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Immunology and Infection

पोस्ट-इन्फेक्शियस यूवाइटिस के लिए एक मॉडल के रूप में प्राइमेड माइकोबैक्टीरियल यूवाइटिस (पीएमयू)

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/62925
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology, University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences, University of Bristol

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में प्राइमेड माइकोबैक्टीरियल यूवेइटिस (पीएमयू) को प्रेरित करने के चरणों को रेखांकित करता है। यह विधि माउस मॉडल सिस्टम में विश्वसनीय और मजबूत ओकुलर सूजन का उत्पादन करने में मदद करने के लिए चरणों को रेखांकित करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने इम्यूनोलॉजिकल, ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक परख के साथ आगे के मूल्यांकन के लिए एकल जानवरों से यूविटिक आंखें और सूजन रहित साथी आंखें उत्पन्न कीं।

Abstract

शब्द 'यूवाइटिस' स्थितियों के एक विषम सेट का वर्णन करता है जो सभी इंट्राओकुलर सूजन की विशेषता है। मोटे तौर पर, यूवाइटिस को एटियलजि द्वारा परिभाषित किया जाता है: संक्रमण या ऑटोइम्यूनिटी। संक्रामक यूवाइटिस को उपयुक्त रोगाणुरोधी एजेंटों के साथ उपचार की आवश्यकता होती है, जबकि ऑटोइम्यून यूवाइटिस को कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स या अन्य इम्यूनोसप्रेसिव एजेंटों के साथ उपचार की आवश्यकता होती है। पोस्ट-संक्रामक यूवाइटिस क्रोनिक यूवाइटिस का एक रूप है जिसे प्रारंभिक संक्रमण के बाद प्रतिरक्षा सीक्वेल को नियंत्रित करने के लिए कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स की आवश्यकता होती है। माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) संक्रमण से जुड़े यूवाइटिस पोस्ट-संक्रामक यूवाइटिस का एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त रूप है, लेकिन रोग के तंत्र को पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एमटीबी संक्रमण के बाद पुरानी ओकुलर सूजन को उत्तेजित करने में माइकोबैक्टीरियल एंटीजन और जन्मजात लिगेंड की भूमिका को समझने के लिए, चूहों में उपयोग के लिए मॉडल प्राइमेड माइकोबैक्टीरियल यूवाइटिस (पीएमयू) विकसित किया गया था। यह पांडुलिपि पीएमयू उत्पन्न करने और कलर फंडस और ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) इमेजिंग का उपयोग करके सूजन के नैदानिक पाठ्यक्रम की निगरानी के तरीकों को रेखांकित करती है। पीएमयू को गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियल अर्क के साथ टीकाकरण द्वारा प्रेरित किया जाता है, जिसके बाद सात दिन बाद उसी अर्क को एक आंख में इंट्राविट्रल इंजेक्शन दिया जाता है। ओकुलर सूजन को विवो इमेजिंग में अनुदैर्ध्य रूप से निगरानी की जाती है और इसके बाद हिस्टोलॉजी, फ्लो साइटोमेट्री, साइटोकिन विश्लेषण, क्यूपीसीआर, या एमआरएनए अनुक्रमण सहित परख की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नमूना संग्रह किया जाता है। पीएमयू का माउस मॉडल एमटीबी के ओकुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी नया उपकरण है, क्रोनिक यूवाइटिस का तंत्र, और नए विरोधी भड़काऊ उपचारों के प्रीक्लिनिकल प्रभावशीलता परीक्षणों के लिए।

Introduction

शब्द 'यूवाइटिस' स्थितियों के एक विषम सेट का वर्णन करता है जो सभी इंट्राओकुलर सूजन1 की विशेषता है। यूवाइटिस के पशु मॉडल रोग तंत्र को समझने और नए उपचारों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैं। यूवाइटिस के कई पशुमॉडल स्थापित किए गए हैं। जिन दो का सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, वे प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून यूवाइटिस (या यूवेरेटिनिटिस) हैं; ईएयू) और एंडोटॉक्सिन-प्रेरित यूवाइटिस (ईआईयू)। ईएयू आमतौर पर ओकुलर एंटीजन के साथ टीकाकरण द्वारा उत्पन्न होता है या अनायास हो सकता है जब एआईआरई जीन 3,4 की अनुपस्थिति में केंद्रीय सहिष्णुता बाधित होती है। मॉडल के अन्य रूपों को तब से विभिन्न यूविटोजेनिक पेप्टाइड्स को शामिल करने के लिए 5,6,7 विकसित किया गया है; इनकी व्यापक रूप से समीक्षा की गईहै 8,9,10। ईएयू टी सेल-निर्भर ऑटोइम्यून यूवाइटिस के रूपों के लिए प्राथमिक मॉडल है जैसे कि वोग्ट-कोयनागी-हरादा रोग और मनुष्यों में बर्डशॉट कोरिओरेटिनाइटिस। ईआईयू बैक्टीरियल लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) 10,11 के प्रणालीगत या स्थानीय इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न होता है। ईआईयू का उपयोग जन्मजात प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मार्गों के सक्रियण से उत्पन्न तीव्र यूवाइटिस के मॉडल के रूप में कियागया है। दोनों मॉडल ओकुलर इम्यूनोलॉजी की वर्तमान समझ के लिए सहायक रहे हैं, लेकिन न तो पोस्ट-संक्रामक क्रोनिक यूवाइटिस के लिए प्रभावी मॉडल हैं। हाल ही में चूहों में स्थापित, प्राइमेड माइकोबैक्टीरियल यूवाइटिस (पीएमयू) मॉडल अब यूवाइटिस13 के इस रूप के नैदानिक और सेलुलर पहलुओं से पूछताछ और मूल्यांकन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

दुनिया भर में माइकोबैक्टीरियल संक्रमण का उच्च प्रसार है, जिसमें 2019-14 में विश्व स्वास्थ्य संगठन द्वारा रिपोर्ट किए गए 10 मिलियन से अधिक नए मामले और1.4 मिलियन से अधिक मौतें हुई हैं। सक्रिय तपेदिक (टीबी) संक्रमण की एक्स्ट्रापल्मोनरी अभिव्यक्ति में यूवाइटिस शामिल है और संक्रामक यूवाइटिस15,16 का एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त कारण है। टीबी से जुड़े यूवाइटिस की अभिव्यक्तियां प्रोटियन हैं, जो संभवतः प्रत्यक्ष ओकुलर संक्रमण के साथ-साथ कम अच्छी तरह से समझी जाने वाली प्रतिरक्षा-मध्यस्थता सूजन17,18,19 को शामिल करने के लिए बीमारी के कई अलग-अलग तंत्रों को दर्शाती हैं। इन पोस्ट-संक्रामक सीक्वेल के लिए प्रस्तावित तंत्र में रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) में एक पॉसी-बेसिलरी संक्रमण की दृढ़ता से प्रेरित एक पुरानी भड़काऊ प्रतिक्रिया शामिल है, एक पुरानी भड़काऊ प्रतिक्रिया जो सफलतापूर्वक साफ किए गए ओकुलर संक्रमण से अवशिष्ट रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (पीएएमपी) की उपस्थिति से प्रेरित होती है, और आणविक मिमिक्री या एंटीजन की प्रक्रिया के माध्यम से ओकुलर एंटीजन के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अनुचित सक्रियण। प्रणालीगत टीबी संक्रमण के कारण प्रसार 20,21,22,23.

क्रोनिक पोस्ट-संक्रामक यूवाइटिस की बेहतर यांत्रिक समझ हासिल करने और बीमारी की शुरुआत में माइकोबैक्टीरियल एंटीजन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, पीएमयू मॉडल चूहों13,24 में उपयोग के लिए विकसित किया गया था। तदनुसार, सूजन को दूर करने के लिए, माउस को पहले प्रणालीगत संक्रमण की नकल करने के लिए गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस एच 37 आरए स्ट्रेन से एंटीजन का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन मिलता है, इसके बाद सात दिन बाद स्थानीय ओकुलर संक्रमण की नकल करने के लिए बाईं या दाईं आंख को प्रशासित उसी एंटीजन का इंट्राविट्रल इंजेक्शन दिया जाता है। आगामी यूवाइटिस की तीव्रता और अवधि की निगरानी विवो ऑप्टिकल कोहेरेंस टोमोग्राफी (ओसीटी) और आंख25 की फंडल इमेजिंग में अनुदैर्ध्य द्वारा की जाती है। पीएमयू को एक तीव्र, माइलॉयड-प्रमुख पैनुविटिस की विशेषता है जो विट्रिटिस, पेरिवास्कुलर रेटिना सूजन और बाहरी रेटिना क्षति के फोकल क्षेत्रों के साथ क्रोनिक टी सेल-प्रमुख पश्चवर्ती यूवाइटिस में विकसित होताहै। आंख के पीछे के खंड में ग्रैनुलोमैटस सूजन की उपस्थिति से पता चलता है कि पीएमयू मॉडल का उपयोग पूर्ववर्ती (ग्रैनुलोमैटस और गैर-ग्रैनुलोमैटस) और मध्यवर्ती यूवेइटिस के कुछ रूपों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जो पिछले एमटीबी संक्रमण27 के प्रतिरक्षात्मक साक्ष्य वाले रोगियों में देखा जाता है। इसके अतिरिक्त, पीएमयू मॉडल में उपयोग किए जाने वाले गर्मी से मारे गए एमटीबी के घटकों को ओकुलर तपेदिक वाले रोगियों में आवर्तक यूवाइटिस के पहलुओं को अंतर्निहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने का सुझाव दिया गया है जो एंटी-ट्यूबरकुलर थेरेपी (एटीटी) 28 का जवाब देते हैं। ईएयू और ईआईयू की तुलना में रोग दीक्षा और भड़काऊ पाठ्यक्रम में अंतर के कारण, पीएमयू यूवाइटिस के एक नए पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है जो ओकुलर एंटीजन के साथ टीकाकरण पर निर्भर नहीं है और क्रोनिक यूवाइटिस वाले रोगियों में रोग के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। यह प्रोटोकॉल पीएमयू उत्पन्न करने, सूजन के नैदानिक पाठ्यक्रम की निगरानी करने और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ पोस्टमार्टम विश्लेषण के लिए ओकुलर नमूने एकत्र करने के तरीकों को रेखांकित करता है।

