Artículo de método

Clasificación celular activada por fluorescencia-tejido tratado con radioligando (FACS-RTT) para determinar el origen celular de la señal radiactiva

DOI:

10.3791/62883

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10 de septiembre de 2021

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1Division of Adult Psychiatry, Department of Psychiatry, University Hospitals of Geneva, 2Department of Psychiatry, University of Geneva, 3Division of Nuclear medicine and Molecular Imaging, University Hospitals of Geneva, 4Division of Radiation Oncology, Department of Oncology, University Hospitals of Geneva, 5Department of Brain Sciences, Faculty of Medicine, Imperial College London

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) es una poderosa herramienta para estudiar el papel de la proteína translocadora de 18 kDa o la expresión del receptorserotonina 5HT 2A en la enfermedad de Alzheimer a escala celular. Este protocolo describe la aplicación ex-vivo de FACS-RTT en el modelo de rata TgF344-AD.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células gliales probablemente tienen una implicación considerable en la fisiopatología de los trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA). Sus alteraciones están quizás asociadas a un estado proinflamatorio. La cepa de rata TgF344-AD ha sido diseñada para expresar los genes humanos APP y PS1ΔE9 humanos, codificando para las proteínas amiloides Aβ-40 y Aβ-42 y muestra patología amiloide y déficits cognitivos con el envejecimiento. El modelo de rata TgF344-AD se utiliza en este estudio para evaluar el origen celular de la unión a la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO, un marcador de activación de células gliales) y los niveles del receptor de serotonina 5HT2A (5HT2AR) que posiblemente se interrumpen en la EA. La técnica que aquí se presenta es Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), una técnica cuantitativa específica de tipo celular complementaria a las técnicas in vivo de PET o SPECT o autorradiografía ex vivo/in vitro . Cuantifica el mismo trazador radiomarcado utilizado anteriormente para la obtención de imágenes, utilizando un contador de γ después de la clasificación celular por citometría. Esto permite determinar el origen celular de la proteína radiomarcada con alta especificidad y sensibilidad celular. Por ejemplo, los estudios con FACS-RTT mostraron que (i) el aumento en la unión a TSPO se asoció con microglia en un modelo de rata de neuroinflamación inducida por lipopolisacáridos (LPS), (ii) un aumento en la unión a TSPO a los 12 y 18 meses se asoció con astrocitos primero, y luego microglia en las ratas TgF344-AD en comparación con ratas de tipo salvaje (WT), y (iii) la densidad estriatal de 5HT2A R disminuye en los astrocitos a los 18 meses en el mismo modelo de EA de rata. Curiosamente, esta técnica se puede extender a prácticamente todos los radiotrazadores.

Introducción

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Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), se caracterizan por una pérdida neuronal asociada con un aumento de los síntomas. La EA, la causa más común de demencia, que representa el 60%-70% de los casos, afecta a alrededor de 50 millones de personas en todo el mundo1. A nivel neuropatológico, las dos características principales de la EA son la acumulación de placas extracelulares de β amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares de Tau. Las alteraciones de las células gliales también se han asociado con la EA2 y la posible interrupción de varios sistemas de neurotransmisores 3,4.

La línea de ratas TgF344-AD ha sido modificada para modelar AD expresando transgenes humanos APP y PS1ΔE9, lo que lleva a la expresión soluble e insoluble de Aβ-40 y Aβ-42 y a la formación de placa amiloide5. También presenta la acumulación de formas hiperfosforiladas de la proteína Tau que conducen a la tauopatía. A partir de los 9-24 meses de edad, las ratas desarrollan progresivamente las señas de identidad patológicas de la EA y un deterioro cognitivo 5,6,7,8,9.

