Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en muestras de tejido retiniano ex vivo

Resumen

Aquí se describe un protocolo detallado para realizar el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de velocidad glucolítica en muestras de tejido retiniano ex vivo utilizando un bioanalizador comercial.

Resumen

La respiración mitocondrial es una vía crítica de generación de energía en todas las células, especialmente en los fotorreceptores de la retina que poseen un metabolismo altamente activo. Además, los fotorreceptores también exhiben una alta glucólisis aeróbica como las células cancerosas. Las mediciones precisas de estas actividades metabólicas pueden proporcionar información valiosa sobre la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y en estados de enfermedad. Se han desarrollado ensayos basados en microplacas de alto rendimiento para medir la respiración mitocondrial y diversas actividades metabólicas en células vivas. Sin embargo, una gran mayoría de estos están desarrollados para células cultivadas y no han sido optimizados para muestras de tejido intacto y para su aplicación ex vivo. Aquí se describe un protocolo detallado paso a paso, utilizando tecnología de fluorescencia basada en microplacas, para medir directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como indicador de la respiración mitocondrial, así como la tasa de acidificación extracelular (ECAR) como indicador de glucólisis, en tejido retiniano ex vivo intacto. Este método se ha utilizado para evaluar con éxito las actividades metabólicas en la retina del ratón adulto y demostrar su aplicación en la investigación de los mecanismos celulares del envejecimiento y la enfermedad.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos esenciales que regulan el metabolismo celular, la señalización, la homeostasis y la apoptosis mediante la coordinación de múltiples procesos fisiológicos ^cruciales1. Las mitocondrias sirven como la fuente de energía en la célula para generar trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y proporcionar energía que soporta casi todos los eventos celulares. La mayoría del oxígeno celular se metaboliza en las mitocondrias, donde sirve como el aceptor final de electrones en la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la respiración aeróbica. También se pueden producir bajas canti....

Protocolo

Todos los protocolos de ratón fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional del Ojo (NEI ASP # 650). Los ratones fueron alojados en condiciones de luz-oscuridad de 12 h y cuidados siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Cartucho del sensor hidratante y preparación del medio de ensayo

1. El día antes del experimento, agregue 1 ml del medio de calibración a cada pozo de la placa de utilidad. Colo....

Resultados

Los datos reportados aquí son ensayos representativos de estrés mitocondrial que muestran trazas de OCR (Figura 1) y ensayos de tasa glucolítica que muestran trazas de OCR y trazas de ECAR (Figura 2), que se realizaron utilizando discos perforados de retina de 1 mm recién diseccionados de ratones transgénicos Nrl-L-EGFP de 4 meses de ^edad36 (fondo C57B / L6). Estos ratones expresan GFP específicamente en fotorreceptores de bastón.......

Discusión

Aquí se proporcionan instrucciones detalladas para realizar ensayos basados en microplacas de la respiración mitocondrial y la actividad de la glucólisis utilizando discos perforadores de retina recién diseccionados ex vivo. El protocolo se ha optimizado para: 1) garantizar el uso de un medio de ensayo adecuado para el tejido retiniano ex vivo; 2) emplear el tamaño adecuado de los discos perforadores de retina para obtener lecturas de OCR y ECAR que se encuentren dentro del rango de detección óptimo de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Desoxiglucosa (2-DG), 500 mM solución madre	Sigma	D6134	Disolver en medio Seahorse XF DMEM, preparar con anticipación
aguja de calibre 30	BD Precision Glide	305106
Antimicina A, solución madre de 10 mM	Sigma	A8674	Disolver en DMSO, preparar con anticipación
Bam15, 10 mM de stock solución	TimTec	ST056388	Disolver en DMSO, preparar con anticipación
Perforadora de biopsia, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning Life Sciences	CB40240
cámara de asfixia con CO2 pinza
de disección-Dumont #5	Fine Science Tools	11251-10
Disección de punta recta pinzas-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	Punta curva
Microscopio
DMSO	Sigma	D2438
Pinzas Graefe	Fine Science Tools	11051-10	Microtijeras curvas, punta dentada
	Fine Science Tools	15004-08 Solución de	con punta curvada
, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	Solución acuosa, prepárese con anticipación
Rotenona, solución madre de 10 mM	Sigma	R8875	Disolver en DMSO, preparar con anticipación
Medio de calibración Seahorse	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucosa	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100 mM piruvato	Agilent	103578-100
Caballito de mar XF 200 mM glutamina	Agilent	103579-100
Caballito de mar XF DMEM medio	Agilent	103575-100	pH 7.4, con 5 mM HEPES
Caballito de mar XFe24 Captura de islotes FluxPak	Agilent	103518-100	que contiene cartucho sensor y microplaca de captura de islotes
Seahorse XFe24, Analizador de flujo extra celular	Agilent
Solución de bicarbonato de sodio, 0,1 M	Sigma-Aldrich	S5761	Solución acuosa, preparar con anticipación
Cepillo de pestañas superfino	Ted Pella	113

de disección NaOH