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इसके विपरीत के लिए ऊतक तैयारी तकनीक-बढ़ाया माइक्रो कम्प्यूटेड टोमोग्राफी क्रोनिक रोग के साथ बड़े स्तनधारी कार्डियक मॉडल की इमेजिंग

Published: February 8, 2022 doi: 10.3791/62909
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2
1Centre de recherche Cardio-Thoracique de Bordeaux, Univ. Bordeaux, 2IHU Liryc, Electrophysiology and Heart Modeling Institute, Fondation Bordeaux Univ., 3Electrophysiology and Ablation Unit, Bordeaux University Hospital (CHU)

Summary

यहां, हम कोलेजन-चयनात्मक कंट्रास्ट वृद्धि के साथ स्वस्थ और पैथोलॉजिकल बड़े स्तनधारी पूरे दिलों की उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रो कम्प्यूटेड टोमोग्राफी छवियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

संरचनात्मक remodeling दिल पर लगाए गए पुराने रोग संबंधी तनाव का एक सामान्य परिणाम है। रोगग्रस्त ऊतक के वास्तुशिल्प और रचनात्मक गुणों को समझना एरिथमिक व्यवहार के साथ उनकी बातचीत को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। माइक्रोस्केल ऊतक remodeling, नैदानिक संकल्प के नीचे, घातक अतालता के एक महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में उभर रहा है, युवा वयस्कों में उच्च प्रसार के साथ। प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए पर्याप्त माइक्रोस्केल रिज़ॉल्यूशन पर उच्च इमेजिंग कंट्रास्ट प्राप्त करने में चुनौतियां बनी हुई हैं, जैसे कि बड़े स्तनधारी पूरे दिल। इसके अलावा, तीन आयामी उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए ऊतक संरचना-चयनात्मक कंट्रास्ट वृद्धि में अभी भी कमी है। माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके गैर-विनाशकारी इमेजिंग उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए वादा दिखाती है। उद्देश्य बड़े जैविक नमूनों में क्षीणन पर एक्स-रे से पीड़ा को कम करना था। दिल स्वस्थ सूअरों (एन = 2) से निकाले गए थे, और भेड़ (एन = 2) या तो प्रेरित क्रोनिक मायोकार्डियल रोधगलन और फाइब्रोटिक निशान गठन या प्रेरित क्रोनिक एट्रियल फिब्रिलेशन के साथ। एक्साइज किए गए दिल ों को पार किया गया था: एक कैल्शियम आयन शमन एजेंट और एक वासोडिलेटर के साथ पूरक एक खारा समाधान, सीरियल निर्जलीकरण में इथेनॉल, और वैक्यूम के तहत हेक्सामिथाइलडिसिलिज़ेन। उत्तरार्द्ध ने 1 सप्ताह के लिए हवा सुखाने के दौरान दिल की संरचना को मजबूत किया। कोलेजन-प्रमुख ऊतक चुनिंदा रूप से एक एक्स-रे कंट्रास्ट-बढ़ाने वाले एजेंट, फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड द्वारा बाध्य किया गया था। ऊतक संरचना हवा में स्थिर थी, जिससे उच्च-रिज़ॉल्यूशन (आइसोट्रोपिक 20.7 μm) छवियों को प्राप्त करने के लिए लंबी अवधि के माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी अधिग्रहण की अनुमति मिलती थी। प्रसार द्वारा इष्टतम कंट्रास्ट एजेंट लोडिंग ने स्वस्थ सुअर वेंट्रिकल में उपकला परत और उप-एंडोकार्डियल पुरकिंजे फाइबर के चयनात्मक विपरीत वृद्धि को दिखाया। एट्रियल फिब्रिलेशन (एएफ) दिलों ने एट्रिया के पीछे की दीवारों और उपांगों में बढ़े हुए विपरीत संचय को दिखाया, जिसे अधिक कोलेजन सामग्री के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। मायोकार्डियल रोधगलन दिल ने कार्डियक फाइब्रोसिस के क्षेत्रों में चुनिंदा रूप से इसके विपरीत में वृद्धि दिखाई, जिसने इंटरवीविंग जीवित मायोकार्डियल मांसपेशी फाइबर की पहचान को सक्षम किया। कंट्रास्ट-एन्हांस्ड एयर-सूखे ऊतक की तैयारी ने बरकरार बड़े स्तनधारी दिल के माइक्रोस्केल इमेजिंग और अंतर्निहित रोग घटकों के चयनात्मक विपरीत वृद्धि को सक्षम किया।

Introduction

संरचनात्मक हृदय रोग हृदय से संबंधित मृत्यु दर के बहुमत के लिए जिम्मेदार है दुनिया भर में1। कार्डियक संरचना की रीमॉडलिंग मायोकार्डियल वातावरण और अंतरालीय स्थान को प्रभावित करती है। चूंकि कार्डियक इलेक्ट्रिकल और मैकेनिकल फ़ंक्शन दोनों मायोसाइट संगठन पर निर्भर करते हैं, इसलिए व्यवधान असहनीय कार्डियक अतालता, बिगड़ा हुआ रक्त-पंपिंग क्रियाएं, और दिल की विफलता 2,3,4,5,6,7,8,9 का कारण बन सकता है। संरचनात्मक हृदय रोगों के लिए उपचारात्मक उपचारों के विकास रोग प्रसार 2,5 से कहीं अधिक हैं। इस प्रकार, संरचनात्मक हृदय रोगों के प्रीक्लिनिकल मॉडल की बढ़ती संख्या एनाटोमो-रूपात्मक प्रोफाइल को बेहतर ढंग से समझने के लिए उभर रही है और इसके परिणामस्वरूप कार्डियक अतालता 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. संरचनात्मक रोग स्पेक्ट्रम में मनाया अंतरालीय फाइब्रोसिस का upregulation है और, अधिक आमतौर पर ischemia से संबंधित मामलों में, फाइब्रोसिस और वसा ऊतक18 द्वारा मायोकार्डियल प्रतिस्थापन. पैथोलॉजिकल एक्स्ट्रासेल्युलर घटकों की रूपात्मक समझ अतालता के संभावित सब्सट्रेट की पहचान को सक्षम कर सकती है। रोग का वितरण और सीमा arrhythmogenic जोखिम के मजबूत संकेतक प्रदान करते हैं। फिर भी, बरकरार दिल में मैक्रो- और माइक्रोस्केल को एकीकृत करके व्यापक रूप से छवि रोग प्रोफाइल के लिए चुनौतियां बनी हुई हैं।

एक्स-रे पर आधारित माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी), कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग करके नरम जैविक ऊतक माइक्रोस्ट्रक्चर से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभर रहा है। छोटे कृन्तकों 24,25,26 और बड़े स्तनधारी दिलों से छोटे विच्छेदित नमूनों से दिल के लिए अत्यधिक विस्तृत शारीरिक मानचित्र प्राप्त किए गए हैं। हालांकि, बड़े स्तनधारी दिलों के पूरे अंग स्तर पर इमेजिंग अत्यधिक पथ लंबाई प्रस्तुत करती है जिस पर एक्स-रे फोटॉन पारंपरिक ऊतक तैयारी तकनीकों का उपयोग करके क्षीण हो जाते हैं। इसमें ऊतक को कंट्रास्ट-लोड करना और अधिग्रहण के दौरान एक विपरीत एजेंट विलायक में नमूने को विसर्जित करना शामिल है। नमूना आकार और रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने से कुल अधिग्रहण समय का एक लंबाई लागू होती है। इसलिए ऊतक स्थिरता उपयोग करने योग्य छवि पुनर्निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हो जाती है, जिसका अर्थ है कि सूखने से उत्पन्न ऊतक विरूपण को रोका जाना चाहिए। हालांकि, विसर्जन तरल पदार्थ के उपयोग में कमियां हैं: (i) समग्र पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता गैर-नगण्य हो जाती है और (ii) ऊतक-बाध्य विपरीत अणुओं के कमजोर पड़ने को बढ़ावा देती है। ये दोनों कारक छवि के विपरीत को कम करने में योगदान करते हैं।

