. Introduzca el ratón en la barrera agujereada dentro del desecador y espere h....
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Resultados
El diagrama de flujo de este protocolo se ilustra brevemente en la Figura 1. El procedimiento de crioseccionamiento de este laboratorio se demuestra en la Figura 2A, en la que se seccionaron 5 muestras de cerebro simultáneamente. El montaje de las secciones cerebrales se muestra en la Figura 2B, y una diapositiva completamente montada con secciones cerebrales se ilustra en la Figura 2C. En
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Discusión
Este protocolo proporciona un método establecido para estudios neuroanatómicos del cerebro del ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento de tejido, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes. Sin embargo, se deben optimizar algunos detalles clave esenciales para obtener resultados consistentes y confiables.
La calidad de la perfusión es fundamental para una tinción exitosa. Los resultados de las tinciones podrían verse afectados si la sangre permanece en el cerebro, .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los investigadores fueron apoyados por subvenciones de los NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 y R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) y American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Flour 594 burro anti-conejo IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% de sacarosa | VWR | 470302 | 30 g de sacarosa disputada en 100 mL de PBS |
| Formalina tamponada neutra | VWR | 16004-128 | 10%, 25 & deg; C, pH 6,8-7,2 |
| Jeringa Sub-Q de 1 mL | BD | 309597 | |
| 48 pocillos placa de cultivo celular | Corning | 3548 | |
| pocillos placa de cultivo celular | Corning | 3516 | |
| Medios de montaje antidecoloración con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Desecador de plástico esterilizable en autoclave | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| Anticuerpo AVP | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Filtro de células | Tampón | ||
| Corning Preferencia del usuario | No aplicable | 20% de glicerol, 30% de etilenglicol y 50% de PBS | |
| Isoflurano | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Microscopio DFC310FX Leica | Leica | No aplicable | |
| Cajas de portaobjetos para microscopio (50 plazas) | VWR | No aplicable | |
| PBT | Preferencia del usuario | No aplicable | 2,5 mL de Triton X-100 disuelto en 1000 mL de PBS |
| Perfusión dos sistemas de perfusión automatizados | Leica | 39471005 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 ° C, pH 7,3-7,5, 1x composición:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Tampón de fosfato |
| Microtomo deslizante Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Cloruro de sodio | RICCA Chemical | 7220-32 | 0,9%, 25 & deg; C, pH 7.4 |
| Proteína Estreptavidina, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| Anticuerpo WFA | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | No aplicable | |
| Software | software de escáner |
Referencias
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The Am....
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Reimpresiones y permisos