La tomografía por emisión de positrones (PET), la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y la autorradiografía son técnicas basadas en la emisión y cuantificación de rayos γ. Los radiotrazadores se cuantifican in vivo (PET y SPECT) o ex vivo/in vitro (autorradiografía). Esas técnicas sensibles han contribuido a la comprensión de los mecanismos de varias enfermedades cerebrales, como la EA. De hecho, en términos de neuroinflamación, hay muchos estudios que evalúan la proteína translocadora de 18 kDa (TSPO), un marcador de neuroinflamación in vivo, con trazadores radiomarcados como [11C]-(R)-PK11195 o [11C]PBR28 (para revisión ver10). Además, se han estudiado alteraciones de los sistemas de neurotransmisores utilizando radiotrazadores 11,12,13.

Sin embargo, esas técnicas no determinan el origen celular de la señal radiactiva. Esto podría dificultar la interpretación de los fundamentos biológicos de la alteración en la unión de un radioligando en PET/SPECT. Por ejemplo, en el caso de los estudios de neuroinflamación de TSPO, comprender si el aumento o la disminución de TSPO se debe a cambios astrocíticos o microgliales es de suma importancia. La técnica Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) se desarrolló para solucionar estos problemas, permitiendo la evaluación de la unión de radioligando en cada tipo de célula por separado y la cuantificación de la densidad de proteína objetivo por célula. Esta innovadora técnica es, en consecuencia, complementaria y altamente compatible con las imágenes PET y SPECT.

Aquí, esta técnica se aplicó a lo largo de dos ejes: el estudio de la neuroinflamación utilizando radioligandos específicos de TSPO y la evaluación del sistema serotoninérgico. En el primer eje, el objetivo fue comprender el origen celular de la señal TSPO en respuesta a una reacción inflamatoria aguda. Por lo tanto, FACS-RTT se utilizó en los tejidos cerebrales de ratas después de la inducción de la neuroinflamación a través de una inyección de lipopolisacáridos (LPS) y después de un estudio de imágenes IN VIVO [125I]CLINDE SPECT. Además, se aplicaron las mismas imágenes y el protocolo FACS-RTT en ratas TgF344-AD de 12 y 24 meses de edad y ratas de tipo salvaje (WT) coincidentes. El segundo eje tuvo como objetivo determinar el origen de las alteraciones del sistema serotoninérgico en este modelo de rata a través de la evaluación ex vivo de la densidad 5-HT2AR por tipo de célula.

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité de Ética para la Experimentación Humana y Animal del Cantón de Ginebra, la Comisión Cantonal de Ética de la Investigación (CCER) y la Dirección General de Salud del Cantón de Ginebra (Suiza), respectivamente. Los datos se informan siguiendo las pautas de Investigación en Animales: Informes de Experimentos In-vivo (ARRIVE).

1. Preparación y calibración de la cámara SPECT

  1. Encienda la cámara, cargue el software operativo (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en el botón Home XYZ Stage para realizar el homing.
  2. Configure el experimento compuesto por una adquisición de escaneo de 10 minutos. Establezca el modo Step en Fine y el modo Acquisition en Listmode (para registrar todo el espectro de emisión).
  3. Configure la cama y asegúrese de que el sistema de calentamiento, el sensor de respiración y la anestesia sean funcionales y seguros (Figura 1A-D). Luego, coloque un fantasma (es decir, 2 ml de una concentración conocida de 125I en un tubo de microfuge de 2 ml) donde se colocará la cabeza del animal (centrada en el área, Figura 1E).
  4. Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores para las tres dimensiones con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla. Asegúrese de que el volumen de escaneo del fantasma y el animal sea el mismo.
  5. Inicie el escaneo fantasma para su posterior calibración con los parámetros establecidos en los pasos 1.2-1.4.

2. Configuración del espacio de trabajo para imágenes SPECT

  1. Limpie el espacio de trabajo con virucida desinfectante y coloque papeles blandos en todas las superficies.
  2. Asegúrese de que haya suficiente isoflurano y oxígeno en sus respectivos tanques.
  3. Prepare un catéter de 24 G cortando las aletas del catéter de mariposa para tener una visión más clara de la vena de la cola de rata.
  4. Cubra el catéter llenándolo completamente con solución de heparina (25000 U/mL) después de retirar la aguja. Luego, vuelva a colocar la aguja en ella para evitar la formación de coágulos de sangre después de la inserción del catéter.