यह अध्ययन पृष्ठभूमि फोटॉन क्षीणन को कम करने और इसके विपरीत-वृद्धि एजेंटों द्वारा प्रदान की गई गतिशील सीमा को अनुकूलित करने के लिए एक उपन्यास ऊतक प्रसंस्करण पाइपलाइन का विवरण देता है। ऊतक विरूपण29 को सीमित करने के लिए रासायनिक ऊतक सुदृढीकरण के साथ एक ऊतक हवा-सुखाने के दृष्टिकोण का उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है। इसलिए ऊतक के नमूने लंबे अधिग्रहण के लिए हवा में स्थिर रह सकते हैं और विसर्जन तरल पदार्थों से पृष्ठभूमि योगदान को छोड़ सकते हैं। यह पद्धति पाइपलाइन प्रदान करती है: (i) एक व्यापक ऊतक प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल पूरे सुअर के दिलों का उपयोग करके अनुकूलित; (ii) कंट्रास्ट सांद्रता और लोडिंग तकनीकों का मूल्यांकन और (iii) भेड़ के दिलों में अलिंद फिब्रिलेशन और मायोकार्डियल रोधगलन के दो अलग-अलग पुरानी रोग मॉडलों में इस पाइपलाइन का अनुप्रयोग। क्रोनिक रोग मॉडल के विकास को प्रत्येक क्रोनिक कार्डियक रोग मॉडल के लिए कहीं और वर्णित किया गया है, मायोकार्डियल रोधगलन पर्कुटेनियस कोरोनरी धमनी एम्बोलाइजेशन13 और आत्मनिर्भर एट्रियल फिब्रिलेशन30 द्वारा प्रेरित है।

Protocol

सभी प्रयोगों को वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर यूरोपीय संसद के निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए किया गया था। पशु प्रोटोकॉल बोर्डो विश्वविद्यालय में स्थानीय नैतिक समिति (CEEA50) द्वारा अनुमोदित किए गए थे। दिल तीन बड़े स्तनधारी मॉडल से सोर्स किए गए थे, जिनमें (i) स्वस्थ बड़े सफेद सूअर (एन = 2, 2 महीने पुराने); (ii) प्रेरित मायोकार्डियल रोधगलन13 और (iii) प्रेरित अलिंद फिब्रिलेशन30 के साथ भेड़ (एन = 1, 7 वर्ष की आयु) के साथ भेड़ (एन = 1, 2 वर्ष की आयु)।

1. समाधान की तैयारी:

  1. कार्डियोप्लेजिक समाधान: आसुत पानी के 3 एल तैयार करें और सोडियम क्लोराइड (110 एमएम), पोटेशियम क्लोराइड (16 एमएम), सोडियम बाइकार्बोनेट (10 एमएम), डी-(+) -ग्लूकोज (9 एमएम), कैल्शियम क्लोराइड समाधान (1.2 एमएम) और मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान (16 एमएम) जोड़ें। अंत में, हेपरिन सोडियम के 500 μL / L जोड़ें। इस समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
  2. फॉस्फेट buffered खारा - EDTA समाधान (PBS-EDTA).
    1. सबसे पहले, 10 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए आसुत पानी के 1 लीटर में ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ें। ईडीटीए को भंग करने के लिए सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (1 एम) का उपयोग करके 12 के समाधान पीएच को बढ़ाएं और बनाए रखें।
    2. एक बार जब ईडीटीए पूरी तरह से भंग हो जाता है, तो हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक कम कर दें। 0.01 M (सोडियम क्लोराइड, 0.138 M; पोटेशियम क्लोराइड, 0.0027 M) और pH 7.4 पर एक समाधान प्राप्त करने के लिए फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा की एक पन्नी थैली जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर इस समाधान को संरक्षित करें।
  3. इथेनॉल - फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड (पीएमए) कंट्रास्ट एजेंट समाधान: पूर्ण इथेनॉल के 1 एल तैयार करें और 1% एकाग्रता पर समाधान प्राप्त करने के लिए पीएमए जोड़ें। RT पर इस समाधान को संरक्षित करें।

2. ऊतक का स्रोत

  1. जानवर को euthanize और स्थानीय नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार दिल निकालने। जल्दी से दिल को ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान में विसर्जित करें और प्रारंभिक कुल्ला के लिए धीरे से वेंट्रिकल्स की मालिश करें।
  2. महाधमनी मेहराब के नीचे महाधमनी को काटना सुनिश्चित करें और सुई धारकों का उपयोग करके धमनी की दीवार के दो किनारों को दबाएं।
  3. सुई धारकों द्वारा दिल को निलंबित करते हुए, महाधमनी जड़ में एक महाधमनी कैनुला डालें, महाधमनी वाल्व के माध्यम से संपर्क या बाहर निकलने का ध्यान न रखें। प्रवेशनी के स्तर पर महाधमनी मेहराब के चारों ओर एक 0 गेज टांका लपेटें और दृढ़ता से जगह में प्रवेशनी बांधें।
  4. 50 मिली सिरिंज का उपयोग करके, 200 मिलीलीटर ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) कार्डियोप्लेजिक समाधान इंजेक्ट करें। फुफ्फुसीय नसों के माध्यम से नाली के लिए अपने पीछे की ओर दिल tipping द्वारा गुहाओं में अतिरिक्त रक्त पूलिंग निकालें।
  5. कुल्ला दिल विसर्जित करें और विच्छेदन के लिए तैयार होने तक बर्फ पर संग्रहीत ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान में रखें।

3. ऊतक की तैयारी:

