Artículo de método

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

DOI:

10.3791/62940

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12 de julio de 2021

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1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

En este artículo

Resumen

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La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.

Resumen

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El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en las mujeres. El crecimiento de las células de cáncer de mama y su posterior metástasis es un factor clave para su progresión. Aunque los mecanismos implicados en la promoción del crecimiento del cáncer de mama se han estudiado intensamente utilizando monocultivos de células de cáncer de mama como las células MCF-7, no se ha investigado en profundidad la contribución de otros tipos de células, como las células endoteliales vasculares y linfáticas que están íntimamente implicadas en el crecimiento tumoral. La interacción célula-célula juega un papel clave en el crecimiento y la progresión del tumor. La neoangiogénesis, o el desarrollo de vasos, es esencial para el crecimiento tumoral, mientras que el sistema linfático sirve como un portal para la migración de células cancerosas y la metástasis posterior. Estudios recientes proporcionan evidencia de que las células endoteliales vasculares y linfáticas pueden influir significativamente en el crecimiento de las células cancerosas. Estas observaciones implican la necesidad de desarrollar modelos in vitro que reflejen de manera más realista los procesos de crecimiento del cáncer de mama in vivo. Además, las restricciones en la investigación con animales requieren el desarrollo de modelos ex vivo para dilucidar mejor los mecanismos involucrados.

Este artículo describe el desarrollo de esferoides de cáncer de mama compuestos tanto por células de cáncer de mama (células MCF-7 con receptor de estrógeno positivo) como por células endoteliales vasculares y/o linfáticas. El protocolo describe un enfoque detallado paso a paso en la creación de esferoides de doble celda utilizando dos enfoques diferentes, gota colgante (estándar de oro y barato) y placas de fondo en U de 96 pocillos (caro). Se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo recoger delicadamente los esferoides formados para monitorear el crecimiento mediante el dimensionamiento microscópico y la evaluación de la viabilidad utilizando la tinción de células muertas y vivas. Además, se delinean procedimientos para fijar los esferoides para seccionar y teñir con anticuerpos específicos del crecimiento para diferenciar los patrones de crecimiento en los esferoides. Además, se proporcionan detalles para preparar esferoides con células transfectadas y métodos para extraer ARN para análisis molecular. En conclusión, este artículo proporciona instrucciones detalladas para preparar esferoides multicelulares para la investigación del cáncer de mama.

Introducción

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El uso de animales para experimentos tiene limitaciones. Los estudios en animales no pueden imitar con precisión la progresión de la enfermedad en humanos, y los animales y los humanos no tienen respuestas idénticas a los patógenos. Además, las restricciones en la experimentación con animales debido a las preocupaciones por el sufrimiento animal y los problemas éticos1,2 restringen cada vez más los programas de investigación. In vitro se han desarrollado ampliamente sistemas para eludir el uso de animales; además, el uso de células humanas ha hecho in vitro modelos más relevantes para la investigación fisiopatológica y terapéutica. Los cultivos celulares monocapa convencionales (2D) son ampliamente utilizados porque imitan los tejidos humanos hasta cierto punto. Sin embargo, los monocultivos 2D no logran imitar los órganos humanos, y los monocultivos 2D no pueden simular el complejo microambiente de los órganos originales e imitar el in vivo situación3,4,5,6. Además, en cultivos celulares monocapa, los tratamientos farmacológicos podrían destruir / dañar fácilmente todas las células. Es importante destacar que algunas de estas limitaciones se pueden superar cambiando a cultivos celulares tridimensionales (3D) multicapa.7,8. De hecho, se ha demostrado que los modelos de cultivo 3D reflejan mejor la estructura celular, el diseño y la función de las células en los tejidos primarios. Estos cultivos 3D se pueden formar utilizando una variedad de líneas celulares, similares a un órgano funcional. De hecho, hay dos modelos de culturas 3D. Un modelo produce esferoides de células agregadas que forman grupos y los reorganizan en esferas (modelos sin andamios). El segundo produce organoides, que tienen una estructura más compleja y consisten en combinaciones de múltiples células específicas de órganos, que se consideran como una versión en miniatura de los órganos.9,10. Debido a esto, los sistemas de cultivo 3D representan una tecnología innovadora con muchas aplicaciones biológicas y clínicas. Por lo tanto, los esferoides y organoides tienen numerosas aplicaciones para el modelado de enfermedades y estudios relacionados con la medicina regenerativa, la detección de drogas y los estudios toxicológicos.6,11,12,13,14,15. Los esferoides cancerígenos, derivados de la tecnología 3D, recrean la morfología y el fenotipo de los tipos de células relevantes, imitan el in vivo microambiente tumoral y modelar las vías de comunicación y señalización de las células que están operativas durante el desarrollo del tumor16,17,18. Además, para mejorar la comprensión de la biología del cáncer, los esferoides/organoides tumorales también se pueden usar para identificar una posible terapia contra el cáncer específica del paciente (personalizada) y evaluar su eficacia, toxicidad y efectos a largo plazo.19,20,21,22. Los esferoides han abierto oportunidades prominentes para investigar la fisiopatología, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos debido a su capacidad para preservar la arquitectura de tejidos celulares y tridimensionales, la capacidad de imitar la in vivo situación, y las interacciones célula-célula. Sin embargo, también se deben ser conscientes de las limitaciones de este sistema, como la falta de componente vascular / sistémico, sistema inmunológico o nervioso funcional, y el sistema representa un enfoque reduccionista en comparación con los modelos animales. De hecho, a diferencia de los modelos animales, las estructuras 3D proporcionan solo una aproximación de la biología dentro de un cuerpo humano. Comprender las limitaciones del método 3D puede ayudar a los investigadores a diseñar procesos más refinados y válidos para producir esferoides que representen mejor un órgano a mayor escala.23,24,25.