3. [125I]Síntesis del radiotrazador CLINDE

PRECAUCIÓN: La radiactividad puede tener suficiente energía ionizante para afectar a los átomos de las células vivas y dañar su material genético (ADN).

  1. Asegurarse de trabajar en un entorno apropiado, autorizado para experimentos que involucren radiactividad.
    NOTA: Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado para el manejo de la radiactividad, incluidos los dosímetros de dedos y cuerpo. Trate de mantenerse a una distancia segura de cualquier fuente de radiactividad.
  2. Incubar 100 μg de precursor de tributilina en 100 μL de ácido acético con yoduro de sodio (Na125I) (ver Tabla de Materiales) y 5 μL de ácido peracético al 37% a 70 °C durante 20 min en un termociclador colocado en una guantera.
  3. Diluir la reacción utilizando 50% de acetonitrilo (ACN) en agua para alcanzar un volumen de 500 μL. Inyectar los 500 μL de la reacción diluida en una columna de fase inversa (ver Tabla de Materiales).
  4. Aísle el [125I]CLINDE con un hpLC de gradiente lineal que se ejecuta desde 5%-95% ACN en 7 mM H3PO4 durante 10 min. Diluya el aislado en H2O para alcanzar un volumen final de 10 ml, y luego inyecte la reacción diluida en una columna de concentración (consulte la Tabla de materiales).
  5. Eluya el [125I]CLINDE de la columna con 300 μL de etanol absoluto, y luego evapore el etanol incubándolo en una centrífuga al vacío en RT durante 40 min.
  6. Diluir el residuo que contiene el [125I]CLINDE en 300 μL de solución salina estéril para crear una solución madre.
  7. Después de medir su radiactividad, diluir la solución madre en solución salina estéril para obtener una solución de 0,037 MBq en 500 μL.
  8. Purificar el trazador mediante HPLC (Cromatografía líquida de alto rendimiento). Determine el tiempo de elución utilizando una calibración estándar a 450 nm y aísle el pico radiactivo único. Realizar la curva de calibración estándar utilizando siete concentraciones estándar de CLINDE frío (no radiactivo) (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg y 5 μg en 400 μL de una solución de ACN al 50%). Establecer la pureza radioquímica midiendo un solo pico en radio TLC (Cromatografía de Capa Fina). Asegúrese de que la pureza del radioquímico sea superior al 60%.
  9. Comprobar la actividad específica del radioligando midiendo la absorbancia ultravioleta a 450 nm y las curvas de calibración establecidas con compuestos de referencia en frío. Asegúrese de que la actividad específica sea superior a 1000 GBq/μmol.

4. [125I]R91150 síntesis de radiotrazadores

NOTA: Asegúrese de seguir las mismas reglas de seguridad que se mencionan en la sección de síntesis de CLINDE.

  1. Mezclar 300 μg de precursor R91150 en una solución de 3 μL de etanol absoluto, 3 μL de ácido acético glacial, 15 μL de Na125I libre de portadores (ver Tabla de Materiales) (10 mCi) en 0,05 M NaOH y 3 μL de 30% H2O2. Incubar durante 30 min en una guantera.
  2. Inyecte toda la reacción en una columna de fase inversa (consulte la Tabla de materiales).
  3. Aislar [125I]R91150 por funcionamiento isocrático de HPLC (ACN/agua 50/50, tampón de ácido acético de 10 mM) con un caudal de 3 mL/min.
  4. Diluir [125I]R91150 en H2O para un volumen final de 10 mL.
  5. Inyecte 10 ml de la reacción diluida en una columna de concentración (consulte la Tabla de materiales).
  6. Elute [125I]R91150 de la columna con 300 μL de etanol absoluto.
  7. Evaporar el etanol incubándolo en una centrífuga al vacío en RT durante 40 min.
  8. Diluir el residuo que contiene [125I]R91150 en 300 μL de solución salina.
  9. Purificar el trazador mediante HPLC. Determine el tiempo de elución utilizando una calibración estándar a 450 nm y aísle el pico radiactivo único. Establezca la pureza radioquímica midiendo un solo pico en radio TLC. Asegúrese de que la pureza del radioquímico sea superior al 98%.