Protocol

प्रदर्शन की गई सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय रूप से वाशिंगटन विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति (पशु अध्ययन प्रोटोकॉल # 4481-02) या यूनाइटेड किंगडम होम ऑफिस लाइसेंस (पीपीएल 30/3281) और ब्रिस्टल एथिकल रिव्यू ग्रुप विश्वविद्यालय के साथ सामंजस्य में अनुमोदित किया गया था। दोनों संस्थानों में किए गए प्रयोग एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) के ओप्थाल्मिक और विजुअल रिसर्च में जानवरों के उपयोग के लिए बयान के अनुरूप थे। पीएमयू 6-10 सप्ताह के सी 57बीएल / 6 जे चूहों में उत्पन्न हुआ था; यूवाइटिस प्रेरण के समय सभी चूहों का वजन कम से कम 18 ग्राम था और सीआरबी 1 जीन29 के आरडी 8 उत्परिवर्तन के लिए नकारात्मक पुष्टि की गई थी। चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त स्थितियों के तहत मानक चाउ और औषधीय पानी (एसिटामिनोफेन 200-300 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) एड लिबिटम के साथ बनाए रखा गया था। पशु इच्छामृत्यु एक मानक कार्बन डाइऑक्साइड इनहेलेशन विधि30 का उपयोग करके की गई थी।

1. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए एंटीजन तैयारी

  1. एमटीबी एच 37 आरए पाउडर के साथ साँस लेने या त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए एक रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर इस खंड में सभी प्रक्रियाओं को करें। कम्प्लीट फ्रायंड एडजुवेंट (आमतौर पर बीएसएल -1) के लिए अपनी संस्थागत नीतियों के अनुसार संभालें। इसमें रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और सुरक्षात्मक कार्य कपड़े (लैब कोट) का उपयोग करना शामिल है।
  2. अभिकर्मकों के संदूषण को रोकने के लिए एक अच्छी बाँझ तकनीक का उपयोग करें जिसे प्रयोगात्मक जानवरों में पेश किया जाएगा।
  3. 5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2.5 एमएल ठंडे पीबीएस के साथ 5 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड, गर्मी से मारे गए एम तपेदिक एच 37 आरए पाउडर को मिलाकर पीबीएस में एमटीबी निलंबन बनाएं। भंवर एक बार 30 सेकंड के लिए और फिर बर्फ पर रखें।
  4. पीबीएस में एच 37 आरए का एक अच्छा निलंबन उत्पन्न करने के लिए, 5 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन को स्थिर करें।
    1. कनवर्टर यूनिट के शरीर को अनक्लैम्प करें और 70% (वी / वी) अल्कोहल स्वैब के साथ जांच को साफ करें।
    2. सोनिकेटर पर स्विच करें, पावर कंट्रोल नॉब को चालू करके पावर सेटिंग को 4 में समायोजित करें और जांच की नोक को पीबीएस युक्त माइकोबैक्टीरियल पाउडर में डुबो दें। सुनिश्चित करें कि जांच टिप नमूने की कम से कम आधी गहराई तक डूबी हुई है और जांच टिप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवार को नहीं छू रही है।
  5. मिश्रण को 30 सेकंड के लिए बर्फ पर रखें, 30 सेकंड के लिए रोकें और तरल को गर्म किए बिना पाउडर को पूरी तरह से फैलाने के लिए कुल 5 मिनट तक दोहराएं।
  6. मिश्रण में फ्रायंड के अपूर्ण सहायक का 2.5 एमएल जोड़ें और बर्फ पर सोनिकेशन प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि इमल्शन टूथपेस्ट जैसी स्थिरता न बन जाए।
  7. नियंत्रण नॉब का उपयोग करके पावर को 0 पर सेट करें और सोनिकेशन को समाप्त करने के लिए यूनिट को बंद करें। निलंबन से टिप हटा दें और अल्कोहल स्वैब से जांच को पोंछ दें।
  8. एंटीजन इमल्शन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इमल्शन के बैच बनाने से प्रयोगों में स्थिरता सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी। इमल्शन को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. चमड़े के नीचे इंजेक्शन

  1. इंट्राविट्रल इंजेक्शन (दिन -7 के रूप में नामित) से एक सप्ताह पहले चमड़े के नीचे इंजेक्शन करें।
  2. माइकोबैक्टीरियल इमल्शन के साथ 1 एमएल सिरिंज (कोई सुई संलग्न नहीं) लोड करें। इमल्शन की चिपचिपाहट और अस्पष्टता के कारण, मुश्किल से देखने वाले हवा के बुलबुले सिरिंज को भर सकते हैं।
    1. सिरिंज में एयरबबल को रोकने के लिए, 0.2-0.3 एमएल इमल्शन लोड करने के बाद, सिरिंज (नोक ऊपर की ओर) को उलटा करें और बुलबुले को सतह पर लाने के लिए काउंटर के किनारे पर धीरे-धीरे सिरिंज को बार-बार टैप करें।
  3. सिरिंज से हवा को बाहर निकालें और सिरिंज भरना जारी रखें। इनवर्ट और रुक-रुक कर भर जाने तक टैप करें।
  4. सिरिंज पर 25 ग्राम सुई रखें और सुई को भरने के लिए इमल्शन को आगे बढ़ाएं। सिरिंज को उपयोग होने तक बर्फ पर स्टोर करें।
  5. चमड़े के नीचे इंजेक्शन को सुरक्षित रूप से करने के लिए, या तो माउस को एनेस्थेटाइज करें या मानवीय संयम विधियों का उपयोग करें जो पशु हिंडक्वार्टर31 तक आसान पहुंच की अनुमति देते हैं।
  6. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए एनेस्थेटाइज करने के लिए, जानवर को एक आइसोफ्लुरेन प्रेरण कक्ष में रखें (प्रेरण के लिए 3% -4% और रखरखाव के लिए 1% -3%)। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, सुनिश्चित करें कि माउस में धीमी श्वसन दर है और श्वसन संकट का कोई संकेत नहीं दिखाता है।
  7. चमड़े के नीचे के इंजेक्शन को कूल्हों की पृष्ठीय सतह पर, या पैरों की उदर सतह पर रखें जो इनगुइनल लिम्फ नोड्स के क्षेत्र के समीप है।
    1. मांसपेशियों में इंजेक्शन लगाने से रोकने के लिए सुई को सावधानीपूर्वक डालें। 0.05 एमएल एमटीबी इमल्शन को चमड़े के नीचे के अंतरिक्ष में इंजेक्ट करें। मोटे इमल्शन को पूरी तरह से इंजेक्ट करने की अनुमति देने के लिए सुई को तुरंत न निकालें।
    2. प्रति जानवर कुल 0.1 एमएल के लिए इंजेक्शन को बाईं और दाईं दोनों तरफ दोहराएं।
  8. यदि एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है, तो माउस को पूरी तरह से ठीक होने तक गर्म हीटिंग पैड पर रखें। माउस को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
  9. माउस को पूरी तरह से ठीक होने पर अपने पिंजरे में वापस करें और पिंजरे कार्ड को चमड़े के नीचे इंजेक्शन की तारीख के साथ लेबल करें।
  10. मौखिक एसिटामिनोफेन (200 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) के साथ एनाल्जेसिया प्रदान करें, लेकिन एनएसएआईडी नहीं क्योंकि विरोधी भड़काऊ एजेंट यूवाइटिस के प्रेरण को प्रभावित कर सकते हैं।

3. इंट्राविट्रल इंजेक्शन के लिए एंटीजन स्टॉक तैयार करना

  1. इंट्राविट्रल एमटीबी निलंबन के संदूषण को रोकने के लिए उपयुक्त बाँझ परिस्थितियों में इस खंड में सभी प्रक्रियाओं को निष्पादित करें।
  2. इंट्राविट्रल सस्पेंशन बनाएं।
    1. हल्के से मध्यम पैनुवाइटिस के प्रेरण के लिए, 1x PBS के 1 एमएल में 5 मिलीग्राम माइकोबैक्टीरिया अर्क जोड़कर 5 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर इंट्राविट्रल निलंबन करें।
    2. मध्यम से गंभीर पैनुवाइटिस के प्रेरण के लिए, 10 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर इंट्राविट्रल निलंबन करें, जिसमें 10 मिलीग्राम माइकोबैक्टीरिया अर्क को 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल में जोड़ा जाए।
  3. भंवर एक बार 30 सेकंड के लिए और फिर बर्फ पर रखें।
  4. पीबीएस में एच 37 आरए का एक अच्छा निलंबन उत्पन्न करने के लिए, चरण 1.4 में वर्णित 10 मिनट के लिए बर्फ पर निलंबन को नोट करें। इस स्टॉक समाधान को 100 μL वॉल्यूम में एलिकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. उपयोग करने से पहले, कमरे के तापमान पर पिघलना और 1 मिनट के लिए उच्च पर भंवर। पशु सुविधा में परिवहन करते समय एलिकोट को बर्फ पर रखें।