  1. एक विच्छेदन पकवान के ऊपर 80 सेमी का समर्थन करने वाला एक 1 एल जलाशय तैयार करें। एक थर्मोप्लास्टिक ट्यूब लंबाई में 80 सेमी और 3.2 मिमी आंतरिक व्यास और जलाशय के एक नाली बंदरगाह के लिए 4.8 मिमी बाहरी व्यास जोड़ा।
  2. जल निकासी टयूबिंग के लिए एक तीन-तरफ़ा नल को ठीक करें और तीन-तरफ़ा नल पर प्रत्येक मुक्त बंदरगाह के लिए आगे थर्मोप्लास्टिक टयूबिंग (20 सेमी, 1.6 मिमी आंतरिक व्यास और 3.2 मिमी बाहरी व्यास) जोड़ें। टयूबिंग के शुल्क सिरों के लिए दो-तरफ़ा नल को ठीक करें।
  3. हेपरिन (2500 इकाइयों) के साथ पूरक कार्डियोप्लेजिक समाधान के साथ जलाशय को भरें। कार्डियोप्लेजिक समाधान को नाली और सभी हवा के बुलबुले को हटाने की अनुमति देने के लिए नल खोलें, फिर दो-तरफा नल को बंद करें।
  4. Polytetrafluoroethylene (PTFE) टयूबिंग (1 मिमी आंतरिक व्यास और 2 मिमी बाहरी व्यास) का उपयोग करके बाएं और दाएं कोरोनरी ओस्टिया के लिए कैनुला तैयार करें।
    1. टयूबिंग के 5 सेमी काटें और एक नग्न लौ के बगल में टिप रखकर एक छोर गर्म करें। एक बार जब टिप का 1 मिमी पिघलना शुरू हो जाता है और पारभासी हो जाता है, तो कैनुला टिप पर एक रिज को आकार देने के लिए एक कठिन गर्मी प्रतिरोधी सतह के खिलाफ टिप को दबाएं ताकि कैनुला को जहाजों से बाहर निकलने से रोका जा सके।
    2. नाली जलाशय जल निकासी टयूबिंग के दो सिरों में प्रत्येक प्रवेशनी के गैर-गर्म अंत के 1 सेमी डालें।
  5. महाधमनी प्रवेशनी को हटा दें। ठंडे कार्डियोप्लेजिक समाधान के तहत, कोरोनरी धमनियों के बाएं और दाएं ओस्टिया को स्थानीयकृत करें।
  6. नुकीले कैंची का उपयोग करते हुए, कोरोनरी ओस्टिया के ऊपर और नीचे आसपास के ऊतकों से महाधमनी जड़ को सावधानीपूर्वक अलग करें ताकि कोरोनरी पोत के नीचे 0 जी रेशम सिवनी के थ्रेडिंग को सक्षम किया जा सके।
  7. दो तरफा नल खोलें और कोरोनरी ostia में cannulae युक्तियाँ डालें। ostia में 1-2 सेमी विस्तार और टांका प्लेसमेंट से परे cannulae युक्तियाँ के साथ, बंद cannulae टाई.
  8. 15 मिनट के लिए वेंट्रिकल्स की मालिश करते समय दिल को कुल्ला करें जब तक कि दिल रक्त से साफ न हो जाए।
  9. कुल्ला करने के बाद, दो-तरफ़ा नल बंद करें और उन्हें तीन-तरफ़ा टैप से डिस्कनेक्ट करें। पीबीएस-ईडीटीए समाधान के 500 एमएल युक्त एक 1 एल प्लास्टिक रसायन-प्रतिरोधी कंटेनर में दिल को स्थानांतरित करें।
  10. दो चैनलों के साथ एक peristaltic पंप का उपयोग कर एक धुएं हुड के नीचे थर्मोप्लास्टिक टयूबिंग में पीबीएस-ईडीटीए समाधान recirculate। जब तक टयूबिंग हवा के बुलबुले के अनुपस्थित नहीं है पंप टयूबिंग प्राइम, तो 80 mL / मिनट पर 2 ज के लिए आरटी पर recirculation द्वारा प्रत्येक कोरोनरी धमनी cannulae perfuse।
  11. सुनिश्चित करें कि धुएं हुड परिचालन है. पंप को रोकें, कंटेनर से समाधान निकालें और इसे 80 मिलीलीटर / मिनट पर आरटी पर 1 घंटे के लिए निर्धारण के लिए फॉर्मेलिन (10%) के साथ बदलें।
  12. 80 मिलीलीटर / मिनट पर प्रत्येक 15 मिनट के लिए फिक्सेटिव को तीन बार कुल्ला करने के लिए पीबीएस के साथ फॉर्मेलिन समाधान को बदलें।

4. ऊतक निर्जलीकरण और सुखाने:

नोट: एक ही परफ्यूजन दर (80 मिलीलीटर / मिनट) का उपयोग करें और ऊतक को पूरे आरटी पर रहने दें।

  1. पीबीएस समाधान को 20% पर इथेनॉल के साथ बदलें, अल्ट्रा-शुद्ध पानी में पतला हो गया, और कम से कम 3 घंटे के लिए परफ्यूज करें।
  2. इथेनॉल सांद्रता में वृद्धि की एक श्रृंखला का उपयोग करके दिल को परफ्यूज करें।
    1. इथेनॉल के साथ 20% इथेनॉल समाधान को 30% तक पतला और 2 घंटे के लिए perfuse के साथ प्रतिस्थापित करके शुरू करें।
    2. प्रत्येक पुनरावृत्ति में इथेनॉल एकाग्रता को 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 95%, 95%, 99%, और 100% के माध्यम से प्रत्येक चरण (एकाग्रता) पर 1 घंटे की न्यूनतम अवधि के लिए बढ़ाकर परफ्यूजन को दोहराएं।
      नोट: दिल के नमूने किसी भी इथेनॉल कमजोर पड़ने पर रातभर कोई परफ्यूजन प्रवाह के साथ आराम कर सकते हैं यदि उस एकाग्रता के लिए 15 मिनट का न्यूनतम परफ्यूजन हुआ है।
  3. वैकल्पिक: यदि परफ्यूजन के माध्यम से कंट्रास्ट एजेंटों को लागू करते हैं, तो इसके विपरीत एजेंट पीएमए के साथ पूरक 100% इथेनॉल के साथ दिल को पार करें, 48 घंटे के लिए 1%। 2 ज के लिए 100% इथेनॉल के साथ परफ्यूजन द्वारा कंट्रास्ट एजेंट कुल्ला।
  4. हवा सूखने से पहले हृदय के ऊतकों को सुदृढ़ करने के लिए, 10 मिनट के लिए इथेनॉल और हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस) के 50: 50 मिश्रण को फिर से प्रसारित करें। एक और 2 घंटे के लिए 100% HMDS द्वारा इसका पालन करें।
    सावधानी: एचएमडीएस एक अत्यधिक विषाक्त और हानिकारक पदार्थ है। अमोनिया की एक मजबूत गंध हवा के संपर्क में जारी की जाती है। इसके अलावा, एचएमडीएस का तरल रूप अत्यधिक अस्थिर है और आयोडीन युक्त एजेंटों द्वारा उत्प्रेरित होता है।
  5. टयूबिंग से कैनुले को डिस्कनेक्ट करें और धुएं के हुड के अंदर एक महाधमनी टांके से दिल को निलंबित करें।
  6. ध्यान से दिल पर एक ज़िप-लॉक बैग स्लाइड करें और हवा को प्रसारित करने के लिए दिल के जोखिम को कम करने के लिए टांका पर बैग सील को बंद करें। दिल को 1 सप्ताह के लिए वाष्पीकरण के माध्यम से सूखने दें।
  7. वैकल्पिक: प्रसार-लोडिंग कंट्रास्ट एजेंटों के लिए, आंदोलन करते समय 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में दिल को धोएं। वैक्यूम के तहत 48 घंटे के लिए पीएमए, 1% के साथ पूरक 100% इथेनॉल में दिल को विसर्जित करें। चरण 4.6 को दोहराएँ।

5. माइक्रोसीटी:

नोट: एक डेस्कटॉप एक्स-रे माइक्रोसीटी सिस्टम का उपयोग पिग दिलों की इमेजिंग के लिए किया गया था।

