Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

La respirometría basada en microplacas ha revolucionado la investigación mitocondrial al permitir el estudio de la respiración celular de un tamaño de muestra pequeño¹. La respiración celular generalmente se considera como un indicador de la función mitocondrial o "disfunción", a pesar del hecho de que el rango mitocondrial de funciones se extiende más allá de la producción de energía². En condiciones aeróbicas, las mitocondrias extraen la energía almacenada en diferentes sustratos descomponiendo y convirtiendo estos sustratos en intermedios metabólicos que pueden alimentar el ciclo del ácido cítrico³ (Figura 1). El flujo continuo de sustratos es esencial para que el flujo del ciclo del ácido cítrico genere 'donantes de electrones' de alta energía, que entregan electrones a la cadena de transporte de electrones que genera un gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, lo que permite que la ATP-sintasa fosforila ADP a ATP^4. Por lo tanto, un diseño experimental para evaluar la respiración mitocondrial debe incluir la naturaleza de la muestra (células intactas, células permeabilizadas o mitocondrias aisladas) y sustratos mitocondriales.

Las células mantienen un almacén de sustratos autóctonos^5,y las mitocondrias oxidan varios tipos de sustratos simultáneamente^6,lo que complica la interpretación de los resultados obtenidos de los experimentos realizados sobre células intactas. Un enfoque común para investigar la capacidad mitocondrial para oxidar un sustrato seleccionado es aislar las mitocondrias o permeabilizar las células investigadas⁵. Aunque las mitocondrias aisladas son ideales para estudios cuantitativos, el proceso de aislamiento es laborioso. Se enfrenta a dificultades técnicas como la necesidad de un gran tamaño de muestra, la pureza del rendimiento y la reproducibilidad de la técnica⁵. Las células permeabilizadas ofrecen una solución para las desventajas del aislamiento mitocondrial; sin embargo, los agentes permeabilizantes rutinarios de naturaleza detergente no son específicos y pueden dañar las membranas mitocondriales⁵.

La perfringolisina O recombinante (rPFO) se ofreció como agente permeabilizante selectivo de la membrana plasmática^7,y se utilizó con éxito en combinación con un analizador de flujo extracelular en varios estudios^7,8,9,10. Hemos modificado un protocolo utilizando rPFO para detectar el flujo de sustrato mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular XFe96. En este protocolo, se comparan cuatro vías oxidantes de sustrato diferentes en dos fenotipos celulares mientras se tienen suficientes réplicas y el control adecuado para cada material probado.

1. Un día antes del ensayo

1. Preparación de reactivos y sustratos.
   1. Solución de ensayo mitocondrial (MAS): Preparar soluciones madre de todos los reactivos como se describe en la Tabla 1. Caliente las existencias de manitol y sacarosa a 37 °C para disolverlas por completo. Mezcle los reactivos para preparar 2x MAS, luego caliente la mezcla a 37 ° C. Ajuste el pH con 5N KOH a 7.4 (~ 7 mL), luego agregue agua para llevar el volumen hasta 1 L. Filtre-esterilice y almacene las alícuotas a -20 ° C hasta el día de la medición.
   2. Albúmina sérica bovina (5% BSA): Disolver 5 g de BSA en 90 ml de agua estéril precalentada en un agitador magnético y evitar temblores. Ajuste el pH a 7.4 con 5 N KOH, y luego agregue agua para llevar el volumen hasta 100 ml. Filtrar-esterilizar y almacenar las alícuotas a -20 °C hasta el día de la medición.
   3. Sustratos mitocondriales: Prepare soluciones madre de 1 M de succinato de sodio, piruvato de sodio y glutamato de sodio en agua estéril. Prepare una solución madre de 100 mM de malato de sodio en agua estéril y use agua estéril precalentada para preparar una solución madre de 10 mM de palmitoil carnitina. Ajuste el pH de cada solución a 7.4 por 5 N KOH y esterilice el filtro. Conservar los sustratos a 2-8 °C. En el momento de su uso, caliente palmitoyl carnitina a 37 ° C para disolver cualquier precipitado. Para su uso posterior, conservar las alícuotas de todos los sustratos excepto el piruvato a -20 °C.
   4. Inhibidores mitocondriales: Use dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar soluciones madre de 25 mM de oligomicina, 50 mM de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), 20 mM de rotenona y 20 mM de antimicina A. Guarde las alícuotas a -20 °C.
2. Siembra y tratamiento de las células: Como se muestra en la Figura 2,sembra las células en las columnas 2-11. Las columnas 1 y 12 deben dejarse vacías para que sirvan como pozos de fondo. En este trabajo se utilizaron células HepG2 y A549.
   1. Sembrar las células a una densidad de 20.000 células por pozo. Utilice 50-80 μL de medio de cultivo celular para la siembra.
   2. Llene los pocillos en blanco con un volumen igual de medio de cultivo celular e incube las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO_2. Deje que las células se adhieran durante 3-4 horas y luego agregue 100 μL de medio de cultivo celular a todos los pocillos.
   3. Con esa adición final del medio, aplique el tratamiento en las columnas 7-11. En este trabajo, el grupo experimental fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas, y el grupo de control fue tratado con un volumen igual de agua destilada estéril como un control de vehículo.
3. Hidratación de los sensores: Pipete 200 μL de agua estéril por pozo en la placa de servicio, luego devuelva cuidadosamente el cartucho del sensor mientras sumerge los sensores en agua. Incubar el cartucho en una incubadora libre de_CO2a 37 °C hasta el día siguiente.
4. La plantilla de protocolo de ensayo: Encienda el analizador (consulte la Tabla de materiales)y la unidad controladora. Inicie el software de control de instrumentos y adquisición de datos y diseñe el protocolo de ensayo como se describe en la Tabla 2. En Definiciones degrupo, cree cuatro estrategias de inyección donde el puerto A difiere según el sustrato inyectado(Figura 3). Nombra las estrategias después de los sustratos o sus abreviaturas.
5. A los puertos B, C y D, asigne los compuestos oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A, respectivamente. Cree ocho grupos y asígneles el nombre que se muestra en la Figura 4. En Mapa de placas, asigne los grupos a los pozos correspondientes y, a continuación, guarde el protocolo como una plantilla lista para usar. Deje el analizador encendido para permitir que la temperatura se estabilice durante la noche. Mantenga el analizador en un lugar con una temperatura estable para evitar cambios bruscos de temperatura.