4. दिन 0 पर इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रक्रिया

  1. जानवरों की तैयारी
    1. फिट किए गए परीक्षा दस्ताने पहनें, माउस को ग्राम में अपना वजन प्राप्त करने के लिए वजन संतुलन पर रखें।
    2. जानवर को एनेस्थेटाइज करने के लिए बाँझ पानी के साथ मिश्रित 100 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन और 20 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलज़िन युक्त घोल के 0.02 एमएल / जी बॉडीवेट का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन दें। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में ~ 1.5% आइसोफ्लुरेन (साँस लेना) का उपयोग करके प्रेरण शामिल है।
    3. माउस के सो जाने के लिए लगभग 2 मिनट प्रतीक्षा करें, और फिर माउस को वार्मिंग बॉक्स में रखें और ढक्कन को कवर करें। प्रक्रिया 32 के लिए संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करने के लिए कान, पैर की अंगुली और पूंछकी चुटकी जैसे दर्द रिफ्लेक्स परीक्षण करें।
    4. एक बार सो जाने के बाद, कॉर्निया को 0.5% (वी / वी) टेट्राकेन की 1 बूंद के साथ एनेस्थेटाइज करें। माउस की नाक या मुंह के पास टेट्राकेन प्राप्त करने से बचें। 10 सेकंड के बाद, अतिरिक्त तरल को दबा दें।
      नोट: यह देखा गया है कि जब सामयिक संज्ञाहरण प्रशासित किया जाता है तो आईरिस फैलाव और पूर्वकाल कक्ष (एसी) विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार होता है, संभवतः संयुक्त प्रणालीगत और सामयिक संज्ञाहरण के साथ बेहतर कॉर्नियल रिफ्लेक्स दमन के कारण। हालांकि, यदि वांछित हो तो इस कदम को छोड़ा जा सकता है।
    5. 2.5% (v/v) फेनिलफ्राइन की 1 बूंद के साथ छात्र को पतला करें। नाक या मुंह में प्रवेश करने वाली किसी भी अतिरिक्त बूंदों से बचने के लिए सावधानी बरतें। 2-3 मिनट के बाद, अतिरिक्त तरल को दबा दें।
    6. एंडोफथाल्मिटिस के जोखिम को कम करने के लिए, आंखों की सतह और आसपास के बालों में 5% बीटाडीन की 1 बूंद जोड़ें। 2-3 मिनट के लिए आंख पर छोड़ दें।
      नोट: एंडोफथाल्मिटिस को रोकने के लिए उपयुक्त बाँझ स्थितियों के तहत इस खंड में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
    7. बीटाडीन को हटा दें और संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए हाइपोमेलोज (0.3%) या कार्बोमर आई जेल 0.2% डब्ल्यू / डब्ल्यू) के साथ आंख को कवर करें। यह मोतियाबिंद के गठन को रोकने में भी मदद करेगा।
  2. माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम स्थापित करना
    1. एक माइक्रोसिरिंज पंप नियंत्रक और एक इंजेक्शन सिरिंज (चित्रा 1 ए-सी) से जुड़े माइक्रोपंप का उपयोग करके इंट्राविट्रल इंजेक्शन करें। वैकल्पिक रूप से, हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी 33 जी सुई के साथ इंजेक्ट करें जैसा कि उपधारा 4.4 में वर्णित है।
    2. इंजेक्टर को इकट्ठा करने के लिए इंजेक्शन धारक से 34 ग्राम सुई कनेक्ट करें। इंजेक्शन धारक के सामने के छोर पर चांदी की स्क्रू कैप को ढीला करें और सुई को लगभग आधे रास्ते में धारक के शरीर में स्लाइड करें। सिल्वर स्क्रू कैप उंगली को कसकर कस लें।
    3. चरण 4.2.4-4.2.5 में उल्लिखित इंजेक्शन धारक से ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
    4. इंजेक्शन धारक पर ट्यूबिंग डालने के लिए, धारक के पिछले छोर पर प्लास्टिक स्क्रू को ढीला करें, अंदर गैसकेट के माध्यम से टयूबिंग को स्लाइड करें और स्क्रू को कस लें।
    5. इंजेक्शन के दौरान टयूबिंग क्षति को रोकने के लिए टयूबिंग के अंत के साथ थोड़ा अंतर बनाए रखें। चित्र 1C देखें।
    6. माइकोबैक्टीरियम स्टॉक सस्पेंशन के 100 μL एलिकोट को पिघलाएं।
    7. 1% फ्लोरेसिन सोडियम (एके-फ्लोर) समाधान और भंवर के 3 μL अच्छी तरह से जोड़ें।
    8. किसी भी हवा के बुलबुले को शामिल किए बिना एंटीजन और फ्लोरेसिन मिश्रण के साथ 10 μL सिरिंज लोड करें।
    9. सिरिंज से लोडिंग सुई को हटा दें, और सिल्वर स्क्रू कैप गैसकेट के माध्यम से ट्यूबिंग को तब तक स्लाइड करें जब तक कि टिप सिरिंज शरीर में शून्य निशान तक न पहुंच जाए।
    10. एक बार जब ट्यूबिंग की नोक को वांछित स्थिति में सही ढंग से संरेखित किया जाता है, तो स्क्रू कैप उंगली को कसकर कस लें।
    11. सिस्टम को पूरी तरह से लोड करने के लिए इंजेक्शन ट्यूबिंग के माध्यम से सिरिंज में घोल को फ्लश करें। फिर इंजेक्शन के लिए सिरिंज को फिर से लोड करने के लिए चरण 4.2.8-4.2.11 दोहराएं।
    12. माइक्रोपंप पर लोडेड सिरिंज स्थापित करने के लिए, सिरिंज क्लैंप खोलने के लिए माइक्रो-पंप के अंत में क्लैंप रिलीज बटन दबाएं।
    13. माइक्रोपंप के पिछले छोर पर प्लंजर कैप होल्डर में प्लंजर की टोपी रखें।
    14. फिर सिरिंज कॉलर को कॉलर स्टॉप पर और सिरिंज बॉडी को सिरिंज क्लैंप में स्लाइड करें।
    15. क्लैंप बटन छोड़ें और प्लंजर को बनाए रखने वाले स्क्रू को कसें। चित्र 1D देखें।
    16. स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन उपकरण पर ओ-क्लैंप के माध्यम से इंजेक्शन धारक और सुई को स्लाइड करें। यह एक कस्टम प्लेटफॉर्म है; वैकल्पिक रूप से, सिरिंज को मैन्युअल रूप से रखा और तैनात किया जा सकता है।
    17. माइक्रोसिरिंज पंप नियंत्रक पर क्रमशः 40 एनएल / एस की दर से 500 एनएल प्रति चक्र इंजेक्ट करने के लिए इन्फ्यूजन वॉल्यूम और इन्फ्यूजन वॉल्यूम की दर सेट करें।
      नोट: तेजी से इंजेक्शन दरों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि, सुई रिपोजिशनिंग प्राप्त करने से पहले अधिक रिफ्लक्स का अनुभव किया जा सकता है।
    18. इंट्राविट्रल इंजेक्शन करने से पहले सही कामकाज सुनिश्चित करने के लिए सिस्टम का परीक्षण करें।
      नोट: जब इंजेक्शन प्रणाली सही ढंग से काम कर रही है, तो पैर पैडल या नियंत्रण पैड का उपयोग करके एक इंजेक्शन चक्र की सक्रियता प्लंजर कैप धारक की दृश्य गति का उत्पादन करेगी और सुई की नोक पर हरे रंग के तरल की एक छोटी बूंद देखी जाएगी। यदि कोई तरल उत्पन्न नहीं होता है, तो अतिरिक्त चक्र या फ्लश को सक्रिय करें और सिरिंज को फिर से लोड करें।
    19. आंख को इंजेक्ट करने से पहले, धीरे से 95% इथेनॉल पैड के साथ सुई को पोंछें।
  3. इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रक्रिया
    1. इंजेक्शन प्रक्रिया करने के लिए माउस को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर रखा जाता है।
    2. उस मंच/प्लेटफार्म को गर्म रखें जिस पर माउस टिका हुआ है, इसकी सतह पर 2-3 पेपर तौलिए जोड़कर।
    3. माउस को मंच पर एक प्रवण स्थिति में रखें। जानवर के सिर को धीरे से ठीक करने के लिए दाएं और बाएं कान की सलाखों का उपयोग करें। चित्र 1E देखें।
    4. माउस को रखें और दायरे के नीचे उन्मुख करें ताकि दाईं आंख का बेहतर नाक पहलू दिखाई दे।
    5. पलकों को विस्थापित करने और श्वेतपटल को उजागर करने के लिए 30 ग्राम सुई का उपयोग करें। लिम्बस और रेडियल रक्त वाहिका की कल्पना करें।
    6. लिम्बस के 1-2 मिमी पीछे के श्वेतपटल में एक गाइड छेद बनाने के लिए एक बाँझ 30 जी सुई का उपयोग करें।
    7. इंजेक्शन धारक से जुड़ी 34 जी सुई को गाइड छेद के माध्यम से आंख में एक कोण पर डालें जो लेंस से बच जाएगा, लेकिन सुई की नोक को विट्रस गुहा में रखें।
    8. माइक्रोसिरिंज पंप नियंत्रक का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक एमटीबी अर्क के 1 μL को विट्रीस गुहा में इंजेक्ट करें। लगातार रिफ्लक्स के मामले में, पर्याप्त खुराक वितरण सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा को 1.5 μL तक बढ़ाएं।
      नोट: शाम नियंत्रण के लिए, जानवर की आंख में पीबीएस के 1 μL इंजेक्ट करें।
    9. आंख में हरे रंग के रिफ्लेक्स के विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा इंट्राविट्रल प्लेसमेंट को सत्यापित करें। चित्र 1F देखें।
    10. 10 सेकंड के बाद, सुई को आंख से हटा दें। किसी भी रिफ्लक्स पर ध्यान दें।
    11. मंच से माउस को हटा दें, कॉर्नियल सुरक्षा के लिए दोनों आंखों पर 0.3% हाइप्रोमेलोज या 0.2% डब्ल्यू / डब्ल्यू कार्बोमर आंख मलहम रखें, और रिकवरी वार्मिंग बॉक्स में जाएं।
    12. माउस को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी में न लौटें।
    13. जब माउस पूरी तरह से जाग जाता है, तो पिंजरे में लौटें और एसिटामिनोफेन (200-300 मिलीग्राम / किग्रा / दिन) औषधीय पानी की बोतल जोड़ें। आईवीटी इंजेक्शन की तारीख के साथ पिंजरे कार्ड को लेबल करें।
    14. इंट्राविट्रल इंजेक्शन आम तौर पर अच्छी तरह से सहन किए जाते हैं। नैदानिक संकेत जो दर्द और अध्ययन से हटाने की आवश्यकता का संकेत दे सकते हैं, उनमें पेरिओकुलर एलोपेसिया (आत्म-आघात का संकेत), कॉर्नियल अल्सरेशन, वजन घटाने और झुकी हुई मुद्रा शामिल है।
  4. इंट्राविट्रल इंजेक्शन के लिए वैकल्पिक विधि
    नोट: यह प्रक्रिया एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप और एक माइक्रोसिरिंज पर 33 जी सुई का उपयोग करके की जाती है।
    1. आंख को प्रोपटोस करें और इसे बल की एक जोड़ी के साथ स्थिति में रखें।
    2. फिर कार्बोमर आई जेल 0.2% डब्ल्यू / डब्ल्यू या 0.3% हाइप्रोमेलोज़ आई जेल लागू करें और आंख के ऊपर एक गोलाकार कवरस्लिप (7 मिमी व्यास) रखें।
    3. 5 μL हैमिल्टन सिरिंज पर एक 33 G हाइपोडर्मिक सुई माउंट करें और इसे ~ 45 ° इंजेक्शन कोण के साथ कॉर्नियल लिम्बस के लिए लगभग 2 मिमी परिधीय डालें।
    4. सुई को विट्रियस में निर्देशित करें, लेंस और ऑप्टिक डिस्क के बीच रुकें (सर्जन के सापेक्ष दृष्टिकोण से, यह ऑप्टिक डिस्क के ऊपर है / कवर करता है - सम्मिलन की साइट से लगभग 1.5 मिमी), और एमटीबी के 2 μL (पीबीएस में 2.5 यूजी / μL पर) धीरे-धीरे इंजेक्ट करें।
    5. सुई को संक्षेप में रखें (इंजेक्शन के रिफ्लक्स की मात्रा को कम करने के लिए) और फिर इसे हटा दें।
    6. इंजेक्शन के बाद, बल जारी करके दुनिया भर में पुन: स्थापित करें। इंजेक्शन के बाद एंडोफथाल्मिटिस से अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान करने के लिए इस समय आंखों को 1% डब्ल्यू / डब्ल्यू क्लोरैम्फेनिकॉल मलहम की एक बूंद दी जा सकती है।
    7. इंजेक्शन के बाद, रिकवरी वार्मिंग बॉक्स पर जाएं जैसा कि चरण 4.3.11-4.3.13 में उल्लेख किया गया है।