  1. एक उपयुक्त नमूना धारक पर हवा-सूखे दिल माउंट करें। एक्स-रे माइक्रोसीटी माप के दौरान किसी भी आंदोलन को रोकने के लिए नमूना धारक को लंगर डाले गए क्लैंप का उपयोग करके और सूखे और कठोर महाधमनी के माध्यम से दिल को सुरक्षित करें।
  2. सावधानीपूर्वक अपने अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ दिल के नमूने के केंद्र को 0 ° और रोटेशन के 90 ° कोणों के लिए दृश्य के इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र के साथ संरेखित करें। सभी अभिविन्यासों में इसे प्राप्त करने के लिए, नमूना समर्थन के लिए तय एक महाधमनी क्लैंप के माध्यम से हवा में दिल को निलंबित करें।
  3. सॉफ्टवेयर खोलने और एक्स-रे माइक्रोसीटी सिस्टम शुरू करने के बाद, एक्स-रे फ़िल्टर एल्यूमीनियम, 1 मिमी, एक्स-रे स्रोत वोल्टेज को 60 केवी और वर्तमान को 120 μA पर लागू करें। छवि आयामों को 2016 x 1344 पिक्सेल और पिक्सेल आकार को 20 μm पर सेट करें।
  4. नमूना धारक को दृश्य के क्षेत्र से बाहर निकालें और एक फ्लैट-फ़ील्ड सुधार प्राप्त करके पृष्ठभूमि छवि और एक्स-रे एक्सपोज़र समय को कैलिब्रेट करें। सुनिश्चित करें कि औसत पृष्ठभूमि एक्स-रे ट्रांसमिशन 80% से अधिक है।
  5. दिल के अनुदैर्ध्य अक्ष में समग्र इमेजिंग क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए समर्थन की लंबाई के साथ स्काउट एक्स-रे ट्रांसमिशन छवियां। स्कैनिंग के लिए, 0.18 ° के रोटेशन चरण का उपयोग करें, 5 का औसत फ्रेम, और 180 ° का नमूना रोटेशन। नमूना समर्थन की पूर्ण चौड़ाई छवि के लिए ऑफ़सेट स्कैनिंग मोड का चयन करें।
    नोट:: इस अनुभाग में इंगित अधिग्रहण पैरामीटर ensemble दिल संरचना की छवि गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए चुना गया है।
  6. स्कैनिंग के बाद, एक आइसोट्रोपिक तीन आयामी छवि मात्रा के टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। NRecon सॉफ़्टवेयर के आवेदन के लिए, अधिग्रहण से संबंधित विरूपण साक्ष्य सुधार का उपयोग करें, जिसमें 10% के बीम-कठोर प्रभाव और 8 की अंगूठी आर्टिफैक्ट में कमी शामिल है।
  7. डेटा भंडारण सीमाओं को अनुकूलित करने के लिए, ब्याज के न्यूनतम आयताकार क्षेत्र को लागू करें जिसमें हृदय-विशिष्ट छवि voxels शामिल हैं। छवियों को एक छवि स्टैक के रूप में 8-बिट बिटमैप स्वरूप में निर्यात करें.
  8. DataViewer सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पुनर्निर्मित डेटा स्टैक विज़ुअलाइज़ करें. डिजिटल रूप से छवि की सीमाओं के भीतर नमूना उन्मुख करने के लिए छवि की मात्रा के तीन प्रमुख अक्षों के साथ नमूना के लंबे और छोटे अक्षों को फिर से संरेखित करें।
  9. छवि की बाहरी पृष्ठभूमि परतों को हटाने के लिए सभी तीन अक्षों में छवि वॉल्यूम को क्रॉप करें, अधिकतम कुल छवि आकार को कम करने के लिए।

Representative Results

निर्जलीकरण और हवा सुखाने की विधि का उपयोग करके बड़े स्तनधारी दिलों की तैयारी नमूने से सभी पानी की सामग्री को हटा देती है। इथेनॉल द्वारा अपर्याप्त पानी के प्रतिस्थापन के सबूत एचएमडीएस लोडिंग के दौरान देखे जा सकते हैं (प्रोटोकॉल, चरण 4.4 देखें)। एचएमडीएस के तहत पानी की उपस्थिति ऊतक से उठने वाले बुलबुले पैदा करेगी। अत्यधिक पानी के स्तर के मामले में, विसर्जन तरल पदार्थ के तापमान में वृद्धि हो सकती है। प्रारंभिक एचएमडीएस लोडिंग के दौरान विसर्जन कक्ष को बर्फ से घिरा हुआ रखने से ऊतक हीटिंग के दुष्प्रभावों को कम किया जा सकता है। कंट्रास्ट एजेंटों की अनुपस्थिति में हवा-सुखाने वाले दिलों के बाद, नमूना रंग में सफेद दिखाई देगा (प्रोटोकॉल, चरण 4.6 देखें)। बाहरी सतह अक्सर सूखी और संरचनात्मक रूप से intramural परतों से पहले स्थिर था। कंट्रास्ट एजेंट लोडिंग से पहले इथेनॉल में रिंसिंग ने सफेद जमा को हटा दिया (प्रोटोकॉल, चरण 4.7 देखें)। एक तेज ब्लेड का उपयोग करके ऊतक के माध्यम से स्लाइसिंग स्पष्ट अलगाव के साथ मैक्रोस्कोपिक रूप से व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर का पता चलता है। कंट्रास्ट एजेंट माध्यम में दिल के नमूनों को विसर्जित करके कंट्रास्ट लोडिंग नमूने के मोटे और अत्यधिक मांसपेशियों वाले क्षेत्रों में प्रसार सीमा कलाकृतियों से पीड़ित थी। वैक्यूम के तहत प्रसार कंट्रास्ट लोडिंग ने मांसपेशियों में अधिक सजातीय रंग प्रदान किया (दिल का नमूना # 1, कंट्रास्ट एजेंट लोडिंग समय के लिए तालिका 1 देखें)। मैक्रोस्कोपिक रूप से, सतह के विपरीत एजेंट वितरण ने हृदय की मांसपेशियों और मुख्य रूप से बाह्य कोशिकीय घटकों, विशेष रूप से वसा और संयोजी ऊतक से बने क्षेत्रों के बीच इन-सजातीय धुंधला दिखाया। हवा से सूखे ऊतक के नमूने, या तो कंट्रास्ट एजेंट लोडिंग से पहले या बाद में, स्थिर संरचनात्मक अखंडता बनाए रखते हैं।

उपर्युक्त स्कैनिंग पैरामीटर का उपयोग करके माइक्रोसीटी के तहत 20 μm रिज़ॉल्यूशन पर नमूने की पूरी चौड़ाई को स्कैन करने के लिए आवश्यक समय और 1700 एमएस का एक्सपोजर समय 6 ज 34 मिनट था। स्कैनर के गैन्ट्री अक्ष में नमूने के आकार के आधार पर, इस अवधि को नमूने की पूरी लंबाई पर कब्जा करने के लिए आवश्यक पदों की संख्या से गुणा किया गया था। इस अध्ययन में सुअर और भेड़ के दिलों के लिए, तीन से चार पदों का उपयोग किया गया था। NRecon सॉफ़्टवेयर ने एक्स-रे स्रोत और डिटेक्टर के प्रत्येक रोटेशन चरण के लिए एक एकल एक्स-रे प्रोजेक्शन छवि बनाने के लिए बहु-स्थिति और ऑफसेट स्कैन को टाइल किया। कुल मिलाकर, 1000 अनुमानों को 16-बिट छवियों के रूप में संग्रहीत किया जाता है, जिससे 30-40 जीबी डेटा उत्पन्न होता है। पुनर्निर्मित वॉल्यूमेट्रिक छवियां 52-70 जीबी थीं।