El cáncer es la principal causa de muerte en todo el mundo, y el cáncer de mama es el cáncer más común en las mujeres26,27,28. Para imitar el complejo microambiente del cáncer de mama, los esferoides del cáncer de mama deben cultivarse utilizando células que desempeñan un papel destacado en los tumores de mama, es decir, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos y / o células inmunes. Además, para un esferoide que representa el cáncer de mama, también se debe considerar la expresión de los receptores de hormonas femeninas (receptores de estrógeno / progesterona), la capacidad de conservar el estado histológico tumoral del paciente y la capacidad de imitar la respuesta a la terapia. Los estudios han demostrado que los sistemas de cocultivo 3D tienen una organización celular similar a la del tejido primario in vivo,tienen la capacidad de reaccionar en tiempo real a los estímulos y tienen receptores andrógenos funcionales29,30,31,32. Por lo tanto, un enfoque similar podría ser útil para imitar un tumor de mama in vitro. El propósito del protocolo actual es establecer un nuevo método de generación de esferoides de cáncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 con receptores de estrógeno positivos (una línea celular humana inmortalizada de células epiteliales) y células endoteliales vasculares (HUVEC) o células endoteliales linfáticas (HMVEC-DNeo) para crear un modelo que imita o refleja de cerca las interacciones entre estas células dentro de un tumor. Aunque MCF-7 (sensible al estrógeno) y las células endoteliales se han utilizado para desarrollar esferoides en el presente estudio, otras células como los fibroblastos que representan ~ 80% de la masa tumoral de mama, también podrían combinarse en el futuro para representar e imitar mejor el tumor de mama.

Existen varios métodos para formar esferoides, tales como: 1) el método de gotas colgantes que emplea la gravedad33,34; 2) el método de levitación magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expuestas a un imán externo35,y 3) el método de microplaca esferoide que se realiza mediante la siembra de células en placas de baja unión36,37. Sobre la base de los métodos existentes, que utilizan un solo tipo de célula, el presente protocolo se ha optimizado utilizando células epiteliales y endoteliales para imitar mejor las condiciones de crecimiento de los tumores de cáncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método se puede lograr fácilmente en el laboratorio a un bajo costo y con requisitos mínimos de equipo. Sobre la base de la necesidad / objetivos del laboratorio, se utilizaron diferentes enfoques para formar esferoides y obtener material celular relevante a partir de estos esferoides. En este contexto, para el análisis de ADN, ARN o proteínas, los esferoides 3D se producen mediante el cocultivo de células endoteliales y epiteliales con el método de gota colgante. Sin embargo, para estudios funcionales, por ejemplo, para monitorear el crecimiento celular después de una transfección de interferencia corta (siRNA) y / o tratamiento hormonal, los esferoides se generan utilizando placas de fondo en U.