5. यूवाइटिस का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए ओसीटी इमेजिंग

  1. जानवरों की तैयारी
    1. चरण 4.1.2-4.1.4 में वर्णित माउस को एनेस्थेटाइज करें
    2. 2.5% फेनिलफ्राइन की 1 बूंद के साथ छात्र को पतला करें। नाक या मुंह में प्रवेश करने वाली किसी भी अतिरिक्त बूंदों से बचने के लिए सावधानी बरतें। 2-3 मिनट के बाद, अतिरिक्त तरल को दबा दें।
    3. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंख पर 0.3% हाइप्रोमेलोज या 0.2% डब्ल्यू / डब्ल्यू कार्बोमर जेल रखें। यह मोतियाबिंद के गठन को रोकने में भी मदद करेगा।
    4. शरीर की गर्मी बनाए रखने के लिए माउस को सर्जिकल धुंध की एक परत में लपेटें और इसे पशु कैसेट पर रखें। काटने की पट्टी के साथ सिर को रखें।
  2. पूर्वकाल और पीछे के कक्षों की ओसीटी छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: यदि पूर्वकाल और पीछे के कक्ष की छवियां प्राप्त होती हैं, तो मोतियाबिंद गठन के बाद छवि क्षरण को रोकने के लिए पहले पश्चवर्ती कक्ष (पीसी) छवियां प्राप्त करें। मोतियाबिंद के गठन को लगातार स्नेहन और 0.3% हाइप्रोमेलोज या 0.2% डब्ल्यू / डब्ल्यू कार्बोमर आई जेल लगाने के साथ रोका जा सकता है। विस्तारित इमेजिंग (>10 मिनट) के लिए, माउस को गर्म रखने (हीट पैड के उपयोग के माध्यम से) भी मदद करता है।
    1. ओसीटी इमेजिंग सिस्टम को चालू करने के बाद, सही इमेजिंग लेंस सुरक्षित करें और आवश्यकतानुसार संदर्भ हाथ की स्थिति को समायोजित करें।
    2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, अद्वितीय माउस आईडी बनाएं और ओसीटी निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इमेजिंग शुरू करें।
    3. फास्ट स्कैन प्रोटोकॉल के साथ फ्री रन विकल्प का उपयोग करते हुए, आंख को ऑप्टिक तंत्रिका के साथ पीछे के कक्ष छवियों या पूर्ववर्ती कक्ष छवियों पर कॉर्निया के शीर्ष पर केंद्रित रखें।
      नोट: तालिका 1 में दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम के लिए इमेजिंग प्रोटोकॉल पैरामीटर शामिल हैं। उत्पाद विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    4. पश्चवर्ती कक्ष इमेजिंग के लिए, ओसीटी को आंख की सतह के करीब लाएं। लेंस की सतह को आंख के संपर्क में लाने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
    5. एक बार जब आंख सही ढंग से स्थित हो जाती है, तो तेजी से स्कैन बंद करें और वॉल्यूम स्कैन प्रोटोकॉल का चयन करें, और एआईएम विकल्प के साथ स्कैन को सक्रिय करें।
    6. पश्चवर्ती खंड छवियों के लिए, तब तक समायोजित करें जब तक ऑप्टिक तंत्रिका क्षैतिज बी-स्कैन संरेखण छवि में केंद्रित न हो और रेटिना ऊर्ध्वाधर संरेखण अक्ष के साथ संरेखित न हो
    7. पूर्ववर्ती खंड छवियों के लिए, क्षैतिज बी-स्कैन संरेखण छवि और ऊर्ध्वाधर संरेखण बी-स्कैन संरेखण छवि दोनों में कॉर्निया के शीर्ष को केंद्र में रखने के लिए स्थिति को समायोजित करें। दोनों छवियों में एक प्रतिबिंब कलाकृति की उपस्थिति उचित संरेखण की पुष्टि करेगी। फिर प्रतिबिंब विरूपण साक्ष्य को हटाने के लिए क्षैतिज छवि को पर्याप्त रूप से स्थानांतरित करें। चित्र 2 देखें।
    8. वॉल्यूम स्कैन छवि कैप्चर करने के लिए स्नैपशॉट पर क्लिक करें और फिर सहेजें पर क्लिक करें।
    9. इसके बाद, औसत केंद्रीय लाइन स्कैन प्राप्त करें। स्कैन प्रोटोकॉल खोलें और स्नैपशॉट के बाद एआईएम पर क्लिक करें। उसी पैनल पर राइट-क्लिक करें और फिर औसत पर क्लिक करें।
    10. दोनों लेंस के साथ प्रत्येक आंख के लिए चरण 5.2.1-5.2.9 दोहराएं।
    11. सभी छवियों को एकत्र करने के बाद, माउस को कैसेट से हटा दें और चरण 4.3.11-4.3.13 में सूचीबद्ध वसूली के दौरान कॉर्नियल सुरक्षा प्रदान करें।

6. ओसीटी द्वारा सूजन स्कोर करना

  1. उन ग्रेडर्स की मदद से ओसीटी छवियों को स्कोर करें जो उपचार की स्थिति के लिए नकाबपोश हैं।
    नोट: माउस मॉडल में पीएमयू के लिए, तालिका 2 में प्रदान की गई स्कोरिंग प्रणाली की सिफारिश की जाती है।
  2. यदि पूर्वकाल कक्ष (एसी) और पश्चवर्ती कक्ष (पीसी) दोनों छवियां प्राप्त की गई थीं, तो प्रत्येक आंख के लिए अंतिम स्कोर प्राप्त करने के लिए इन स्कोर को संयोजित करें।
    नोट: पूर्ववर्ती कक्ष सूजन पीछे के कक्ष की सूजन से पहले हल हो जाती है।

7. पोस्टमार्टम हिस्टोलॉजी द्वारा सूजन को स्कोर करना

  1. प्रयोग के अंत में, न्यूक्लियेशन द्वारा अलग-अलग आंखों को इकट्ठा करें, रात भर में 4% फॉर्मलाडेहाइड में ठीक करें, और पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और एच एंड ई स्टेनिंग33 के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: पुपिलरी-ऑप्टिक तंत्रिका अक्ष के साथ एकाधिक 4-8 μm वर्गों की सिफारिश की जाती है।
    नोट: तालिका 3 में प्रदान की गई स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करके एक नकाबपोश ग्रेडर द्वारा प्रति आंख तीन खंड स्कोर किए जाते हैं, और तीन वर्गों के औसत स्कोर को अंतिम हिस्टोलॉजी सूजन स्कोर के रूप में रिपोर्ट किया जाता है।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल प्राइमेड माइकोबैक्टीरियल यूवाइटिस मॉडल (पीएमयू) का उपयोग करके चूहों में यूवाइटिस के प्रेरण को दर्शाता है। चमड़े के नीचे इंजेक्शन में स्थिरता सुनिश्चित करना और इंट्राविट्रल इंजेक्शन की सटीकता प्राइमेड माइकोबैक्टीरियल यूवाइटिस मॉडल (पीएमयू) विकसित करने में महत्वपूर्ण कदम हैं। चित्रा 1 एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करके माउस इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है। कान की सलाखों माइक्रोस्कोप के तहत एक ही स्थान पर सिर को धीरे से रखने में मदद करती हैं (चित्रा 1 ई)। वे इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सिर को स्थिर भी रखते हैं, जिससे इंजेक्शन आघात का खतरा कम हो जाता है। एक सफल इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन समाधान में फ्लोरेसिन आंख के भीतर से एक हरा प्रतिबिंब पैदा करता है जिसे माइक्रोस्कोप के नीचे या साइड व्यू से देखा जा सकता है जैसा कि चित्रा 1 एफ में चित्रित किया गया है।

जब उल्लिखित के रूप में प्रदर्शन किया जाता है, तो प्रोटोकॉल मजबूत तीव्र यूवाइटिस उत्पन्न करता है जिसे इंट्राविट्रल इंजेक्शन के 10 घंटे बाद ओसीटी और फंडस इमेजिंग का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। चित्रा 2 ओसीटी इमेजिंग के लिए आंख के सही संरेखण को दर्शाता है। तालिका 1 ए ओसीटी प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए मापदंडों को सूचीबद्ध करती है। छवियों को प्राप्त करने के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता वाली छवियां प्रदान करेगा जिनकी तुलना समय के साथ की जा सकती है। पूर्ववर्ती कक्ष छवियां क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर विमानों (चित्रा 2 बी, सी) दोनों के समानांतर संरेखित आईरिस के साथ एन फेस एसएलओ छवि (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके कॉर्निया के शीर्ष पर केंद्रित हैं। वॉल्यूम और लाइन स्कैन को ऊर्ध्वाधर संरेखण के साथ कैप्चर किया जाता है जैसे कि अवर और बेहतर क्षेत्रों को एक साथ देखा जा सकता है। पीछे के खंड की छवियां एन फेस एसएलओ छवि (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके ऑप्टिक तंत्रिका पर केंद्रित होती हैं, और आरपीई के उज्ज्वल बैंड का उपयोग क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर विमानों (चित्रा 2 ई, एफ) दोनों के समानांतर रेटिना को संरेखित करने के लिए किया जाता है।