वेंट्रिकुलर गुहाओं, सेप्टम और वेंट्रिकल्स की मुक्त दीवारों सहित प्रमुख शारीरिक स्थलों को आसानी से हवा-सूखे सुअर के दिलों के एक्स-रे ट्रांसमिशन इमेजिंग से पहचाना जा सकता था, जो प्रसार-लोडिंग (चित्रा 1 ए) द्वारा इसके विपरीत एजेंट के साथ सना हुआ था। इसके अलावा, माइक्रोस्ट्रक्चरल संगठन को इंगित करने वाले अत्यधिक बनावट वाले क्षेत्र, जैसे कि मायोकार्डियल फाइबर अभिविन्यास, संवेदनशील एक्स-रे क्षीणन / संचरण (चित्रा 1 बी) के कारण भी देखे गए थे। त्रि-आयामी छवि वॉल्यूम के टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण ने एपिकार्डियल और एंडोथेलियल सीमाओं (चित्रा 1 डी) दोनों पर ऊतक और पृष्ठभूमि के बीच अलग-अलग अलगाव दिखाया। इंट्राम्यूरली, कम कंट्रास्ट और वोक्सेल तीव्रता प्रसार ढाल ऊतक के मोटे ट्रांसम्यूरल क्षेत्रों में देखे गए थे। इसके बावजूद, दरार विमानों द्वारा अलग किए गए वास्कुलचर और मायोकार्डियल फाइबर अभी भी आसानी से पहचाने जा सकते थे। इसके विपरीत की एक दूसरी उच्च तीव्रता बैंडविड्थ epicardial-सबसे परत पर और punctate उप-endocardial क्षेत्रों में मनाया गया था। कंट्रास्ट वृद्धि उन साइटों पर सबसे बड़ी थी जहां बाह्य कोशिकीय घटकों को संचित किया गया था, विशेष रूप से एपिकार्डियल संयोजी ऊतक, एपिकार्डियल वसा और पुरकिंजे फाइबर नेटवर्क के संयोजी ऊतक म्यान। वोक्सेल सिग्नल तीव्रता वितरण ने शून्य-तीव्रता पृष्ठभूमि (हवा) और कम और उच्च विपरीत ऊतक (चित्रा 1 डी) की दो प्रमुख आबादी से उच्च अलगाव दिखाया।

माइक्रोसीटी छवि पुनर्निर्माण के विपरीत वृद्धि और दिल के नमूनों के कोलेजनस डिब्बों के लिए चयनात्मकता को मान्य करने के लिए, हिस्टोलॉजी, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया गया था (चित्रा 2)। पूर्व कंट्रास्ट एजेंट-लोडिंग के बिना एक हवा-सूखे दिल से वेंट्रिकुलर ऊतक का एक ट्रांसम्यूरल ब्लॉक पैराफिन एम्बेडिंग और सेक्शनिंग के लिए तैयार किया गया था। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार आसन्न ऊतक स्लाइस को या तो मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग, कोई उपचार नहीं, या पीएमए (1%) के 48 ज द्वारा इलाज किया गया था। स्लाइड-माउंटेड ऊतक वर्गों के विसर्जन ने पूरे दिल के नमूनों में देखे गए धुंधला प्रक्रिया के प्रसार ढाल प्रभावों को समाप्त कर दिया। मेसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग ने उपकला और एंडोथेलियल परतों पर कोलेजन-सकारात्मक धुंधला दिखाया, उप-एपिकार्डियल ऊतक में पेरिवैस्कुलर रूप से, और एक संयोजी ऊतक म्यान जो बाएं वेंट्रिकुलर गुहा (चित्रा 2 ए) में उभरे हुए एक मुक्त-चलने वाले पुरकिंजे फाइबर के आसपास था। उज्ज्वल क्षेत्र की रोशनी ने पीएमए-स्टेनिंग के बाद कोलेजनस संरचनाओं में गहरा रंग दिखाया, जो पीएमए के अधिमान्य संचय का समर्थन करता है (आंकड़े 2 बी, सी)। इसके अलावा, पीएमए उपचार को पहले कोलेजन मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स31 के ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए दिखाया गया है। वेंट्रिकुलर ऊतक वर्गों की फ्लोरोसेंट छवियों में कोलेजन की साइटों पर प्रतिदीप्ति का पीएमए-प्रेरित नुकसान था (चित्रा 2 डी बनाम 2ई, चित्रा 2 डी 'बनाम 2ई' और चित्रा 2 डी 'बनाम 2ई')। उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट इमेजिंग दोनों में, सेलुलर डिब्बों को पीएमए उपचार द्वारा नहीं बदला गया था, और कोलेजन में पीएमए धुंधला होने और ऑटोफ्लोरेसेंस के शमन का चयनात्मक संचय था।

दिल का नमूना # 2 हवा सूखने से पहले परफ्यूजन के माध्यम से एक विपरीत एजेंट के साथ दाग दिया गया था। छवि पुनर्निर्माण से मायोकार्डियल डिब्बे (चित्रा 3 ए) के भीतर अत्यधिक पैची धुंधला होने का पता चला। कंट्रास्ट वृद्धि ऊतक संरचना के अचयनक दिखाई दिया, जिसमें एपिकार्डियल या उप-एंडोकार्डियल क्षेत्रों में सिग्नल तीव्रता में कोई और वृद्धि नहीं हुई। इसके अलावा, कम विपरीत ऊतक पृष्ठभूमि तीव्रता (चित्रा 3 बी) से खराब अलगाव दिखाया।

वेंट्रिकुलर फाइब्रोसिस मायोकार्डियल रोधगलन और पुरानी ischemia (दिल का नमूना # 3) द्वारा प्रेरित किया गया था। संवहनी एम्बोलाइजेशन की साइट पर नीचे की ओर ऊतक में फाइब्रो-फैटी जमा के साथ मायोसाइट्स को बदलकर एक एंटेरो-एपिकल निशान का गठन किया गया था। दिल का नमूना # 3 तैयार किया गया था और पूर्वकाल बाएं वेंट्रिकल, सेप्टम और दाएं वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार को कवर करने वाले एक विच्छेदित वेंट्रिकुलर वेज से चित्रित किया गया था। इस वेंट्रिकुलर वेज कॉन्फ़िगरेशन की तैयारी को पहले32 वर्णित किया गया है और कार्डियक इमेजिंग के लिए वेजेज के आवेदन की विस्तारसे समीक्षा की गई थी। निशान आकृति विज्ञान ट्रांसम्यूरल लेकिन विषम था (चित्रा 4)। एक केंद्रीय घने फाइब्रोटिक घाव एक ढीले और विषम सीमा क्षेत्र (चित्रा 4 ए) से घिरा हुआ था। वेंट्रिकुलर तैयारी को प्रसार-लोडिंग पोस्ट-एयर सुखाने और एक वैक्यूम में दाग दिया गया था। चित्रा 4B-E ऊतक सीमाओं और निशान क्षेत्रों में पुनर्निर्मित माइक्रोसीटी छवि मात्रा की सबसे बड़ी संकेत तीव्रता को दर्शाता है। कंट्रास्ट एजेंटों ने खराब दाग वाले स्वस्थ मायोकार्डियम, फिर भी माइक्रोस्ट्रक्चरल कंट्रास्ट को बरकरार रखा गया था (चित्रा 4 सी')। सीमा क्षेत्र में, निशान ऊतक जीवित मायोकार्डियम (चित्रा 4 डी') के साथ interspersed था। घने फाइब्रोसिस ट्रांसम्यूरल अभी तक बनावट दिखाई दिए, जो संरचना में विचरण का संकेत देते हैं (चित्रा 4ई')। हवा-सूखे और पीएमए-दाग ऊतक तैयारी के एक ट्रांसम्यूरल बाएं वेंट्रिकुलर क्षेत्र के ऊतक वर्गों का उपयोग मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग (चित्रा 4 एफ) के खिलाफ तुलना करके पैथोलॉजिकल ऊतक में कोलेजन के लिए पीएमए चयनात्मकता को मान्य करने के लिए किया गया था। पीएमए धुंधला कोलेजन (उप-एपिकार्डियम और उप-एंडोकार्डियम) के लिए चयनात्मक था और जीवित मायोकार्डियम (चित्रा 4 जी) के क्षेत्रों में अनुपस्थित था।