5. Preparación animal

  1. Pesar y anestesiar la rata TgF344-AD (macho o hembra, de 2-24 meses de edad) en una cámara de inducción con 3% de isoflurano. Una vez anestesiado profundamente, reduzca el flujo de isoflurano al 2% (0,4 L/min, 100% O2) en la cámara.
  2. Coloque al animal en una cama precalentada equipada con una anestesia nosecone. Mantener el isoflurano al 2% (0,4 L/min, 100% O2).
  3. Aplique lubricante de gel para los ojos en los ojos del animal y confirme la profundidad de la anestesia a través de la monitorización respiratoria; ajustar la anestesia si es necesario.
  4. Realizar la inserción del catéter de 24 G en la vena de la cola.

6. Adquisición de SPECT

  1. Transfiera el animal a la cama de la cámara equipada con una almohadilla térmica de temperatura controlada a 38 ° C (Figura 1E).
  2. Asegure la cabeza del animal en la barra de mordida y fije los soportes de la cabeza.
  3. Configure el experimento en un escaneo de 60 minutos que constituye 60 cuadros de 1 minuto. Reutilice todos los demás parámetros configurados en el paso 1. Haga clic en el botón Actualizar imagen para actualizar la posición del animal.
  4. Ajuste el área de escaneo deslizando los cursores con la ayuda de las tres imágenes en la parte inferior de la pantalla para las tres dimensiones.
  5. Inyecte 500 μL del radiotrazador radiactivo ([125I]CLINDE o [125I]R91150) y, a continuación, enjuague el tubo con 300 μL de NaCl estéril al 0,9%. Haga clic simultáneamente en Iniciar adquisición para iniciar el escaneo.
  6. Durante el tiempo de escaneo, asegúrese de mantener al animal bajo anestesia constante con monitoreo de la frecuencia respiratoria. Ajuste el flujo de isoflurano si es necesario.
  7. Una vez que termine la exploración, eutanasia rápidamente al animal anestesiado por decapitación.

7. Reconstrucción del escaneo

  1. Abra el software de reconstrucción del análisis (consulte Tabla de materiales) y, a continuación, abra el conjunto de datos, buscando el archivo [filename].parameters, creado en la carpeta del análisis.
  2. Seleccione el isótopo de interés. Tenga en cuenta que el parámetro Listmode permite la selección de varios isótopos en este paso.
  3. Seleccione los siguientes parámetros: tamaño de vóxel de 0,4 mm, 4 subconjuntos (POS-EM), 6 iteraciones (equivalente a 24ME-EM), sin postfiltro y el isótopo correspondiente corrección de desintegración. Seleccione el formato de salida de NIfTI y, a continuación, seleccione Iniciar reconstrucción SPECT .

8. Extracción del cerebro de la rata

  1. En el mismo evento anestésico que el procedimiento de exploración y después de asegurar el estado de anestesia profunda del animal mediante el monitoreo de su frecuencia respiratoria, proceda a la decapitación por guillotina y transfiera rápidamente la cabeza al banco de disección.
  2. Con tijeras, corte cuidadosamente la piel en la parte superior de la cabeza desde la parte posterior hasta el frente hasta la mitad de los ojos.
  3. Corte el exceso de músculos alrededor de la base del cráneo y las vértebras cervicales.
  4. A continuación, coloque cuidadosamente una hoja de las tijeras en el orificio en la parte posterior del cráneo, el foramen magnum, y retire la parte posterior del cráneo con alicates quirúrgicos.
  5. Luego, con alicates quirúrgicos, retire cuidadosamente la parte superior del cráneo. El cráneo de las ratas macho viejas puede ser grueso, eliminar como pequeños trozos para evitar daños en el cerebro.
  6. Corta cuidadosamente las meninges con tijeras. Las meninges pueden dañar el cerebro durante el proceso de extracción; retírelo como medida de precaución.
  7. Después de extraer la parte superior del cráneo, gire la cabeza del animal alrededor y, con una pequeña espátula plana, extraiga cuidadosamente el cerebro cortando los nervios óptico y trigémino.
  8. Transfiera cuidadosamente el cerebro a una superficie de vidrio plana y limpia para la disección en hielo.
  9. Use una espátula de metal plana y una cuchilla de afeitar para diseccionar las regiones de interés del cerebro. Coloque los tejidos en un tubo centrífugo de 2 ml y pese el tejido obtenido. Use la sección cerebral directamente para el aislamiento celular o congélela rápidamente en nitrógeno líquido para su uso posterior.