चित्रा 3 ओसीटी इमेजिंग का उपयोग करके पीएमयू ओकुलर सूजन के विशिष्ट निष्कर्षों को दर्शाता है। इंट्राविट्रल इंजेक्शन के चौबीस घंटे बाद, भड़काऊ कोशिकाओं को जलीय और विट्रियस में देखा जाता है (चित्रा 3 बी)। मध्यम या गंभीर सूजन की उपस्थिति में, एसी में अवर कोण में एक हाइपोपियन देखा जाएगा। तालिका 2 में सूचीबद्ध मानदंडों का उपयोग करके इन ओसीटी छवियों पर ओकुलर सूजन की डिग्री स्कोर की जा सकती है। प्रत्येक स्कोर के लिए विशिष्ट भड़काऊ विशेषताओं को प्रदर्शित करने वाली छवियों के प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 4 में दिखाए गए हैं। संयुक्त ओसीटी स्कोर उत्पन्न करने के लिए एसी और पीसी चैंबर स्कोर को एक साथ जोड़ा जा सकता है। संयुक्त स्कोर >0 लेकिन ≤2.5 हल्के सूजन का प्रतिनिधित्व करते हैं। मध्यम सूजन >2.5 लेकिन ≤4.5 के स्कोर द्वारा निर्धारित की जाती है। स्कोर >4.5 गंभीर सूजन की पहचान करते हैं। सूजन आमतौर पर 1 और 3 (2 और 6 के बीच संयुक्त स्कोर) के बीच एसी और पीसी में ओसीटी स्कोर के साथ इंट्राविट्रल इंजेक्शन के 48 घंटे बाद चरम पर होती है। 0.5 या 4 के एसी और पीसी स्कोर कम आम हैं। यदि विशिष्ट सीमा के बाहर के स्कोर अक्सर सामना किए जाते हैं, तो आउटलायर स्कोर में योगदान देने वाले कारकों की पहचान करने के लिए समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है (चर्चा अनुभाग देखें)। इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह के भीतर पूर्ववर्ती कक्ष में सूजन स्कोर शून्य पर वापस आ जाते हैं। इसके विपरीत, पश्चवर्ती स्कोर शून्य पर वापस नहीं आते हैं; इसके बजाय, निम्न-स्तरीय पुरानी सूजन विट्रिटिस के रूप में बनी रहती है, और पेरिवास्कुलर लिम्फोसाइट्स इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद 1-2 महीने तक रेटिना में घुसपैठ करते हैं।

पीएमयू में सूजन स्कोर को हिस्टोलॉजी का उपयोग करके भी निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 5 हिस्टोलॉजी द्वारा पीएमयू की गंभीरता को स्कोर करने में उपयोग के लिए प्रतिनिधि एच एंड ई अनुभाग दिखाता है। जलीय और विट्रियस में भड़काऊ कोशिकाओं की संख्या की गणना की जाती है और तालिका 3 में सूचीबद्ध स्कोर मानदंडों का उपयोग करके गंभीरता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। सिलियरी शरीर की भड़काऊ कोशिका घुसपैठ आमतौर पर हल्के या मध्यम सूजन में हिस्टोलॉजी अनुभाग (एकतरफा भागीदारी) के एक तरफ देखी जाती है। जब सूजन गंभीर होती है, तो यह लेंस के दोनों किनारों पर सिलियरी शरीर में एक भड़काऊ कोशिका घुसपैठ की उपस्थिति से परिलक्षित होता है (जिसे द्विपक्षीय भागीदारी कहा जाता है)। इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद बाद के समय के दौरान, पेरिवास्कुलर और इंट्रारेटिनल ल्यूकोसाइट्स और बाहरी रेटिना सिलवटों की उपस्थिति सहित पुरानी सूजन अभिव्यक्तियों की भी पहचान की जा सकती है। हिस्टोलॉजी खराब इंजेक्शन तकनीकों से प्रभावित आंखों की पहचान करने में भी सहायक हो सकती है। इंट्राविट्रल इंजेक्शन के दौरान लेंस को आघात की पहचान आघात के क्षेत्र से सटे लेंस कैप्सूल के बाहर अनाकार ईओसिन-दाग (गुलाबी) लेंस प्रोटीन की उपस्थिति से की जा सकती है। सबकॉन्जक्टिवल स्पेस में इंट्राविट्रल एमटीबी का रिफ्लक्स आंख के बाहर सूजन उत्पन्न करेगा जिसे वर्गों पर मौजूद पेरिओकुलर संरचनाओं की सावधानीपूर्वक समीक्षा से पहचाना जा सकता है। आंखों के भीतर एमटीबी अर्क को बनाए रखने में विफलता के कारण, इन आंखों में आमतौर पर सूजन के कम ओसीटी स्कोर होंगे।

ब्राइटफील्ड फंडस इमेजिंग का उपयोग पीएमयू के चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक पहलुओं की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें हाइपोपियन, विट्रिटिस और रेटिना या पेरिवास्कुलर भड़काऊ सेल घुसपैठ का विकास शामिल है। चित्रा 6 दो उदाहरण दिखाता है जहां रेटिना और पेरिवास्कुलर सूजन को फंडस छवियों पर देखा जा सकता है। ये दो आंखें सूजन की सीमा भी दिखाती हैं जो पीएमयू मॉडल में आम है। तालिका 1 बी फंडस / रेटिना ओसीटी इमेजिंग सिस्टम में उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को सूचीबद्ध करती है। छवि की गुणवत्ता (चित्रा 6, दिन 2, ओसीटी और शीर्ष पंक्ति में फंडस छवियों) और 21 वें दिन मौजूद बीमारी की सीमा पर गंभीर सूजन के प्रभाव पर ध्यान दें। कॉर्नियल एडिमा तीव्र सूजन के दौरान छवि की गुणवत्ता को भी कम कर सकती है; हालांकि, कॉर्नियल एडिमा के लिए अकेले सूजन से गंभीर होना असामान्य है। अधिक सामान्यतः, इमेजिंग और संज्ञाहरण घटनाओं के दौरान अपूर्ण सतह संरक्षण के परिणामस्वरूप उपकला क्षति से छवि की गुणवत्ता खराब हो जाएगी।

पीएमयू मॉडल का उपयोग किसी भी माउस नस्ल या जीनोटाइप में यूवाइटिस को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। अल्बिनो आंखों में, ओसीटी का उपयोग अभी भी सूजन को स्कोर करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन फंडस वर्णक की अनुपस्थिति ब्राइटफील्ड इमेजिंग13,34 द्वारा सूजन के विज़ुअलाइज़ेशन को चुनौतीपूर्ण बनाती है। पोस्ट मॉर्टम अध्ययन ओकुलर ऊतकों, क्षेत्रीय लिम्फ नोड्स या प्लीहा पर किया जा सकता है। कुछ उदाहरणों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति जैसे फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और भड़काऊ साइटोकिन्स के माप के लिए परख शामिल हैं। पीएमयू (दिन 1 से दिन 56) के साथ सूजन की शुरुआत के बाद परीक्षण किए गए सभी समय बिंदुओं पर, बहु-पैरामीटर प्रवाह विश्लेषण12,35 द्वारा आंखों में कई प्रमुख ल्यूकोसाइट आबादी का पता लगाने के लिए व्यक्तिगत आंखों में पर्याप्त सीडी 45 + भड़काऊ कोशिकाएं मौजूद हैं। प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण, प्रोटिओमिक अध्ययन, या साइटोकिन एकाग्रता निर्धारण के लिए जलीय (2-5 μL) और विट्रियस (5-10 μL) हास्य को सूजन वाली आंखों से एकत्र किया जा सकताहै।