प्रेरित लगातार अलिंद फिब्रिलेशन के साथ दिल का नमूना # 4 अलिंद गुहा के मूल आकार को संरक्षित करते हुए हवा से सुखाया गया था। एट्रियल उपांग पतन नहीं देखा गया था। प्रमुख शारीरिक स्थलों को पुनर्निर्मित छवियों (अलिंद सेप्टम, पेक्टिनेट मांसपेशियों, कोरोनरी साइनस, फुफ्फुसीय शिरा ओस्टिया, वेना कावा और क्रिस्टे टर्मिनलिस) से रूपात्मक रूप से पहचाना जा सकता है। वैक्यूम के तहत प्रसार-धुंधला महाधमनी जड़ और एट्रियोवेंट्रिकुलर वाल्व और काम करने वाले मायोकार्डियम के असतत क्षेत्रों में इसके विपरीत वृद्धि के परिणामस्वरूप हुआ। मांसपेशियों को धुंधला करने की वृद्धि अलिंद उपांगों और बाएं और दाएं दोनों एट्रिया (चित्रा 5) के पीछे की दीवारों के लिए विवश थी।

Figure 1
चित्रा 1: वैक्यूम के तहत प्रसार द्वारा पीएमए कंट्रास्ट एजेंट के साथ इलाज किए गए एक हवा-सूखे सुअर के दिल की माइक्रोसीटी इमेजिंग। (ए) एक्स-रे प्रक्षेपण छवि। (बी) ए में लाल रेखा से निकाला गया एक संचरण प्रोफ़ाइल (सी) एक टोमोग्राफिक रूप से पुनर्निर्मित तीन आयामी मात्रा से वेंट्रिकल का लघु-अक्ष टुकड़ा। पीले तीर उप-एंडोकार्डियल पुरकिंजे फाइबर के लिए जिम्मेदार विपरीत के पंक्टेट क्षेत्रों को इंगित करते हैं। नीले तीर वास्कुलचर को इंगित करते हैं। (डी) सी एलवी में दिखाए गए पुनर्निर्मित छवि स्लाइस का सिग्नल तीव्रता वितरण: बाएं वेंट्रिकल और आरवी: दाएं वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कोलेजन के लिए पीएमए-चयनात्मकता का सत्यापन। (ए) एक हवा-सूखे दिल के वेंट्रिकल्स से एक ट्रांसम्यूरल ऊतक अनुभाग के मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग। मायोकार्डियम लाल रंग में दागदार है और कोलेजन को हरे रंग के साथ दिखाया गया है। आसन्न ऊतक वर्गों (बी) धुंधला या (सी) पीएमए (1%) के साथ दाग के अनुपस्थित रंग की एकरूपता का आकलन करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के साथ चित्रित किया गया था। (डी) पीएमए द्वारा दाग या (ई) दाग के अनुपस्थित ऊतक वर्गों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। पैनल डी ' (ठोस लाल बॉक्स) और ई' (धराशायी लाल बॉक्स) बिना दाग और पीएमए-दाग वर्गों के लिए उप-एपिकार्डियम के बढ़े हुए दृश्य हैं। पैनल डी ' (ठोस नीला बॉक्स) और ई ' (धराशायी नीला बॉक्स) उप-एंडोकार्डियम और एक मुक्त-चल रहे पुरकिंजे फाइबर के संबंधित बढ़े हुए दृश्य हैं। तीर कोलेजन सामग्री की साइटों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: हवा सुखाने और माइक्रोसीटी इमेजिंग से पहले पीएमए का परफ्यूजन-लोडिंग। (ए) एक सुअर के दिल से वेंट्रिकल की पुनर्निर्मित छवि मात्रा का एक लघु-अक्ष टुकड़ा। नीले तीर वास्कुलचर को इंगित करते हैं। (बी) पैनल ए से छवि स्लाइस का संकेत तीव्रता वितरण। एलवी: बाएं वेंट्रिकल और आरवी: दाएं वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र4: एक पुरानी मायोकार्डियल रोधगलन से पीड़ित भेड़ के दिल की माइक्रोसीटी इमेजिंग। (ए) एपिकल क्षेत्र में एक घने निशान का गठन किया गया था (इनसेट फोटोग्राफ देखें)। एक एंडोकार्डियल परिप्रेक्ष्य से एपिकल क्षेत्र का एक वॉल्यूम रेंडरिंग छवि तीव्रता के आधार पर रंग सौंपा गया था (हरे रंग में निशान ऊतक और मायोकार्डियम के अनुरूप लाल)। ग्रेस्केल तीव्रता के ऑर्थोगोनल स्लाइस घने निशान वितरण और सीमावर्ती जीवित मायोकार्डियम को दिखाते हैं। फाइब्रोटिक ऊतक और मायोकार्डियम के बीच अलगाव वसा ऊतक के क्षेत्रों से मेल खाता है। (बी) मायोकार्डियल रोधगलन के बाद एपिकल स्कारिंग के साथ एक भेड़ से एक हवा-सूखे वेंट्रिकुलर वेज तैयारी की एक तस्वीर। पुनर्निर्मित माइक्रोसीटी छवि मात्रा के तिरछे स्लाइस आधार और शीर्ष के बीच मध्य स्तर पर वेंट्रिकल्स को पार करते हैं और (सी) संवहनी रोड़ा (पैनल बी में सी- लाल रेखा), (डी) घने निशान और स्वस्थ मायोकार्डियम (पैनल बी में डी-ब्लू लाइन) और (ई) घने फाइब्रोसिस का एक क्षेत्र (पैनल बी में ई - हरी रेखा)। (C') सी में एक लाल डैश्ड बॉक्स द्वारा उल्लिखित सेप्टल क्षेत्र का एक विस्तारित दृश्य। (D') सही वेंट्रिकुलर एपेक्स (पैनल डी में नीला धराशायी बॉक्स) में इंफार्क्ट क्षेत्र का एक विस्तारित दृश्य। (E') बाएं वेंट्रिकुलर एपेक्स (पैनल ई में हरे धराशायी बॉक्स) में इन्फार्क्ट क्षेत्र का एक विस्तारित दृश्य। एलवी: बाएं वेंट्रिकुलर गुहा; आरवी: सही वेंट्रिकुलर गुहा; MB: मॉडरेटर बैंड; पैप: पैपिलरी मांसपेशी। पीला तीर बाएं पूर्वकाल अवरोही धमनी को इंगित करता है। (एफ) पीएमए-दाग वाले हवा-सूखे बाएं वेंट्रिकल से काटे गए हिस्टोलॉजिकल सेक्शन के मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग। कोलेजन नीले रंग का है और मायोकार्डियम गुलाबी / बैंगनी रंग का दाग है। (जी) पीएमए-स्टेनिंग वितरण का एक संबंधित ऊतक अनुभाग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: क्रोनिक प्रेरित अलिंद फिब्रिलेशन के बाद एक भेड़ के दिल की माइक्रोसीटी छवि। (A) चित्र 4A के रूप में असाइन किए गए रंग के साथ एट्रिया का एक आयतन प्रतिपादन। (बी) दिल की लंबी धुरी में द्वि-अलिंद माइक्रोसीटी छवि स्लाइस। लघु-अक्ष स्लाइस (सी) एट्रिओवेंट्रिकुलर वाल्व (पैनल बी में सी- लाल रेखा), (डी) महाधमनी जड़ (पैनल बी में डी- नीली रेखा) और (ई) बाएं अलिंद छत (ई- ग्रीन लाइन इनपेनल बी) के स्तर पर निकाले गए थे। ला: छोड़ दिया atria; आरए: सही atria; LAA: बाएं अलिंद उपांग; आरएए: सही अलिंद उपांग; एलवी: बाएं वेंट्रिकल; आरवी: सही वेंट्रिकल; एलवीओटी: बाएं वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ; आरवीओटी: सही वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ और पीए: फुफ्फुसीय धमनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना # 1 2 3 4
प्रजातियां सुअर सुअर भेड भेड
शरीर का वजन (kg) 32.4 31.2 47.2 53.4
दिल का वजन (जी) 191.2 186.2 202.4 207.6
पैथोलॉजी - - क्रोनिक एमआई क्रोनिक AF
नमूना तैयारी पूरा दिल पूरा दिल पूर्वकाल हृदय की कील पूरा दिल
कंट्रास्ट लोडिंग का मोड विसरण छिड़काव विसरण विसरण
कंट्रास्ट एजेंट एक्सपोजर (ज) 48 24 48 48