El propósito de este protocolo técnico es proporcionar una descripción detallada paso a paso para 1) la formación de esferoides de tipo multicelular del cáncer de mama, 2) la preparación de muestras para la tinción histológica y 3) la recolección de células para la extracción de ARN, ADN y proteínas. Tanto el método de gota colgante de bajo costo como las placas de fondo en U más caras se utilizan para formar esferoides. Aquí, se proporciona un protocolo para preparar (fijar) esferoides para el seccionamiento y la posterior inmunotinción con marcadores para evaluar la proliferación celular, la apoptosis y la distribución de las células epiteliales y endoteliales dentro de un esferoide. Además, este protocolo muestra un análisis completo paso a paso de los datos histológicos utilizando el software ImageJ. La interpretación de los datos biológicos varía según el tipo de experimento y los anticuerpos utilizados. El seccionamiento de esferoides fijos y la posterior tinción de las secciones fue realizado por un laboratorio de patología de rutina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

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Protocolo

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1. Cultivo celular

NOTA: Realizar el manejo celular en condiciones estériles.

  1. Subcultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)
    1. Cubra 75 cm2 matraces con colágeno (5 μg/cm2) (cola de rata) durante la noche (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 h a 37 °C, enjuague con agua y deje que el matraz se seque.
    2. Cultivar HUVEC en medio de crecimiento (EBM-2, Medio Basal Endotelial-2) suplementado con glutamina (1x = 2 mM), solución antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina y 0,025 μg/mL de anfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL de hidrocortisona, 10 ng/mL de Factor de Crecimiento Epidérmico humano, 3 ng/mL de Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico humano, 10 μg/mL de heparina) y 10% FCS (Fetal Calf Serum) en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37 °C, 5% CO2). Cambie el medio cada 2 días hasta que las células alcancen el 70% -80% de confluencia.
    3. Lavar los cultivos subconfluentes con 5 mL de HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)y añadir 3 mL de tripsina (0,25% diluido en HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)).
      NOTA: HBSS también se puede reemplazar con PBS.
    4. Incubar las células a 37 °C durante 2 min (comprobar microscópicamente si las células están desprendidas y redondeadas hacia arriba) y detener la reacción de desprendimiento añadiendo 6 mL de medio FCS al 10% (DMEM-F12 o EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante.
    6. Suspender las células en medio de crecimiento y sembrar en 75 cm2 matraces o platos de cultivo.
  2. Subcultivo de la Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, células de adenocarcinoma mamario humano)
    1. Cultivar líneas celulares de cáncer de mama humano en matraces de 75 cm2 en medio de crecimiento (medio DMEM/F12 suplementado con glutamina comercial (1x), solución antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina y 0,025 μg/mL de anfotericina B) y 10% de FCS en condiciones estándar de cultivo tisular (37 °C, 5% CO2). Cambie el medio cada 2-3 días.
    2. Lavar los cultivos celulares subconfluentes (70%-80% de confluencia) con 5 mL de HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)y añadir 3 mL de tripsina (0,5% diluido en HBSS (sin Ca 2+ y Mg2+) a37°C durante 5 min (verificar microscópicamente que las células están desprendidas).
      NOTA: HBSS también se puede reemplazar con PBS.
    3. Agregue 8 ml de medio FCS al 10% para detener la reacción de desprendimiento, centrífuga a 250 x g durante 5 minutos en RT y deseche el sobrenadante.
    4. Suspenda el pellet en medio de crecimiento y placa en 75 cm2 matraces o platos de cultivo.

