La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.
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Artículo de método
Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama
En este artículo
Resumen
Resumen
El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en las mujeres. El crecimiento de las células de cáncer de mama y su posterior metástasis es un factor clave para su progresión. Aunque los mecanismos implicados en la promoción del crecimiento del cáncer de mama se han estudiado intensamente utilizando monocultivos de células de cáncer de mama como las células MCF-7, no se ha investigado en profundidad la contribución de otros tipos de células, como las células endoteliales vasculares y linfáticas que están íntimamente implicadas en el crecimiento tumoral. La interacción célula-célula juega un papel clave en el crecimiento y la progresión del tumor. La neoangiogénesis, o el desarrollo de vasos, es esencial para el crecimiento tumoral, mientras que el sistema linfático sirve como un portal para la migración de células cancerosas y la metástasis posterior. Estudios recientes proporcionan evidencia de que las células endoteliales vasculares y linfáticas pueden influir significativamente en el crecimiento de las células cancerosas. Estas observaciones implican la necesidad de desarrollar modelos in vitro que reflejen de manera más realista los procesos de crecimiento del cáncer de mama in vivo. Además, las restricciones en la investigación con animales requieren el desarrollo de modelos ex vivo para dilucidar mejor los mecanismos involucrados.
Este artículo describe el desarrollo de esferoides de cáncer de mama compuestos tanto por células de cáncer de mama (células MCF-7 con receptor de estrógeno positivo) como por células endoteliales vasculares y/o linfáticas. El protocolo describe un enfoque detallado paso a paso en la creación de esferoides de doble celda utilizando dos enfoques diferentes, gota colgante (estándar de oro y barato) y placas de fondo en U de 96 pocillos (caro). Se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo recoger delicadamente los esferoides formados para monitorear el crecimiento mediante el dimensionamiento microscópico y la evaluación de la viabilidad utilizando la tinción de células muertas y vivas. Además, se delinean procedimientos para fijar los esferoides para seccionar y teñir con anticuerpos específicos del crecimiento para diferenciar los patrones de crecimiento en los esferoides. Además, se proporcionan detalles para preparar esferoides con células transfectadas y métodos para extraer ARN para análisis molecular. En conclusión, este artículo proporciona instrucciones detalladas para preparar esferoides multicelulares para la investigación del cáncer de mama.
Introducción
El uso de animales para experimentos tiene limitaciones. Los estudios en animales no pueden imitar con precisión la progresión de la enfermedad en humanos, y los animales y los humanos no tienen respuestas idénticas a los patógenos. Además, las restricciones en la experimentación con animales debido a las preocupaciones por el sufrimiento animal y los problemas éticos1,2 restringen cada vez más los programas de investigación. In vitro se han desarrollado ampliamente sistemas para eludir el uso de animales; además, el uso de células humanas ha hecho in vitro modelos más relevantes para la inve....
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Protocolo
1. Cultivo celular
NOTA: Realizar el manejo celular en condiciones estériles.
- Subcultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)
- Cubra 75 cm2 matraces con colágeno (5 μg/cm2) (cola de rata) durante la noche (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 h a 37 °C, enjuague con agua y deje que el matraz se seque.
- Cultivar HUVEC en medio de crecimiento (EBM-2, Medio Basal Endotelial-2) suplementado con glutamina (1x = 2 mM), solución antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina y 0,025 μg/mL de anfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL de hi....
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Resultados
El modelo de esferoides que utiliza cocultivos epiteliales y endoteliales es necesario para imitar de cerca las condiciones in vivo de los tumores de mama para experimentos in vitro. El esquema de la Figura 1 representa el protocolo para formar esferoides con células epiteliales de cáncer de mama y células endoteliales vasculares o linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula se siembra por separado en un plato redondo de 3,5 cm y se trata con est.......
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Discusión
En comparación con los cultivos celulares 2D, la revolucionaria tecnología de cultivo de esferoides 3D es una herramienta mejor y más poderosa para reconstruir el microambiente de un órgano, las interacciones célula-célula y las respuestas a los medicamentos in vitro. Este es el primer protocolo que describe la formación de esferoides a partir de líneas celulares multicelulares (epiteliales y endoteliales) para la investigación del cáncer de mama. Este protocolo garantiza el crecimiento esferoidal en 3D de los e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la subvención KFS-4125-02-2017 de la Fundación para la Investigación del Cáncer / Liga Suiza del Cáncer y la subvención DK079307 del Instituto Nacional de Salud a EKJ.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 mm y 20 mm placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Pipeta serológica, poliestireno, empaquetado individualmente, estéril | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Versión: 13.0.1 (64- bit) | ||
| Solución antibiótica antimicótica (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calceína-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (grupo de diferenciación 31) | Cell Marque | 131M-95 | clon monoclonal de ratón ab JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (citoqueratinas 8 y 18) | DBS | Mob189-05 | ratón monoclonal ab, clon 5D3 |
| CKX41 Microscopio invertido | Olympus Life Science | Cámara digital Olympus DP27 | |
| Caspasa escindida | Señalización celular | 9661L | conejo policlonal ab |
| Colágeno (cola de rata) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluyente | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluyente II |
| Coulter Z1, Contador de células | Coulter Electrónica, Luton, Reino Unido | ||
| Medios de cultivo deshidratados: Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Neonatal endotelial microvascular dérmico, donantes agrupados (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/Mezcla de nutrientes F-12 Jamón | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Crecimiento de células endoteliales Medio basal-2 | Lonza | 190860 | |
| Homodímero de etidio | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Suero fetal de ternera (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Suero fetal de ternera despojado de carbón (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Microscopios estereoscópicos de fluorescencia Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Células endoteliales de la vena umbilical humana | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | Instituto Nacional de Salud, EE. UU. | Wayne Rasband Versión: 1.52a (64 bits) | |
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal AB, clon SP6 |
| Microscopio estereoscópico de fluorescencia totalmente motorizado Leica | Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Microtomo | 149MULTI0C1 | ||
| Kit de suplemento de crecimiento sérico bajo (kit LSGS) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 células – línea celular de adenocarcinoma de mama humana | Clínica de Ginecología, Hospital Universitario de Zúrich | Sobrevivido por el Dr. Andrè Fedier obtenido de ATCC | |
| Nunclon Sphera Placa de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tampón de lisis de proteínas | Señalización celular, Danvers, EE. UU | 9803 | |
| Kit de minipreparación de ARN rápido | Zymo Research | R1055 | |
| Tampón de lisis de ARN | Zymo Research | R1060-1-100 | Contenido en el kit de minipreparación de ARN rápido |
| Centrífuga Rotina 46R Tubos | Hettich | ||
| , 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlín, DE | ||
| Lector de microplacas Tecan Infinite serie M200 | Tecan, Salzburgo, AU | ||
| Matraces de cultivo de tejidos 75 | TPP | 90076 | |
| Solución de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
Referencias
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell.
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Reimpresiones y permisos