2. El día del ensayo

1. Sustitución del agua por el calibrante: Deseche el agua de la placa de servicios públicos y bombee 200 μL de calibrante precalentado por pozo en la placa de servicio. Devuelva el cartucho a la incubadora libre de CO₂hasta el momento del ensayo. Para evitar la evaporación rápida del calibrante, mantenga una fuente de humedad dentro de la incubadora y apague o reduzca la velocidad del ventilador al mínimo.
2. Preparación de las soluciones de trabajo: Comience calentando 2x MAS, 5% BSA y agua estéril a 37 ° C. Mientras tanto, permita que las existencias de inhibidores alcancen la temperatura ambiente. Utilice 2x MAS caliente y agua destilada estéril para preparar 5 ml de la concentración de trabajo de los sustratos e inhibidores como se describe en la Tabla 3.
3. Carga de los puertos de inyección: Como se muestra en la Figura 3,cargue 20 μL de los sustratos en el puerto A. Cargue la mezcla de succinato/rotenona en el puerto A de las filas A y B. Cargue la mezcla de piruvato/malato en el puerto A de las filas C y D. Cargue la mezcla de glutamato/malato en el puerto A de las filas E y F. Cargue la mezcla de palmitoil carnitina/malato en el puerto A de las filas G y H. Para toda la placa, puerto de carga B con 22 μL de preparación de oligomicina, puerto C con 25 μL de preparación fccP y puerto D con 27 μL de mezcla de rotenona/antimicina A.
4. Inicio del paso de calibración: En la pestaña Ejecutar ensayo, haga clic en Iniciar ejecución para iniciar el ensayo. Inserte el cartucho del sensor cargado e inicie el paso de calibración. Espere a que se complete la calibración antes de continuar con el siguiente paso.
5. Preparación del medio de ensayo (MAS-BSA-rPFO): Para preparar 20 mL del medio de ensayo, mezcle 10 mL de 2x MAS, 9.2 mL de agua estéril y 0.8 mL de BSA al 5% en un tubo de 50 mL. Añadir 2 μL de rPFO de 10 μM para alcanzar una concentración de 1 nM y volver a suspender la mezcla con pipeteo suave. Evite agitar y no use un mezclador de vórtice para mezclar. Incubar el tubo a 37 °C hasta el momento de su uso.
6. Lavado de las células: Lave las células y los pozos vacíos en blanco dos veces con solución salina tamponada (PBS) sin fosfato libre de calcio y magnesio precalentada con una pipeta multicanal. Evite reutilizar los mismos consejos para desechar el medio de cultivo celular y agregar PBS. Realice este paso fuera del flujo laminar para proteger las células de la desecación por el flujo de aire.
7. Permeabilización celular en medio de ensayo: Utilizando una pipeta multicanal, deseche el PBS y reemplácelo por 180 μL del medio de ensayo precalentado (MAS-BSA-rPFO).
8. Inicio de la medición: Inmediatamente después de la permeabilización, reemplace la placa de utilidad del cartucho del sensor calibrado con la placa de celda e inicie la medición.

