Tratamiento con luz infrarroja no térmica de la lesión por isquemia/reperfusión y posterior análisis de la diferenciación de macrófagos

Resumen

Describimos la reducción de la lesión por reperfusión mediante irradiación a 670 nm en un modelo murino de isquemia y reperfusión mediante la colocación de torniquete. Esta irradiación de 670 nm redujo la respuesta inflamatoria, disminuyó el número de macrófagos proinflamatorios y aumentó los macrófagos protectores.

Resumen

El daño tisular y la necrosis por procesos inflamatorios son consecuencia de la lesión por isquemia-reperfusión (IRI). En el músculo esquelético, la isquemia reduce la capacidad energética aeróbica de las células musculares, lo que provoca alteraciones bioquímicas adversas e inflamación. El objetivo de este estudio es demostrar que la exposición a la luz infrarroja cercana (NIR) durante un período de isquemia reduce la IRI al disminuir la necrosis y la inflamación, además de disminuir los mármacos M1 proinflamatorios y aumentar los macrófagos M2 protectores. Los ratones C57/Bl6 se sometieron a isquemia de las extremidades posteriores inducida por torniquete unilateral durante 3 h seguida de reperfusión durante 15 o 30 min. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a 3 grupos. Al grupo 1 se le realizó IRI con reperfusión de 30 min. El grupo 2 se sometió a IRI con una reperfusión de 15 min. Cada grupo consistió en un 50% de ratones tratados con NO-NIR y un 50% con NIR con una exposición de 50 mW/^cm2 durante 5 min/1 h después del cierre del torniquete. En el grupo 3 se anestesiaron animales simulados durante 3 h omitiendo la IRI.

Se realizó un láser de flujo Doppler en todos los ratones para confirmar la isquemia y la reperfusión. Los datos de flujo se expresaron como la relación entre la extremidad isquémica y el control contralateral. Los ratones fueron sacrificados después de la reperfusión, y los cuádriceps y gastrocnemio fueron cosechados. Se realizó inmunoprecipitación y western blot de los marcadores de macrófagos CD68 (M1) y CD206 (M2) y se normalizó a la expresión de CD14. La expresión de los marcadores inflamatorios CXCL1 y CXCL5 se redujo significativamente con el NIR en el grupo IRI. Se observó una disminución significativa de CD68 y un aumento de la expresión de CD206 en los animales que recibieron IR y NIR. La necrosis tisular disminuyó por NIR en el grupo IRI, como se visualizó mediante la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Los hallazgos demuestran que la exposición a NIR redujo la IRI y mejoró la supervivencia de los tejidos. El NIR redujo la inflamación, disminuyó la M1 proinflamatoria y aumentó los macrófagos M2 protectores. La exposición a NIR redujo la inflamación y mejoró la regeneración, lo que condujo a la protección de los tejidos después de la isquemia.

Introducción

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) es un desafío clínico que se observa después de lesiones vasculares y el uso prolongado de torniquetes quirúrgicos. Estudios previos han demostrado que 60-90 min es el umbral superior para el tiempo de isquemia caliente, más allá del cual puede ocurrir un daño tisular irreversible. Más que cualquier otro factor, las limitaciones del tiempo de isquemia caliente limitan el éxito y el rescate de la reimplantación de las extremidades disvasculares ^1,2.

En el músculo esquelético, la isquemia reduce la capacidad ae....

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo: AUA#1517). Todas las investigaciones con ratones se llevaron a cabo de conformidad con la política de PHS.

1. Colocación del torniquete

NOTA: Se colocó un torniquete para inducir la isquemia y lograr un campo quirúrgico libre de sangre.

1. Anestesiar un ratón C57/Bl6 con isoflurano en la ....

Resultados

Las mediciones de flujo confirmaron isquemia y reperfusión
La ubicación de la luz NIR y el protocolo experimental se muestran en la Figura 1. Se desarrolló y empleó un modelo de isquemia murina de la extremidad posterior para evaluar el efecto de la exposición a NIR sobre la IRI del músculo esquelético. Como se esperaba, las imágenes de flujo Doppler láser (Figura 2A) verificaron que el torniquete fue efectivo para inducir isquemia junto con .......

Discusión

Este artículo describe uno de los primeros estudios que se centró en la reducción de la lesión por reperfusión mediante el tratamiento con luz NIR mediante el cambio de la respuesta inflamatoria en la extremidad posterior. La isquemia, la lesión por reperfusión y el tratamiento con luz NIR no son del todo novedosos. Otros estudios se centraron en la reperfusión de isquemia con luz NIR. El tratamiento con luz NIR se ha utilizado con éxito en la reducción del tamaño del infract miocárdico .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,3,5-Trifeniltetrazolio,	Sigma Aldrich	17779-10X10ML-F	1% solución
4– 15% Criterio TGX Gel de proteínas sin manchas	BioRad	#5678084	Tris-glicina geles extendidos
4x Tampón de muestra Laemmli - 1610747	BioRad	16110747
fuente de luz de 670 nm	hecho a medida	NIR Technologies
	Thermo Fisher	23227
BioRad ChemiDoc	Bio-Rad		Sistema
de imagenBio-Rad
β-mercaptoetanol	BioRad	1610710
CXCL1 ELISA	R& D Systems	DY453-05
CXCL5 ELISA	R& D Systems	DX000
Forane	Baxter	1001936040	isoflurano inhalante
anti-conejo IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2004	dilución 1:10.000
Ice Acumula bolsa
Laser doppler Imager	Moor	MOORLDI2-HIR
monoclonal anticuerpo CD14	Santa Cruz Biotechnologies	sc-515785	dilución 1:200
anticuerpo monoclonal CD206	Santa Cruz Biotechnologies	sc-58986	dilución 1:200
anticuerpo monoclonal CD68	Santa Cruz Biotechnologies	SC-20060	dilución 1:200
Pierce Tampón de bloqueo libre de proteínas (TBS) tampón			de bloqueo
policlonal Anticuerpo de clorotirosina	Hycult	HP5002	1:1.000 dilución
Proteína A/G PLUS-Agarose	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2003
Super Signal West Femto	Reactivo de quimioluminiscencia mejorado	ThermoFisher	34095

Kit de ensayo de proteínas BCA de cabra de hielo