Figure 1
चित्रा 1: माउस इंट्राविट्रल इंजेक्शन सेट अप। इंट्राविट्रल इंजेक्शन माउस आंख पर (ए) (बी) माइक्रोपंप से जुड़े एक माइक्रोसिरिंज पंप नियंत्रक और (सी) एक इंजेक्शन सिरिंज का उपयोग करके किया जाता है। सिरिंज को लोड किया जाता है और (डी) माइक्रोपंप पर लगाया जाता है। इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान स्थिरता और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए माउस हेड को (ई) कान सलाखों का उपयोग करके तैनात किया जाता है। (एफ) इंजेक्शन समाधान में फ्लोरेसिन एक सफल प्रक्रिया के बाद आंख के भीतर से एक हरे रंग का प्रतिबिंब पैदा करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ओसीटी इमेजिंग के लिए आंख का उचित संरेखण। (ए) एन-फेस स्कैनिंग लेजर ऑप्थाल्मोस्कोप (एसएलओ) छवि का उपयोग करके, आंख पूर्वकाल कक्ष इमेजिंग के लिए केंद्रित है। हरी रेखा पैनल (बी) में दिखाए गए क्षैतिज रेखा स्कैन की स्थिति को इंगित करती है। ध्यान दें कि प्रतिबिंब विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए केंद्रीय कॉर्निया से बचा जाता है। (सी) पैरासेंट्रल एंटीरियर कक्ष के माध्यम से ऊर्ध्वाधर बी-स्कैन। यह स्कैन क्षैतिज स्कैन से 90 ° पर प्राप्त किया जाता है। ध्यान दें कि लेंस के प्रत्येक तरफ आईरिस वर्गों का संरेखण क्षैतिज स्कैन (पैनल बी) में स्तर है और ऊर्ध्वाधर स्कैन (पैनल सी) में दूसरे के ऊपर व्यवस्थित है। (डी) एसएलओ छवि का उपयोग करके, पीछे की कक्ष छवि ऑप्टिक तंत्रिका पर केंद्रित है। (ई) क्षैतिज बी-स्कैन संरेखण, (एफ) ऊर्ध्वाधर बी-स्कैन संरेखण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पीएमयू का प्रेरण पैनुवाइटिस उत्पन्न करता है जिसे अनुदैर्ध्य ओसीटी इमेजिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है। शीर्ष पंक्ति पूर्ववर्ती कक्ष (एसी) दिखाती है; नीचे की पंक्ति रोग पाठ्यक्रम में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को उजागर करने के लिए पश्चवर्ती कक्ष (पीसी) ओसीटी छवियों को दिखाती है। (ए) यूवाइटिस के प्रेरण से पहले एसी (ऊपर) और पीसी (नीचे) की बेसलाइन ओसीटी छवि, दोनों स्कोर 0। (बी) इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद दिन 1 में कॉर्नियल एडिमा (काला तीर), एसी (सफेद तीर) में एक हाइपोपियन (*) कई मुक्त-फ्लोटिंग भड़काऊ कोशिकाओं और पीसी में विट्रिटिस (सफेद तीर) की उपस्थिति दिखाई देती है। (सी) इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद दिन 7 जिसमें पूर्ववर्ती लेंस कैप्सूल (सफेद तीर) पर कुछ एसी कोशिकाएं होती हैं और विट्रिटिस (सफेद तीर) में कमी आती है। (डी) एसी सूजन और हल्के विट्रिटिस के साथ इंट्राविट्रल इंजेक्शन पूर्ववर्ती कक्ष के बाद 28 दिन। संक्षेप: सी-कॉर्निया, एल - लेंस, आई - आईरिस, एक्यू - जलीय, वी विट्रस, आरजीसी - रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं, पीआर - फोटोरिसेप्टर, सीएच- कोरॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ओसीटी स्कोर उदाहरण। तालिका 2 में दिखाए गए श्रेणीबद्ध सिस्टम का उपयोग करके प्रत्येक एसी छवि और पीसी छवि को 0 और 4 के बीच एक ओसीटी स्कोर सौंपा गया है। आंख के लिए अंतिम ओसीटी स्कोर के लिए एसी और पीसी स्कोर संयुक्त हैं। (ए, डी) शून्य के स्कोर के उदाहरण। (B, E) 0.5 के स्कोर के उदाहरण। (C, F) 1 के स्कोर के उदाहरण। (G, J) 2 के स्कोर के उदाहरण। (H, K) 3 के स्कोर के उदाहरण। (I, L) 4 के स्कोर के उदाहरण पैनल I और L में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: हिस्टोलॉजी स्कोर उदाहरण। हिस्टोलॉजी स्कोर एच एंड ई वर्गों में दिखाई देने वाली पांच विशेषताओं के आधार पर निर्धारित किया जाता है: पूर्वकाल कक्ष प्रोटीन घनत्व, पूर्ववर्ती कक्ष सेल संख्या, सिलियरी शरीर की प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, विट्रियस सेल घनत्व, रेटिना संवहनी सूजन, और संरचनात्मक रेटिना परिवर्तन। प्रत्येक विशेषता के लिए 0-2 का स्कोर सौंपा गया है। प्रत्येक स्कोर का विवरण तालिका 3 में पाया जाता है। प्रत्येक विशेषता के लिए 0-2 का एक प्रतिनिधि उदाहरण स्कोर इस आंकड़े में दिखाया गया है। बायां कॉलम शून्य के स्कोर को दर्शाता है। केंद्र कॉलम स्कोर 1 के उदाहरण दिखाता है। दायां कॉलम स्कोर 2 के उदाहरण दिखाता है। सिलियरी बॉडी स्कोर के लिए 2 का स्कोर सौंपा जाता है यदि एक ही खंड में लेंस के दोनों ओर सिलियरी बॉडी सेलुलर सूजन को प्रदर्शित करती है। अंतिम हिस्टोलॉजी स्कोर पांच मानदंडों (अधिकतम स्कोर 10) में से प्रत्येक के लिए स्कोर का योग है। निचले दाएं पैनल में तीर एक सतही रेटिना पोत से जुड़े पेरिवास्कुलर ल्यूकोसाइट्स को इंगित करता है। ब्लैक स्केल बार 500 μm को इंगित करता है। सिलियरी स्केल पट्टियाँ 100 μm इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: पीएमयू में अनुदैर्ध्य फंडस इमेजिंग ने रोग की गंभीरता की एक श्रृंखला की पहचान की। (ए) गंभीर रूप से सूजी हुई आंखें रंग फंडस इमेजिंग (शीर्ष पंक्ति) के साथ-साथ दिन 2 पर ओसीटी (नीचे की पंक्ति) पर घने विट्रिटिस और रेटिना एडिमा पर रेटिना और संवहनी कठोरता में कई सफेद घुसपैठ प्रदर्शित करती हैं। रेटिना घावों की संख्या में प्रगति समय के साथ देखी जा सकती है जबकि विट्रिटिस में सुधार होता है। ग्रीन लाइन ओसीटी छवि की स्थिति को इंगित करती है। (बी) हल्की सूजन वाली आंखें फंडस में कम और अधिक असतत रैखिक घावों और विट्रियस स्पेस में घुसपैठ करने वाली कोशिकाओं की एक संख्या का प्रदर्शन करती हैं। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एक
माउस पूर्वकाल कक्ष तेजी से स्कैन वॉल्यूम स्कैन रैखिक स्कैन
लंबाई X चौड़ाई 4.0 मिमी x 4.0 मिमी 3.6 मिमी x 3.6 मिमी 3.6 मिमी
कोण 0 90 90
A-scan/B-Scan 800 1000 1000
# बी-स्कैन 50 400 1
फ्रेम/ 1 3 20
माउस पश्चवर्ती कक्ष तेजी से स्कैन वॉल्यूम स्कैन रैखिक स्कैन
लंबाई X चौड़ाई 1.6 मिमी x 1.6 मिमी 1.6 मिमी x 1.6 मिमी 1.6 मिमी
कोण 0 0 0
A-scan/B-Scan 800 1000 1000
# बी-स्कैन 50 200 1
फ्रेम/ 1 3 20
B
माउस पश्चवर्ती कक्ष वॉल्यूम स्कैन रैखिक स्कैन
लंबाई X चौड़ाई 0.9 मिमी x 0.9 मिमी 1.8 मिमी
कोण 0 कोई भी (आमतौर पर 0 या 90)
A-scan/B-Scan 1024 1024
# बी-स्कैन 512 1
फ्रेम/ 1 30

तालिका 1: पैरामीटर स्कैन करें। (ए) ओसीटी स्कैन पैरामीटर। (बी) फंडस / रेटिना ओसीटी स्कैन पैरामीटर

OCT स्कोर विवरण
अंक पूर्वकाल कक्ष पश्चवर्ती कक्ष
ना पूर्वकाल कॉर्निया से परे कोई दृश्य नहीं पश्चवर्ती खंड का कोई दृश्य नहीं
0 कोई सूजन नहीं कोई सूजन नहीं
0.5 जलीय में 1-5 कोशिकाएं कुछ कोशिकाएं विट्रस क्षेत्र के 10% से कम पर कब्जा करती हैं
या कॉर्नियल एडिमा कोई सबरेटिनल या इंट्रारेटिनल घुसपैठ या रेटिना आर्किटेक्चर व्यवधान नहीं
1 जलीय में 6-20 कोशिकाएं डिफ्यूज कोशिकाएं (कोई घने झुरमुट नहीं) विट्रस क्षेत्र के 10 से 50% के बीच कब्जा कर लेती हैं।
या पूर्ववर्ती लेंस कैप्सूल पर कोशिकाओं की एक परत कोई सबरेटिनल या इंट्रारेटिनल घुसपैठ या रेटिना आर्किटेक्चर व्यवधान नहीं
2 जलीय में 20-100 कोशिकाएं विट्रीस क्षेत्र के 50% > पर कब्जा करने वाली डिफ्यूज कोशिकाएं (कोई घने झुरमुट नहीं)
या 20 से कम कोशिकाएं और एक हाइपोपियन मौजूद है कोई सबरेटिनल या इंट्रारेटिनल घुसपैठ या रेटिना आर्किटेक्चर व्यवधान नहीं
3 जलीय में 20-100 कोशिकाएं ग्रेड 2 और 1 के बराबर डिफ्यूज कोशिकाएं
और एक हाइपोपियन या एक प्यूपिलरी झिल्ली और कम से कम एक घनी विट्रस अस्पष्टता 10% -20% विट्रीस क्षेत्र पर कब्जा कर लेती है या ग्रेड 2 और दुर्लभ (≤ 2) सबरेटिनल या एनट्रारेटिनल ओपेसिटी के बराबर विट्रियस कोशिकाओं की उपस्थिति होती है
4 जलीय कोशिकाओं की कोई भी संख्या घने विट्रस अपारदर्शिता > 20% क्षेत्र पर कब्जा कर लेती है।
और गंभीर सूजन के कारण एक बड़ा हाइपोपियोन और प्यूपिलरी झिल्ली या पूर्ववर्ती संरचना हानि या बड़े सबरेटिनल या इंट्रारेटिनल ओपेसिटी के साथ विट्रीयस कोशिकाओं को फैलाता है

तालिका 2: पीएमयू ओसीटी स्कोर मानदंड: ओसीटी छवियों को तालिका में सूचीबद्ध मानदंडों के अनुसार स्कोर किया जाता है। आंख के अंतिम स्कोर को प्राप्त करने के लिए एसी और पीसी स्कोर जोड़े जाते हैं। ऐसे मामलों में जहां आंख का स्पष्ट दृश्य हासिल नहीं किया गया था, एनए का एक स्कोर छवियों को सौंपा गया था, और इन्हें अध्ययन से बाहर रखा गया था।

हिस्टोलॉजी स्कोर विवरण
विशेषता 0 1 2
पूर्वकाल कक्ष (एसी) प्रोटीन एसी में ईओसिन के साथ धुंधला होने वाले एककोशिकीय कण एसी में कहीं भी मध्यम, लेकिन कॉन्फ्लुएंट नहीं, बाह्य ईओसिन धुंधला होना पूरे एसी में कॉन्फ्लुएंट या निकट बाह्य ईओसिन धुंधला होना
पूर्वकाल कक्ष (एसी) सेल कोई कोशिका नहीं 1-100 कोशिकाएं, लेकिन कोशिकाओं का कोई सघन एकत्रीकरण नहीं >100 कोशिकाएं, या कोशिकाओं के घने एकत्रीकरण
पित्त शरीर की सूजन सिलियरी बॉडी या आसपास के विट्रियस की कोई ल्यूकोसाइट घुसपैठ नहीं सिलियरी शरीर और / या आसपास के विट्रियस में घुसपैठ करने वाले ल्यूकोसाइट्स की एकतरफा उपस्थिति। सिलियरी शरीर और / या आसपास के विट्रियस में घुसपैठ करने वाले ल्यूकोसाइट्स की द्विपक्षीय उपस्थिति।
रेटिना संवहनी सूजन पेरिवास्कुलर ल्यूकोसाइट्स के साथ कोई रेटिना वाहिकाएं नहीं पेरिवास्कुलर ल्यूकोसाइट्स के साथ प्रति खंड एक पोत पेरिवास्कुलर ल्यूकोसाइट्स के साथ प्रति खंड >1 पोत
रेटिना फोल्ड या क्षति रेटिना क्षति नहीं 1-3 रेटिना सिलवटें प्रति अनुभाग >3 रेटिना सिलवट प्रति खंड, या कोई अन्य रेटिना परत विनाश या इंट्रारेटिनल रक्तस्राव

तालिका 3: पीएमयू हिस्टोलॉजी स्कोर मानदंड: आंख के एच एंड ई अनुभागों को तालिका में सूचीबद्ध मानदंडों के आधार पर स्कोर किया गया था। आंख के अंतिम हिस्टोलॉजी स्कोर को प्राप्त करने के लिए एक ही आंख से तीन खंडों को स्कोर किया गया और औसत निकाला गया।

