Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Resumen

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca²⁺ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Resumen

El Ca²⁺ mitocondrial desempeña un papel fundamental en el control de la amortiguación citosólica del Ca^2+, el metabolismo energético y la transducción de señales celulares. La sobrecarga de Ca²⁺ mitocondrial contribuye a diversas afecciones patológicas, incluida la neurodegeneración y la muerte celular apoptótica en enfermedades neurológicas. Aquí presentamos un enfoque molecular específico de tipo celular y dirigido a mitocondrias para imágenes mitocondriales de Ca²⁺ en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Construimos plásmidos de ADN que codifican indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dirigidos a mitocondrias con promotores específicos de astrocitos y neuronas gfaABC1D y CaMKII y secuencia dirigida a mitocondrias (mito-). Para las imágenes mitocondriales in vitro de Ca^2+, los plásmidos se transfectaron en astrocitos y neuronas cultivados para expresar GCaMP5G/6s. Para las imágenes mitocondriales in vivo de Ca^2+, se prepararon vectores virales adenoasociados (AVA) e inyectaron en los cerebros de los ratones para expresar GCaMP5G/6s en mitocondrias en astrocitos y neuronas. Nuestro enfoque proporciona un medio útil para obtener imágenes de la dinámica mitocondrial de Ca^{2 +} en astrocitos y neuronas para estudiar la relación entre la señalización citosólica y mitocondrial de Ca^{2 +,} así como las interacciones astrocito-neurona.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares dinámicos y se consideran como las centrales eléctricas celulares para la producción de energía. Por otro lado, las mitocondrias pueden absorber Ca²⁺ a la matriz en respuesta a las elevaciones locales o citosólicas de Ca^2+. La absorción mitocondrial de Ca²⁺ afecta la función mitocondrial, incluidos los procesos metabólicos como las reacciones en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa, y regula las proteínas sensibles al Ca²⁺en condiciones fisiológicas^1,2,3

Protocolo

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Missouri-Columbia.

1. Construcción de plásmidos de ADN

NOTA: Para imágenes in vitro e in vivo, se construyen plásmidos de ADN que codifican GCaMP5G/6s con promotores específicos de astrocitos y neuronas y secuencias de orientación mitocondrial.

1. Insertar la secuencia dirigida a la matriz mitocondrial (MM) (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG

Resultados

El objetivo de este estudio fue proporcionar una metodología para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca²⁺ utilizando GECI en astrocitos y neuronas in vitro e in vivo. Aquí se presentan los resultados de las imágenes mitocondriales de Ca²⁺ in vitro e in vivo.

Señalización in vitro mitocondrial de Ca²⁺ en astrocitos y neuronas cultivadas

Discusión

En este artículo, proporcionamos un método y protocolo para obtener imágenes de señales mitocondriales de Ca^{2 +} en astrocitos y neuronas. Implementamos estrategias específicas de mitocondrias y tipo de célula para expresar GECI GCaMP5G/6s. Para dirigirnos a GCaMP5G/6s en mitocondrias, incluimos una secuencia dirigida a mitocondrias en los plásmidos. Para expresar GCaMP5G/6s en astrocitos y neuronas in vivo,insertamos un promotor específico de astrocitos gfaABC1D y un promotor específico de neuronas Ca.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pomada de lágrimas artificiales	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% vaselina blanca
Pegamento de cianoacrilato	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesivo
Microscopio estereoscópico de disección	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Pinzas Dumont con punta fina	Fine Science Tools	11255-20	para la extracción de
duramadre Deslizamientos de cubierta de vidrio, 0,13-0,17 mm de espesor	Fisher Scientific	12-542A	para cubierta de ventana craneal
Microtaladro de alta velocidad	Fine Science Tools	18000-17	con broca para pulir huesos
Jeringa de inyección	Hamilton	2,5 ml	para inyección viral
Ketamina	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg de peso corporal
Agarosa de bajo punto de fusión	Sigma-Aldrich	A9793	Artefactos de movimiento reductor Estructura
metálica	Hecho a medida	ver Fig. 1	para la fijación del cerebro a la etapa del microscopio
Controlador de bomba de microjeringa	World Precision Instruments	UMP3	Controlador de velocidad de inyección
Dispositivo estereotáxico de ratón	Stoelting	51725	para sujetar ratones
Cámara de perfusión	Warner Instruments	64-0284
Sistema de perfusión	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Almohadilla térmica autorregulable	Fine Science Tools	21061	para prevenir la hipotermia de ratones
Sulforhodamina 101	Invitrogen	S-359	colorante fluorescente rojo para marcar astrocitos
Tijeras quirúrgicas, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	para disección
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	para la limpieza de material
Xilacina	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg de peso corporal