9. Aislamiento celular

  1. Asegúrese de trabajar en un ambiente limpio y estéril. Se recomienda trabajar bajo un gabinete de bioseguridad (BSC) de clase II. Asegúrese de que los guantes y cada pieza de equipo introducida en el BSC sean estériles.
  2. Para preparar las células para la clasificación celular, siga el protocolo de Jaclyn M. Schwarz14.
    NOTA: En este experimento, se utilizó un kit de disociación neuronal disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) para la preparación celular.
    1. Coloque las muestras en un tubo centrífugo de 2 ml con 1 ml de HBSS (libre de Ca y Mg), y luego centrífuga (300 x g, 2 min, temperatura ambiente = RT) y retire el sobrenadante sin molestar el pellet.
    2. Añadir 1900 μL de mezcla de enzimas-1 e incubarlo durante 15 min a 37 °C mientras agitamos los tubos por inversión cada 5 min.
    3. Agregue 30 μL de mezcla de enzimas-2, agite suavemente con la pipeta 1 (ver Tabla de materiales) hacia adelante y hacia atrás 30 veces. Luego, incubar durante 15 min a 37 °C mientras agitamos los tubos por inversión cada 5 min.
    4. Mezclar suavemente hacia adelante y hacia atrás con la pipeta 2, y luego la pipeta 3 antes de incubar durante 10 min a 37 °C para disociar los tejidos.
    5. Filtre las células con un colador de células de 80 μm, agregue 10 ml de HBSS (libre de Ca y Mg). Centrifugar (300 x g, 10 min, RT) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet.
    6. Para el agotamiento de la mielina, vuelva a suspender el pellet con 400 μL de tampón de eliminación de mielina (consulte la Tabla de materiales) y luego agregue 100 μL de perlas de eliminación de mielina (consulte la Tabla de materiales), antes de incubar durante 15 min a 4 ° C.
    7. Agregue 5 ml de tampón de eliminación de mielina, centrífuga (300 x g, 10 min, RT) y retire el sobrenadante sin molestar el pellet.
    8. Agregue 500 μL de tampón de eliminación de mielina y coloque el tubo en la columna de campo magnético. Lave la columna con 1 ml de tampón de eliminación de mielina cuatro veces.
    9. Centrifugar (300 x g, 2 min, RT) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Vórtice brevemente (2 s) para disociar las células y añadir 5 μL de fc bloque CD32. Vórtice de nuevo e incube durante 5 min a 4 °C.
    10. Añadir 100 μL de la mezcla de anticuerpos primarios de interés; incubar durante 20 min a 4 °C.
    11. Centrifugar (350 x g, 5 min, 4 °C) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Seque los tubos boca abajo en papel blando.
    12. Después de un breve vórtice (2 s), agregue 100 μL de la mezcla secundaria de anticuerpos e incube durante 15 min a 4 °C.
    13. Añadir 2 ml de tampón de eliminación de mielina, centrífuga (350 x g, 5 min, 4 °C) y retirar el sobrenadante sin molestar el pellet. Seque los tubos boca abajo en papel blando. Resuspend las células en 250 μL de PBS estéril y proceder directamente a la clasificación celular.