Discussion

यूवाइटिस के पशु मॉडल ओकुलर सूजन और होमियोस्टैसिस के तंत्र को समझने के साथ-साथ यूवाइटिस 37 वाले रोगियों के लिए चिकित्सा और शल्य चिकित्साउपचारों के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन को सक्षम करने में सहायक रहे हैं। पीएमयू मॉडल के खरगोश और चूहे दोनों रूपों ने अवधारणा अध्ययन 38,39,40 के प्रमाण के माध्यम से प्रीक्लिनिकल थेरेपी में अपने मूल्य का प्रदर्शन किया है। चूहों में ट्रांसजेनिक उपभेदों की एक विविध श्रृंखला की उपलब्धता के कारण, माउस पीएमयू मॉडल सिस्टम की स्थापना अब विशिष्ट सेल प्रकारों, मार्गों और जीनों की पहचान करने के लिए अधिक विस्तृत यांत्रिक अध्ययन की अनुमति देती है जो इस बीमारी की विकृति में योगदान करते हैं।

यूवाइटिस के पशु मॉडल सूजन की घटनाओं और तीव्रता में पशु से पशु परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन करसकते हैं। C57BL/6 माउस स्ट्रेन में, PMU को यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से उत्पन्न किया जाता है। ईएयू और ईआईयू42,43 दोनों के लिए यूवाइटिस कोर्स और तीव्रता में तनाव-विशिष्ट भिन्नताएं बताई गई हैं। जबकि पीएमयू की गंभीरता और पाठ्यक्रम पर तनाव-विशिष्ट प्रभावों को प्रयोगात्मक रूप से मापा नहीं गया है, इस मॉडल का उपयोग जंगली प्रकार के सी 57बीएल / 6 जे के साथ-साथ अल्बिनो चूहों (बी 6 (सीजी) -टायरिक -2 जे / जे) में किया गया है और समान भड़काऊ प्रतिक्रियाएं उत्पन्न की गई हैं। पीएमयू मॉडल उत्पन्न करने में, नीचे सूचीबद्ध विचारों को नियंत्रित करने से नए शोधकर्ताओं को परिवर्तनशीलता को सीमित करने और सबसे सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य यूवाइटिस का उत्पादन करने में मदद मिल सकती है।

चमड़े के नीचे इंजेक्शन में स्थिरता सुनिश्चित करें:
एक सुसंगत चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदान करने के लिए, सुनिश्चित करें कि इमल्शन से सभी हवा के बुलबुले हटा दिए गए हैं। विचारों में सिरिंज लोड करने से पहले पूर्वनिर्मित इमल्शन का एक छोटा सेंट्रीफ्यूज (400 x g पर 30 s) शामिल है। इससे इमल्शन में फंसी हवा निकल जाएगी। इसके अलावा, सिरिंज लोड करते समय, समय-समय पर किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए सिरिंज को इनवर्ट (टिप-अप) और टैप करें। इंजेक्शन लगाते समय, इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन से बचने के लिए सिरिंज को बहुत गहरा न रखें। इसके विपरीत, एक उथले (इंट्राडर्मल) इंजेक्शन के परिणामस्वरूप त्वचा के माध्यम से इमल्शन का क्षरण हो सकता है। मोटी चिपचिपी इमल्शन के पूर्ण इंजेक्शन को सुनिश्चित करने और त्वचा से रिफ्लक्स को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट से सिरिंज को हटाने से पहले संक्षेप में रुकना याद रखें।

चमड़े के नीचे इंजेक्शन लगाने के सात दिन बाद, पिछले पैरों के दोनों ओर स्पष्ट नोड्यूल्स की उपस्थिति की पुष्टि करें। यदि कोई नोड्यूल की पहचान नहीं की जा सकती है, तो यह संभव है कि इमल्शन के बजाय हवा को इंजेक्ट किया गया था। इस मामले में, तीव्र सूजन उतनी मजबूत नहीं हो सकती है, और पुरानी सूजन विकसित नहीं हो सकती है।

संक्रामक एंडोफथाल्मिटिस के विकास को रोकें:
बैक्टीरियल या फंगल एंडोफथाल्मिटिस एक भ्रामक चर उत्पन्न करेगा यदि रोका नहींजाता है। बैक्टीरियल एंडोफथाल्मिटिस को रोकने के लिए, आंख के संपर्क में आने वाले सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों को इंट्राविट्रल सस्पेंशन, हैंडलिंग और सफाई करते समय हमेशा अच्छी सड़न रोकनेवाली तकनीक का अभ्यास करें। बाँझ एकल-उपयोग वस्तुओं का उपयोग करना, ऑटोक्लेविंग, या 95% अल्कोहल वॉश या वाइप्स के साथ सफाई करना महत्वपूर्ण है। ओकुलर सतह, ढक्कन और पेरिओकुलर फर पर लागू बीटाडीन का उचित उपयोग भी एंडोफथाल्मिटिस45 को रोकने में मदद करेगा। संक्रमण के साथ एक आंख को पहचानना सरल है क्योंकि ओकुलर संरचनाएं इंजेक्शन के बाद के पाठ्यक्रम के दौरान अत्यधिक सूजन से नष्ट हो जाएंगी। यह पीएमयू के लिए विशिष्ट नहीं है। इंट्राओकुलर रक्तस्राव की उपस्थिति भी इंजेक्शन से एंडोफथाल्मिटिस या आघात का सुझाव दे सकती है। ऐसे मामलों में, इन जानवरों को अध्ययन से बाहर रखें।

इंट्राविट्रल इंजेक्शन में स्थिरता सुनिश्चित करें:
इंट्राविट्रल इंजेक्शन पीएमयू में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सूजन के प्रेरण में एक महत्वपूर्ण कदम है। प्रत्येक इंजेक्शन के साथ एमटीबी निलंबन की एक सुसंगत मात्रा प्रदान करना, आघात से बचना और निलंबन के रिफ्लक्स को रोकना सभी कारक हैं जिन्हें इंजेक्शन करते समय माना जाना चाहिए। एक सुसंगत निलंबन सुनिश्चित करने के लिए, भंवर पिघलने पर और सिरिंज में लोड करने से पहले स्टॉक को अच्छी तरह से निलंबित करता है। चूंकि उपयोग किया जाने वाला यह एमटीबी अर्क एक समाधान नहीं बनाता है, इसलिए निलंबन समय के साथ अवसादन से गुजर सकता है। प्रत्येक इंजेक्शन में एमटीबी अर्क की समान एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए, लोडिंग के 15 मिनट के भीतर सिरिंज का उपयोग या निष्कासन और पुन: लोड करें। फेनिलफ्राइन का उपयोग फैलाव के लिए किया जाता है ताकि पीछे की आंख को एक बड़ा क्षेत्र प्रदान किया जा सके और इंजेक्शन के दौरान आंख को आघात के जोखिम को कम किया जा सके। यह बूंद प्राकृतिक ढक्कन वापसी और ग्लोब के मामूली प्रोप्टोसिस उत्पन्न करती है, जिससे आंख को बल के साथ पकड़ने की आवश्यकता के बिना लिम्बस के पीछे 1-2 मिमी क्षेत्र का अच्छा विज़ुअलाइज़ेशन होता है। आंख को नियंत्रित करने के लिए बल का उपयोग करने से संभावित आघात हो सकता है और क्षणिक रूप से इंट्राओकुलर दबाव और एमटीबी निलंबन के रिफ्लक्स का खतरा बढ़ सकता है। आघात आंख में बहुत अधिक मात्रा इंजेक्ट करने के प्रयास के कारण भी हो सकता है। इंजेक्शन की मात्रा 2 μL तक सीमित है ताकि आंख को इंट्राओकुलर दबाव और आघात की महत्वपूर्ण और लंबे समय तक ऊंचाई को रोका जा सके। इसके अतिरिक्त, छोटे जानवरों की आंखें होंगी जो वयस्क चूहों की तुलना में छोटी हैं। आमतौर पर 6-8 सप्ताह के चूहे (20-25 ग्राम) एक समान आंख का आकार प्रदान करते हैं और एमटीबी के इंजेक्शन के बाद सूजन में अधिक स्थिरता सुनिश्चित करते हैं। छोटे चूहों में माइकोबैक्टीरियल निलंबन के पोस्ट-इंजेक्शन रिफ्लक्स की एक उच्च आवृत्ति देखी गई थी। यह बदले में, अपेक्षा से कम तीव्र सूजन की ओर जाता है। एक पतला फ्लोरेसिन समाधान का उपयोग नौसिखिए इंजेक्टर को उनकी इंजेक्शन तकनीक की सफलता पर दृश्य प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए किया जाता है। इंजेक्शन के समय फैलाव विट्रीस गुहा में इंजेक्शन सामग्री के प्रत्यक्ष दृश्य और लेंस आघात के किसी भी सबूत को नोट करने का अवसर प्रदान करेगा। लेंस आघात के मामले में, यह लेंस स्पष्टता में बदलाव का कारण बन सकता है जो मोतियाबिंद का कारण बनेगा जिसे ओसीटी पर देखा जा सकता है। ओकुलर आघात के मामले में, लेंस-प्रेरित यूवाइटिस46 की संभावना के कारण आंखों को अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए। हम आंख से सिरिंज को हटाने से पहले 10 सेकंड के लिए रुकने की सलाह देते हैं ताकि आंख के भीतर एमटीबी निलंबन के फैलाव की अनुमति मिल सके और रिफ्लक्स को कम किया जा सके।

पीएमयू मॉडल को इंट्राविट्रल इंजेक्शन में एमटीबी की एकाग्रता को बदलकर तीव्र सूजन की तीव्रता को बदलने के लिए संशोधित किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला में पहले 2.5 μg /μL से 15 μg / μL तक विभिन्न खुराक का परीक्षण किया गया है। हालांकि, 10 μg / μL से अधिक खुराक गंभीर आंखों की क्षति का कारण पाई गई, जिसमें सहज लेंस टूटना, गंभीर कॉर्नियल एडिमा और स्कारिंग और हाइफेमा शामिल हैं। गंभीरता की यह डिग्री पोस्ट-संक्रामक यूवाइटिस वाले मानव रोगियों में विशिष्ट नहीं है, और इसलिए, इन सांद्रता की सिफारिश नहीं की जाती है। एक 5 μg / μL खुराक को विश्वसनीय रूप से हल्के से मध्यम तीव्र सूजन और हल्के क्रोनिक यूवाइटिस का उत्पादन करने के लिए पाया गया था; 10 μg / μL खुराक एक विश्वसनीय रूप से मध्यम से गंभीर तीव्र बीमारी और अधिक उल्लेखनीय पुरानी बीमारी पैदा करती है। इस प्रकार, इंट्राविट्रल एकाग्रता को बदलने से प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर आवश्यकतानुसार उपयोग के लिए वैकल्पिक रोग अलगाव प्रदान किया जा सकता है। नियंत्रण ों का चयन यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि परिणाम एमटीबी की प्रतिक्रिया के कारण हैं, न कि चमड़े के नीचे या इंट्राविट्रल इंजेक्शन से जुड़े आघात के कारण। शाम इंजेक्शन नियंत्रण में, पीबीएस का उपयोग एमटीबी अर्क के स्थान पर किया जा सकता है। अनएक्सपोज़्ड जानवरों की तुलना के लिए, सच्चे भोले नमूनों पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि साथी आंखें हमेशा बराबर नहीं होती हैं।

