Método de alto rendimiento, robusto y altamente flexible en el tiempo para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis

Summary

Se proporciona un protocolo de alto rendimiento para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optimizando los pasos de manejo de líquidos con un dispositivo de succión simple construido con una bomba de vacío. Cientos de muestras de semillas pueden ser esterilizadas superficialmente en un día.

Abstract

Arabidopsis es, con mucho, la especie modelo de planta más utilizada para estudios funcionales. La esterilización superficial de las semillas de Arabidopsis es un paso fundamental requerido para este fin. Por lo tanto, es primordial establecer métodos de esterilización de la superficie de semillas de Arabidopsis de alto rendimiento para manejar decenas a cientos de muestras (por ejemplo, líneas transgénicas, ecotipos o mutantes) a la vez. En este estudio se presenta un método de esterilización de la superficie de la semilla basado en la eliminación eficiente de líquido en tubos con un dispositivo de succión casero construido a partir de una bomba de vacío común. Al reducir drásticamente el tiempo práctico intensivo en mano de obra con este método, es posible manejar varios cientos de muestras en un día con poco esfuerzo. Los análisis de series indicaron además un rango de tiempo altamente flexible de esterilización de superficies al mantener altas tasas de germinación. Este método podría adaptarse fácilmente para la esterilización superficial de otros tipos de semillas pequeñas con una simple personalización del dispositivo de succión de acuerdo con el tamaño de la semilla y la velocidad deseada para eliminar el líquido.

Introduction

Arabidopsis es una especie de planta diploide perteneciente a la familia Brassicaceae. Su ciclo de vida relativamente corto (dos meses por generación en condiciones de crecimiento de días largos), el pequeño tamaño de la planta y la autopolinización con la producción de cientos de semillas por planta la han convertido en la primera especie modelo de planta fundamental^1,2. Además, su genoma fue completamente secuenciado^3,extensas herramientas de genética inversa (ADN-T saturado, transposón y poblaciones químicamente mutagenizadas) están disponibles^4,

Protocol

1. Reactivos y preparación de medios

1. Preparar solución de etanol al 70%: Añadir 737 mL de etanol técnico al 95% a 263 mL de agua destilada. Homogeneizar.
   NOTA: Prepare una solución de etanol al 70% en un banco de trabajo no estéril.
   PRECAUCIÓN: El etanol es altamente inflamable y puede causar irritación grave en los ojos. Mantener alejado de llamas y fuentes de calor. En caso de contacto con los ojos, enjuague con abundante agua.
2. Prepare una solución de lejía al 5%: Agregue 5 ml de lejía doméstica (que contenga ~ 3.5% de hipoclorito de sodio, NaClO) a 95 ml de agua destilada estéril. Agregue unas gotas de detergente no iónico (por ejemplo, Tw....

Results

Con el fin de evaluar el tiempo requerido para todo el procedimiento de esterilización de semillas, se calcularon las diferencias de tiempo para el manejo de líquidos 96 muestras en el protocolo actual y se compararon con los métodos tradicionales de pipeteo. El resultado indica que el protocolo actual ahorra tiempo, reduciendo el tiempo de manipulación de líquidos a una cuarta parte del de los protocolos tradicionales(Tabla 1). La tabla destaca además que el tiempo de eliminación de líquidos en el proto.......

Discussion

La esterilización de semillas es el paso fundamental para los estudios funcionales en Arabidopsis. Aunque con frecuencia se lleva a cabo para muchos propósitos diferentes, se dispone de estudios limitados sobre la esterilización de la superficie de semillas de alto rendimiento en Arabidopsis.

Hasta ahora, uno de los métodos con mayor rendimiento es el uso de gas cloro generado por la mezcla de lejía con HCl concentrado. Aunque este método requiere un tiempo práctico limitado, utiliza un gas al.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Válvula	de acuario Amazon		B074CYC5SD Kit que incluye 2 válvulas y tubos de pared delgada. La válvula evita que los líquidos regresen a la punta estéril
Semillas de tipo silvestre Arabidopsis Col-0	Centro de stock de Arabidopsis N1093		Semillas de tipo silvestre (sensibles a la kanamicina)
Línea transgénica de Arabidopsis Semillas de AdoIspS-79	NA	Línea	transgénica NA que sobreexpresa un gen de isopreno sintasa de Arundo donax transformado en el fondo Col-0, resistente a la kanamicina (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Disponible bajo pedido de los autores
Microcentrífuga	Eppendorf EP022628188		Microcentrífuga de sobremesa utilizada para hilar las semillas
Murashige & Medio Skoog que incluye vitaminas	Duchefa	M0222	Medio estándar para el cultivo estéril
de plantas Controlador de pipetas	Marca	26300	Se utiliza para operar la pipeta serológica
Tubo de polietileno 1	Roth	9591.1	Tubo para la conexión de la bomba de vacío a la botella de decantación (diámetro interior: 7 mm; diámetro exterior: 9 mm)
Tubo de polietileno 2	Roth	9587.1	Tubo para la conexión de la botella de decantación a la válvula del acuario  (diámetro interior: 5 mm; diámetro exterior: 7 mm)
Tapón de rosca con conectores	Roth	PY86.1	Dosificador de 2 vías tapón de rosca GL45 en polipropileno para botella de decantación
Pipeta serológica	Marca	27823	Pipeta serológica de vidrio graduado (reutilizable). Se pueden usar pipetas desechables en lugar de
Shakeret al.	Molino de bolas Qiagen	85300	TissueLyser II utilizado normalmente para la homogeneización de tejidos. Sin la adición de cuentas a los tubos, funciona como agitador.
Etanol técnico	ITW Reactivos (Nova Chimica Srl)	212800	Etanol 96% v/v parcialmente desnaturalizado
grado técnico Tween 20	Merck Millipore	655205	Detergente no iónico que actúa como tensioactivo
Conectores de tubo universales	Roth	Y523.1	Se puede utilizar para mejorar/simplificar las conexiones de tubos
Bomba de vacío	Merck Millipore	WP6222050	Se utiliza para Fabricación del dispositivo de succión