10. Clasificación de celdas

  1. Prepare el tubo de microfuge con 500 μL de PBS estéril para recolectar las células clasificadas.
  2. Agregue 10 μL de Hoechst por 1000 μL de solución celular para colorear los núcleos de las células vivas y distinguirlos de las células muertas.
  3. Transfiera las células lo antes posible a la máquina clasificadora de células a 4 °C.
  4. Primero, ordene las celdas por dispersión hacia adelante y hacia el lado, y luego ordene las celdas positivas de Hoechst. A continuación, ordene las células en función de los anticuerpos de interés. Recoja las células teñidas positivamente por separado. Asegúrese de distinguir las células positivas de las autofluorescentes.
  5. Cuente el número de celdas ordenadas para cada grupo de interés.

11. Conteo gamma

  1. Calibrar el sistema de conteo de γ con 10 μL de la misma solución fantasma utilizada para la calibración SPECT pero diluirlo en 1 mL de agua.
    NOTA: La solución fantasma se diluye debido a la mayor precisión del sistema de conteo de γ.
  2. Coloque el tubo de células clasificadas en el sistema de conteo de γ y proceda con el conteo γ de acuerdo con el protocolo del fabricante.

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Resultados

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Las ratas WT experimentaron exploración SPECT in vivo con radiotrazador [125I]CLINDE después de una inyección unilateral de LPS (Figura 2). Esta exploración (utilizando datos sumados de imágenes de 45-60 min después de la inyección de radiotrazador) mostró una mayor unión de [125I]CLINDE en el sitio de la inyección de LPS (Figura 2A) que en la región contralateral del cerebro (Figura 2B). Las muestras ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasta donde sabemos, esta técnica fue la primera en describir un enfoque que permite una mejor comprensión de las alteraciones de unión in vivo de un radiotrazador a nivel celular. El protocolo describe un método multiescala para cuantificar la unión al radiotrazador a nivel celular utilizando [125I]CLINDE (TSPO) o [125I]R91150 (5HT2AR) como ejemplos.

Esta técnica es lo suficientemente robusta y sensible como para detectar con precisión el origen celul...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subvención nº 320030-184713). Los autores BBT y KC cuentan con el apoyo de la Fundación Velux (proyecto n. 1123). El autor ST recibió el apoyo de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fundación Prof. Dr. Max Cloetta (beca Clinical Medicine Plus) y la Fundación Jean y Madeleine Vachoux.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoSigma-Aldrich
AcetonitriloSigma-Aldrich
BioVetBioVetSoftware para el control de signos vitales
Bondclone C18 columna de fase reversaPhenomenex, Schlieren, Suiza
Des-Surde GinebraVirucide
Fc Block / anti-CD32BD BiosciencesBDB550270Reactividad para ratas
CD90 Biolegend 202504 conjugadas con FITCReactividad para ratas
HeparinaB. BraunB01AB01
HPLCKnauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mmBD Biosciences321312catéter de 24 G
IsofluranoBaxterZDG9623
LacryviscAlcon2160699
LS ColumnasMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Cinta blanda Micropore3MF51DA01
MILabs-Uspect IIMILabsSoftware para cámara SPECT
MoFlo AstriosBeckman CoulterClasificador de células
Cuentas de eliminación de mielina IIMiltenyi Biotec130-096-733Contiene perlas y tampón de eliminación de mielina.
NaCl 0,9% Solución estérilB. Braun395202
Neural Dissociation Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628Contiene las mezclas de enzimas, pipetas 1, 2 y 3.
Lámina de malla de nailonAmazonCMN-0074-10YD40 pulgadas de ancho, malla de 80 micras
de tamaño Ácido peracéticoSigma-Aldrich
Separador QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
R91150 pré cursorCERMN
Sep-Pak C18 Columnadeconcentración de aguas
Yoduro de sodio Na125PerkinElmer
Precursor de tributilinaCERMN
U-SPECT Rec2.38cMILabsversión Rec2.38cSoftware para la reconstrucción de imágenes SPECT
USPECT IIMILabsSpect Camera
Wizard 3"PerkinContador ElmerGamma
Hospital Universitario Columna

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
  2. Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
  3. D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
  4. D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
  5. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  6. Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
  7. Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153(2018).
  8. Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
  9. Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712(2020).
  10. Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
  11. Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346(2020).
  12. Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
  13. Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
  14. Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).
  15. Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
  16. Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).

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