माउस आंख के छोटे आकार के कारण, ओसीटी प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन या सूक्ष्म उज्ज्वल क्षेत्र फोटोग्राफी की तुलना में पूर्ववर्ती कक्ष में सूजन का पता लगाने के लिए एक अधिक संवेदनशील परख हो सकती है। चूहों में पीएमयू के साथ पूर्व कार्यने निर्धारित किया कि ओसीटी की तुलना में हिस्टोलॉजी द्वारा अधिक कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है लेकिन दोनों तौर-तरीकों के बीच एक अच्छा सहसंबंध है। ओसीटी का अतिरिक्त लाभ यह है कि इसका उपयोग एक ही जानवर में अनुदैर्ध्य रूप से सूजन की निगरानी के लिए किया जा सकता है। यूवाइटिस के अन्य प्रमुख माउस मॉडल, जैसे कि ईएयू और ईआईयू, ने मात्रात्मक विश्लेषण 12,47,48 के लिए ओसीटी को भी नियोजित किया है। चूहों के पीएमयू मॉडल में, पूर्ववर्ती कक्ष कोशिकाएं केवल ओसीटी पर दिखाई देती हैं और नैदानिक परीक्षाओं पर नहीं देखी जा सकती हैं जब तक कि एक बड़ा हाइपोपियोन मौजूद न हो। विट्रियस सूजन (विट्रिटिस) को कलर फंडस इमेजिंग के साथ देखा जा सकता है, लेकिन मात्रात्मक परिवर्तन का पता लगाना केवल ओसीटी इमेजिंग के साथ संभव है। मॉडल के अन्य पहलुओं, जैसे रेटिना संवहनी सूजन और रेटिना क्षति, को ओसीटी और माइक्रोस्कोपिक ब्राइटफील्ड फंडस फोटोग्राफी के साथ आसानी से पहचाना जा सकता है।

ओसीटी का उपयोग करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि सूजन की डिग्री में क्षेत्रीय अंतर से स्थानीयकृत इमेजिंग कैसे प्रभावित हो सकती है। पूर्व रिपोर्टों ने मनुष्यों के पूर्ववर्ती कक्ष में कोशिकाओं के असमान वितरण की पहचान की है, जिसमें अधिक कोशिकाएंहीन रूप से स्थित हैं। चूहों में, एक समान प्रवृत्ति आम है। इस प्रकार, एसी के माध्यम से ऊर्ध्वाधर या रेडियल स्कैन उन छवियों को सुनिश्चित करने में मदद करेंगे जो सूजन की सीमा को कैप्चर करते हैं। इसके अतिरिक्त, एक ही स्थान पर इमेजिंग करने से एक ही आंख में एकत्रित छवियों को अनुदैर्ध्य रूप से स्थिरता भी मिलेगी। आंख के एक ही हिस्से में छवियां प्राप्त करने के लिए, स्थिर स्थलों और एक व्यवस्थित दृष्टिकोण का उपयोग करें। पूर्वकाल कक्ष छवियों के लिए, छवि कॉर्निया के शीर्ष के तुरंत बगल में केंद्रित है और लंबवत रूप से उन्मुख है ताकि हाइपोपियन की उपस्थिति को अवर कोण में पता लगाया जा सके। पश्चवर्ती खंड छवियों के लिए, छवि ऑप्टिक तंत्रिका पर केंद्रित है। क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता को कैप्चर करने के लिए स्कोरिंग के लिए कम से कम 3 लाइन स्कैन का उपयोग करने पर विचार करने की सिफारिश की जाती है। ऐसे मामलों में जहां सूजन परिधीय स्थानों तक सीमित है, वॉल्यूम स्कैन प्राप्त करना सहायक हो सकता है। वॉल्यूम स्कैन का संग्रह क्षेत्रीय विविधताओं को पकड़ने में भी मदद कर सकता है लेकिन डेटा भंडारण आवश्यकताओं को बढ़ाएगा।

पीएमयू माउस मॉडल में सूजन को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जा सकने वाले अन्य विवो परखों में बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग13,35 शामिल हैं। मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण जैसे पोस्टमार्टम परीक्षण आंख के जलीय और पीछे के कक्ष में घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की आबादी की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए किए जा सकते हैं। पीएमयू मॉडल में, तीव्र सूजन को एक प्रमुख न्यूट्रोफिल घुसपैठ के साथ एक सहज प्रतिक्रिया की विशेषता है, इसके बाद एक पुरानी और लगातार अनुकूली टी सेल प्रमुख प्रतिक्रिया होती है जो एक महीने35 से अधिक समय तक बनी रहती है। प्रतिरक्षा समारोह के अन्य परख जो पोस्टमार्टम ऊतकों पर किए जा सकते हैं, उनमें ओकुलर द्रव साइटोकिन विश्लेषण शामिल है। इसके अतिरिक्त, एमआरएनए अनुक्रमण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग जैसे अन्य डाउनस्ट्रीम परख का उपयोग यूवाइटिस50,51 में रेटिना प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

पीएमयू मॉडल को विभिन्न प्रजातियों के लिए उपयुक्त अनुकूलन का उपयोग करके अन्य कृंतक प्रणालियों में दोहराया जा सकता है। पीएमयू मॉडल का उपयोग पहले चूहों और खरगोशों 38,39,40 में किया गया है। चूहों में, तीव्र पैनुवाइटिस इंट्राविट्रल इंजेक्शन के बाद विकसित होता है जो हिस्टोलॉजी 24 द्वारा पुरानी सूजन के लक्षण विकसित किए बिना14 दिनों में अनायास हल हो जाता है। खरगोशों में, यूवाइटिस का प्रेरण इंट्राविट्रल इंजेक्शन से पहले चमड़े के नीचे इंजेक्शन के दो दौर का उपयोग करता है, लेकिन एक मजबूत पैनुविटिस भी उत्पन्न करता है। माउस मॉडल का उपयोग करने के फायदों में से एक कई ट्रांसजेनिक और नॉकआउट उपभेदों की तैयार उपलब्धता है जो यूवाइटिस52 के मूल तंत्र को समझने में मदद कर सकते हैं। सभी कृंतक मॉडल का उपयोग प्रीक्लिनिकल थेरेपी परीक्षण के लिए किया जा सकता है यदि एजेंट को व्यवस्थित रूप से या सामयिक गिरावट के रूप में प्रशासित किया जाता है। हालांकि, उनके बड़े आकार के कारण, चूहे और खरगोश की आंखें यूवाइटिस के लिए प्रत्यारोपण योग्य या स्थानीय इंजेक्शन उपचार विकल्पों के प्रीक्लिनिकल अध्ययन में उपयोग के लिए बेहतर मॉडल हैं।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल एक नए उपकरण के साथ पुरानी ओकुलर सूजन के तंत्र का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं को प्रदान करता है जो ओकुलर एंटीजन के साथ पूर्व टीकाकरण पर निर्भर नहीं है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, मैरीलैंड, संयुक्त राज्य अमेरिका (केपी) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW विजन रिसर्च कोर ग्रांट (NEI P30EY01730), मार्क डेली, एमडी रिसर्च फंड और क्रिस्टोफर और एलिडा लैथम रिसर्च फंड से उपहार से वित्त पोषण द्वारा समर्थित है। ब्रिस्टल में किए गए काम को साइट रिसर्च यूके और द अंडरवुड ट्रस्ट से अतिरिक्त धन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-FLUOR Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial
AnaSed Akorn Animal Health, IL, USA NDC 59399-110-20 Xylazine 20 mg/mL
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution Alcon, TX, USA 8007-1
B-D Precision Glide Needles -25 G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305122
B-D Precision Glide needle -30-G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305106
Bond MAX, Bond Rx Leica Biosystems, IL,USA Automated IHC staining system
Chloramphenicol ointment Martindale Pharma, Romford, UK 1% w/w Chloramphenicol
EG1150H Leica Biosystems, IL,USA Tissue Embedding
Envisu R2300 Bioptigen/Leica OCT Machine
Freund's Incomplete Adjuvant BD Difco, NJ, USA 263910
GenTeal lubricant eye ointment Alcon, TX, USA ---
GenTeal lubricant eye gel Alcon, TX, USA ---
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract BD Difco, NJ, USA 231141
Hamilton RN Needle (33/12/2)S Hamilton, Reno, NV 7803-05(33/12/2) 33 G
Hamilton syringe Hamilton, Reno, NV CAL7633-01 5 µL
Insulin needle Exel International, USA 26029 1 mL
Isoflurane
Ketaset Zoetis, USA 377341 Ketamine HCL 100 mg/mL
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller World Precision Instruments, FL, USA UMP3
Micron IV Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA Alternative Imaging/OCT Machine
Nanofil 10 µL syringe World Precision Instruments, FL, USA NANOFIL
Nanofil Intraocular Injection Kit World Precision Instruments, FL, USA IO-KIT
Olympus SZX10 Olympus Dissection scope
PBS Gibco 14190
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 17478020115
RM2255 Leica Biosystems, IL,USA Tissue Sectioning
TB Syringe Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 309602 1 mL
Tetracaine 0.5% Alcon, TX, USA 1041544
Tissue Tek VIP series Sakura Finetek USA, Inc.,CA. Histology Tissue Processing
Tropicamide 1% Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK Minims
Tylenol Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA NDC 50580-614-01 Acetaminophen
Viscotears Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK Carbomer eye gel 0.2% w/w

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 178
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John, S., Bell, O. H., Wilson, L., Copland, D. A., Pepple, K. L. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis. J. Vis. Exp. (178), e62925, doi:10.3791/62925 (2021).

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