तालिका 1: दिल के नमूने और इसके विपरीत एजेंट उपचार।

Discussion

बाद के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक इमेजिंग के लिए बड़े स्तनधारियों से पूरे दिल का उपयोग करके बड़े ऊतक की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल निर्धारित किया गया है। एक हवा सुखाने के दृष्टिकोण ने पृष्ठभूमि एक्स-रे क्षीणन के प्रभावों को हटा दिया और ऊतक को अधिकतम रूप से अनुकूलित किया: पृष्ठभूमि विपरीत29। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, व्यास में 7.2 सेमी तक के नमूनों में वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के लिए 20 μm की सीमा में एक आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया गया था। नरम ऊतक का माइक्रोसीटी हालांकि आमतौर पर एक्स-रे अवशोषण और माइक्रोसीटी सिस्टम की संवेदनशीलता को सुधारने के लिए गैर-विशिष्ट विपरीत एजेंटों के उपयोग पर निर्भर करताहै। यद्यपि एक्स-रे कंट्रास्ट एजेंट समग्र एक्स-रे क्षीणन और नरम ऊतक इमेजिंग वृद्धि में सुधार करते हैं, जैव रासायनिक संरचना के आधार पर ऊतक घटकों का अलगाव चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। हालांकि, यह देखा गया कि प्रयोगशाला सेटिंग, पीएमए, चुनिंदा रूप से सना हुआ बाहरी घटकों में एक सामान्य एक्स-रे कंट्रास्ट एजेंट के साथ संयोजन में हवा-सूखे दिलों का उपयोग करना। स्वस्थ मायोकार्डियम और पुरानी बीमारियों में पैथोलॉजिकल संरचनात्मक remodeling के साथ जुड़े संयोजी ऊतक को बढ़ाया गया था।

हवा सुखाने वाले जैविक ऊतक की प्रक्रिया नमूने के विरूपण का विरोध करने के लिए एक हस्तक्षेप की मांग करती है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी में समान आवश्यकताएं हैं। आमतौर पर, एक महत्वपूर्ण-बिंदु सुखाने की विधि को नियोजित किया जाता है, जो ऊतक की तरल सामग्री की सतह के तनाव को खत्म करने के लिए ऊतक विसर्जन माध्यम, तापमान और दबाव के संतुलन का उपयोग करता है, जो वाष्पीकरण35 पर आणविक स्तर पर विरूपण का कारण बनता है। इस दृष्टिकोण के लिए तरल कार्बन डाइऑक्साइड के साथ नमूने की पानी की सामग्री के समान प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है, जो छोटे और आसानी से अलग-अलग नमूनों में अधिक विश्वसनीय है। वैकल्पिक रूप से, ऊतक की संरचनात्मक अखंडता में सुधार किया जा सकता है और हवा-सुखाने, यानी, वाष्पीकरण चरण को समग्र विरूपण को कम करने के लिए लंबी अवधि में लागू किया जा सकता है। अणु एचएमडीएस ऊतक के नमूने36 के आणविक संगठन को सुदृढ़ और स्थिर करने के लिए एक सिलिकॉन-आधारित पाड़ बनाने के लिए सिलिलेशन से गुजरता है। वाष्पीकरण को पर्यावरण से परिसंचारी हवा की धाराओं को सीमित करके आगे बढ़ाया जाता है, विशेष रूप से नमूना सतह और इंट्राम्यूरल परतों के बीच असमान वाष्पीकरण से बचने के लिए भी।

कई कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग पहले नरम ऊतकों के माइक्रोसीटी इमेजिंग के लिए किया गया है। सबसे आम आयोडीन, फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड (पीटीए) और पीएमए हैं। आयोडीन विशेष रूप से एक उच्च प्रसार दर 34,37,38 के कारण नियोजित किया गया है। फिर भी, आयोडीन एचएमडीएस अभिकर्मक36 के सिलिलेशन के लिए उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है। उत्प्रेरित प्रतिक्रिया आक्रामक और एक्सोथर्मिक है, जिसमें नमूने के विनाश और सुरक्षा जोखिम का उच्च जोखिम होता है यदि अवशिष्ट एचएमडीएस नमूने के अधूरे निर्जलीकरण के कारण रहता है। इथेनॉल में घुले पीटीए और पीएमए दोनों को एचएमडीएस के साथ संयोजन के रूप में सुरक्षित रूप से उपयोग किया जा सकता है। पीटीए और पीएमए को आयोडीन स्टेनिंग38 की तुलना में गैर-खनिजीकृत इंटरवर्टेब्रल डिस्क में ठीक संरचनाओं की अधिक से अधिक समाधान शक्ति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। स्तनधारी नमूनों के माइक्रोसीटी इमेजिंग में, पीटीए और पीएमए का उपयोग माउस भ्रूण39, माउस कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम37, खरगोश की मांसपेशियों और मस्तिष्क40, और पोर्सिनी नसों41 को धुंधला करने के लिए किया गया है। पीटीए में पीएमए की तुलना में समाधान में एक उच्च आणविक द्रव्यमान और घनत्व होता है। यह आंशिक रूप से टंगस्टन के उच्च परमाणु द्रव्यमान के कारण होता है (परमाणु संख्या 74 ग्राम / मोल है), पीटीए में प्रमुख क्षीण तत्व। तुलनात्मक रूप से, पीएमए में सबसे भारी तत्व, मोलिब्डेनम, में 42 ग्राम / मोल की परमाणु संख्या है। दोनों परमाणु द्रव्यमान और नमूना घनत्व नमूना मोटाई42 के अलावा, एक्स-रे क्षीणन underlie. नमूना आकार को बढ़ाकर एक्स-रे पथ की लंबाई को बढ़ाते हुए, एक्स-रे क्षीणन बढ़े हुए नमूना घनत्व के प्रति अधिक संवेदनशील हो जाता है। इसलिए, कम घनत्व वाले पीएमए कंट्रास्ट एजेंट को अधिक क्षीणन के जोखिम को कम करने और मानव जैसे पैमाने के दिलों के लिए छवि कंट्रास्ट की गतिशील सीमा को अनुकूलित करने के लिए चुना गया था। आगे के सबूतों से पता चला है कि पीएमए का प्रसार-लोडिंग कार्डियक ऊतक43 में बड़े अणु पीटीए की तुलना में अधिक सजातीय धुंधला देता है।