Comience por normalizar los resultados a la segunda medición de la respiración basal para mostrar los valores como porcentaje de tasa de consumo de oxígeno (OCR%). Los resultados del ensayo se muestran en las Figuras 5,Figura 6, Figura 7 y Figura 8. Es importante asignar los pozos de fondo adecuados para cada grupo e inactivar los pozos de fondo de otros grupos. La Figura 5 muestra que el grupo tratado tiene una mayor tasa de respiración inducida por succinato. La respuesta de las células A549 al tratamiento con metformina(Figura 5A)fue mayor que la de las células HepG2(Figura 5B). Los pozos de control de fondo fueron solo los de las mismas filas del grupo comparado, en este caso, los pozos A1, B1, A12 y B12. La Figura 6 muestra los cambios en la respiración inducida por piruvato/malato. La Figura 7 muestra los cambios en la respiración inducida por glutamato/malato, y la Figura 8 muestra los cambios en la respiración inducida por palmitoil carnitina/malato.

Figura 1: Una representación esquemática del ciclo del ácido cítrico. Los sustratos utilizados para probar el flujo de sustrato mitocondrial están en rojo. El malato no se usa solo, sino que se usa en combinación con piruvato, palmitoil carnitina y glutamato. El papel del malato en la respiración inducida por piruvato/malato y palmitoil carnitina/malato es proporcionar oxaloacetato a través de la acción de la enzima malato deshidrogenasa. En la respiración inducida por glutamato/malato, el malato participa en el transbordador malato-aspartato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ilustración del plan de siembra celular en la microplaca de cultivo celular. Los pozos en blanco de las columnas 1 y 12 deben dejarse vacíos sin celdas. Las columnas 7-11 se utilizan para tratar el grupo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ilustración de la estrategia de inyección. El puerto A de las filas A y B se carga con una mezcla de succinato/rotenona. El puerto A de las filas C y D se carga con mezcla de piruvato/malato. El puerto A de las filas E y F se carga con una mezcla de glutamato/malato. El puerto A de las filas G y H se carga con la mezcla de palmitoil carnitina/malato. Para toda la placa, los puertos B, C y D están cargados con oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Nombres de grupos y mapa de placas. Cada grupo se nombra de acuerdo con el fenotipo (control o tratado) y el sustrato utilizado para inducir la respiración. (S), respiración inducida por succinato. (P/M), respiración inducida por piruvato/malato. (G/M), respiración inducida por glutamato/malato. (CP/M), respiración inducida por palmitoil carnitina/malato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Respiración inducida por succinato. (A) A549 y (B) HepG2. El grupo analizado fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas. Solo se utilizan los pozos de fondo A1, B1, A12 y B12 para la corrección. Los resultados se muestran como OCR promedio% ± SD. El gráfico y la cuadrícula de placas se crearon y exportaron como archivos de imagen mediante el software de diseño de ensayos, análisis de datos y administración de archivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Respiración inducida por piruvato/malato. (A) A549 y (B) HepG2. El grupo analizado fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas. Solo se utilizan los pozos de fondo C1, D1, C12 y D12 para la corrección. Los resultados se muestran como OCR promedio% ± SD. El gráfico y la cuadrícula de placas se crearon y exportaron como archivos de imagen mediante el software de diseño de ensayos, análisis de datos y administración de archivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Respiración inducida por glutamato/malato. (A) A549 y (B) HepG2. El grupo analizado fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas. Solo los pozos de fondo E1, F1, E12 y F12 se utilizan para la corrección. Los resultados se muestran como OCR promedio% ± SD. El gráfico y la cuadrícula de placas se crearon y exportaron como archivos de imagen mediante el software de diseño de ensayos, análisis de datos y administración de archivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Respiración inducida por palmitoil carnitina/malato. (A) A549 y (B) HepG2. El grupo analizado fue tratado con 1 mM de clorhidrato de metformina durante 16 horas. Solo los pozos de fondo G1, H1, G12 y H12 se utilizan para la corrección. Los resultados se muestran como OCR promedio% ± SD. El gráfico y la cuadrícula de placas se crearon y exportaron como archivos de imagen mediante el software de diseño de ensayos, análisis de datos y administración de archivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Solución de ensayo mitocondrial. Mezclar el volumen indicado de cada solución madre de ingredientes para preparar (2x MAS). Caliente la solución a 37 °C, luego ajuste el pH con 5 N KOH a 7.4. Agregue agua destilada para llevar el volumen hasta 1 L. Filtre-esterilice y luego almacene las alícuotas a -20 ° C. Preparar el medio de ensayo y las soluciones de trabajo de sustratos e inhibidores mitocondriales utilizando 2x MAS.

Tabla 2: Comandos del protocolo de ensayo.

Tabla 3: Lista de sustratos e inhibidores mitocondriales que se cargarán en los puertos de inyección de los cartuchos sensores como se discutió anteriormente en la Figura 3. Mezcle los volúmenes indicados de soluciones madre, 2x MAS y agua destilada para preparar los 5 ml de la concentración de trabajo de cada sustrato o mezcla inhibidora. La concentración final se logra en los pozos después del proceso de inyección.

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.