कंट्रास्ट एजेंट डिलीवरी की विधि हृदय ऊतक (चित्रा 3) में कंट्रास्ट एजेंट वितरण की एकरूपता को प्रभावित करती है। इथेनॉल-निर्जलित दिल में कंट्रास्ट एजेंटों के परफ्यूजन ने चर संवहनी प्रतिरोध के कारण पीएमए के पैची पृष्ठभूमि धुंधला स्तरों को दिखाया। हवा-सूखे दिल में, मांसपेशी लैमिनर संरचना को नमूना desication प्रक्रिया द्वारा जोर दिया जाता है, जिससे मांसपेशियों के लैमिनर अलगाव में वृद्धि होती है। इसने अंततः प्रसार-आधारित कंट्रास्ट एजेंट लोडिंग के लिए ऊतक की समग्र पारगम्यता में सुधार किया। नतीजतन, हवा-सुखाने ने ऊतक की सुविधा प्रदान की: लैमिनर और इंट्रा-लैमिनर स्तरों पर हवा के विपरीत (चित्रा 4)। इसके अलावा, प्रसार-लोडिंग को एक वैक्यूम के तहत आवेदन द्वारा आगे सुविधाजनक बनाया जा सकता है। यह आगे दिखाया गया है कि गैर-सूखे नमूनों का ऊतक संकोचन कंट्रास्ट एजेंट एकाग्रता40 पर निर्भर करता है। हालांकि, हवा सुखाने से नमूने का पूर्व रूपात्मक स्थिरीकरण ऊतक संकोचन प्रभाव को रोकताहै 29।

पूरे अंगों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोसीटी छवियां स्वाभाविक रूप से बड़े डेटा वॉल्यूम का उत्पादन करती हैं। टोमोग्राफिक इमेजिंग तकनीकों की प्रकृति एक स्लाइस-बाय-स्लाइस आधार पर विज़ुअलाइज़ेशन और छवि हैंडलिंग को सक्षम बनाती है, जो कंप्यूटर प्रसंस्करण और मेमोरी बोझ को कम करती है। हालांकि, तीन आयामी छवि स्टैक की कल्पना करने के लिए, उदाहरण के लिए, तीन आयामी प्रतिनिधित्व में नमूना वॉल्यूम रेंडर करने के लिए, अनुशंसित न्यूनतम कंप्यूटर विनिर्देश 128 GB RAM और 3 GHz की प्रोसेसर गति हैं। सॉलिड-स्टेट हार्ड ड्राइव ने डेटा हस्तांतरण में भी बहुत सुधार किया है।

कार्डियक क्षेत्र में माइक्रोसीटी इमेजिंग का उद्भव ट्रांसलेशनल अध्ययन और नैदानिक सत्यापन के लिए कई फायदे प्रदान करता है। इसके तीन आयामी और माइक्रोमेट्रिक इमेजिंग के लाभों ने पहले से ही एसटी-ऊंचाई मायोकार्डियल इस्केमिया रोगियों के थ्रोम्बोटिक बोझ को निर्धारित करने में अनुप्रयोगों को दिखायाहै 44,45। संरचनात्मक हृदय रोग के रोगियों में अतालता के संभावित स्रोतों का मानचित्रण काफी हद तक फाइब्रोटिक निशान ऊतक के वितरण को निर्धारित करने और जीवित मायोकार्डियम के इंटरवीविंग पटरियों को स्थानीयकृत करने पर निर्भर करता है। वेंट्रिकुलर अतालता के निदान के लिए दूसरी पंक्ति के दृष्टिकोण चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग46 का उपयोग करते हैं। यह मजबूत रूप से घने फाइब्रोसिस को स्थानीयकृत कर सकता है लेकिन कम-रिज़ॉल्यूशन रूपात्मक लक्षण वर्णन तक सीमित है और माइक्रोस्ट्रक्चरल रीमॉडलिंग और फाइब्रोटिक घावों के फैलाव वितरणमें सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। निशान वितरण और लक्षण वर्णन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन परीक्षा में कार्डियक संरचनात्मक रीमॉडलिंग की हमारी समझ में सुधार और दिल की विफलता के विकास के जोखिम में सुधार करने की विशाल क्षमता है। विशेष रूप से, मौलिक अनुसंधान अध्ययन या पोस्टमार्टम जांच कार्डियक अतालता के विद्युत मानचित्रण के लिए पुष्ट संरचनात्मक छवियों से लाभान्वित होगी।

अंत में, एचएमडीएस उपचार और हवा-सुखाने के साथ प्रबलित दिलों को बाद में एक्स-रे कंट्रास्ट एजेंट के साथ दाग दिया जा सकता है ताकि बाहरी घटकों के एक्स-रे क्षीणन को बढ़ाया जा सके। विशेष रूप से, स्वस्थ मायोकार्डियम में, पीएमए संचय उपकला, वाल्वुलर ऊतक, और संयोजी ऊतक द्वारा म्यान किए गए वेंट्रिकुलर चालन प्रणाली के डिब्बों में होता है, जिसके परिणामस्वरूप एक्स-रे क्षीणन में वृद्धि होती है। इसके अलावा, संरचनात्मक रूप से रोगग्रस्त मायोकार्डियम में, बढ़ाया विपरीत फाइब्रोसिस के लिए आगे चयनात्मक था।

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

इस अध्ययन को राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर), अनुदान संदर्भ एएनआर -10-आईएएचयू -04, और लेडुक्यू फाउंडेशन (रिदम नेटवर्क) द्वारा प्रबंधित "भविष्य के निवेश" कार्यक्रम के हिस्से के रूप में फ्रांसीसी सरकार से वित्तीय सहायता प्राप्त हुई, साथ ही अनुदान संदर्भ एएनआर -17-सीई 14-0029-01 [यूएनएमएससी], कार्डियोवैस्कुलर रोगों में यूरोपीय अनुसंधान क्षेत्र से वित्त पोषण (ईआरए-सीवीडी), अनुदान संदर्भ H2020-HCO-2015 से वित्त पोषण 680969। अनुदान संदर्भ 2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 और ANR-19-ECVD-0006-01।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Diapath F0043
Calcium chloride solution Honeywell 21114
Canulation Tubing PTFE VWR DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir Harvard Apparatus 50-0496
D-(+)-Glucose Sigma G5767
Ethanol absolute VWR 20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma 796881
Heparin sodium (5000 U/mL) Panpharma 3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37% Sigma 258148
Magnesium chloride solution Honeywell 63020
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5368
Phosphomolybdic acid hydrate Fisher Scientific 417895000
Potassium Chloride Sigma P5405
Pump Tubing, 3-Stop Ismatec FV-96328-48
SkyScan, 1276 Bruker micro CT
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium Chloride Sigma S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O Sigma 415413
Tube Connector Kits Harvard Apparatus 72-1407
Tubing pump Ismatec ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm VWR 228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm VWR 228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL Norm-Ject 4850001000 Pyrogen-free, PVC-free

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Pallares-Lupon, N., Bayer, J. D., Guillot, B., Caluori, G., Ramlugun, G. S., Kulkarni, K., Loyer, V., Bloquet, S., El Hamrani, D., Naulin, J., Constantin, M., Dos Santos, P., Bernus, O., Jaïs, P., Pasdois, P., Walton, R. D. Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease. J. Vis. Exp. (180), e62909, doi:10.3791/62909 (2022).

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