2. Formación de esferoides

  1. Placa 5 x 105 células/ml (HUVECs y MCF-7) en plato redondo de 3,5 cm y cultivo durante 48 h.
  2. Tratar o transfectar las células chapadas durante 24 horas o como se desee.
  3. Paso opcional realizado en placa de fondo en U de 96 pocillos: Lave las células con 1 ml de HBSS (Ca2+ y Mg2+)y manche los HUVEC con un tinte azul (0,5 μg/mL) y las células MCF-7 con un colorante verde (0,5 μM) diluido en el medio de crecimiento respectivo y colóquelos en una incubadora de 37 °C y 5% de CO2 durante 30-40 min.
  4. Lave las células con 1 ml de HBSS (sin Ca2+ y Mg2+),agregue 1 ml de reactivo de desprendimiento enzimático (tripsina al 0,25% para HUVEC y tripsina al 0,5% para MCF-7) a cada plato redondo con una pipeta P1000, y luego incube durante 2-5 minutos hasta que las células se separen.
  5. Recoja cada tipo de célula por separado en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y agregue 1 ml de medio FCS al 10% utilizando una pipeta P1000 para detener la reacción enzimática. Centrifugar las suspensiones celulares a 250 x g durante 5 min.
  6. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y suspenda las células en 1 ml de medio libre de esteroides (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimicótico, 0.4% FCS sf (carbon-stripped)).
    NOTA: El medio libre de esteroides se puede reemplazar con un medio de crecimiento normal.
  7. Utilice 100 μL de cada suspensión celular diluida con 10 mL de Diluyente II (ver Tabla de Materiales)para determinar el número total de células y calcular la cantidad de medio de tratamiento (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimicótico, 0,4% FCS sf, vehículo/Tratamiento) necesario para obtener una suspensión celular de 5 x 103 células/ml o 3,4 x 105 células/ml por tipo de célula.
    1. Recuento de celdas
      1. Encienda la máquina y enjuague presionando los botones Función e Inicio (configuración S3), con la solución Diluent II en un vial de contador de celdas.
      2. Utilice la configuración de S4 y pulse Inicio para medir el espacio en blanco con una solución diluyente II fresca.
      3. Cambie el vial de centelleo con 100 μL de suspensión celular en 10 ml de solución de Diluent II y mida las muestras: configure S4 y presione Inicio.
      4. Anote el número de celdas por ml en la pantalla digital.
        NOTA: El conteo de células también se puede realizar utilizando otros sistemas manuales o automáticos: líneas de cuadrícula de hemocitómetro, tecnología de conteo de células de dispersión de luz, impedancia eléctrica, sistemas basados en imágenes que utilizan tinción celular, por ejemplo, azul de tripano.
    2. Placas de fondo en U de 96 pocillos
      1. Preparar 5 mL de cada suspensión celular (5 x 103 celdas/mL) y mezclarlos para obtener un volumen final de 10 mL en la proporción de 1:1.
      2. Use una pipeta de repetición manual para pipetear 100 μL de la suspensión celular en cada pozo de las placas de fondo en U de 96 pocillos.
      3. Coloque la placa en una incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos y verifique la formación de esferoides después de 48 h.
      4. Paso opcional: Tome imágenes de los esferoides (40x) usando un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
        NOTA: Este método genera 96 esferoides (un esferoide/pozo) después de 48 h (área 1-2 píxel2),y generalmente se usa para estudios de crecimiento.
    3. Gota colgante
      1. Mezcle las suspensiones celulares (3.4 x 105 celdas/ml) en una proporción de 1:1 para obtener un volumen final de 2 ml.
      2. Use una pipeta P20 para sembrar la mezcla celular en forma de gotas de 15 μL en la tapa invertida de una placa de Petri de 10 cm.
      3. Invierta la tapa con las gotas y agregue 5 ml de medio base (EBM-2) en la parte inferior del plato para evitar la evaporación de las gotas.
        NOTA: Este método genera un esferoide/gota después de 48 h. Asegúrese de que las gotas estén lo suficientemente separadas entre sí, para que no se fusionen al cambiar la tapa. Use más de una placa de Petri de 10 cm si es necesario.

3. Estudio de crecimiento de esferoides

  1. Placa 100 μL de HUVEC y mezcla de células MCF-7 (5 x 102 células/pozo) en placas de fondo en U de 96 pocillos y colóquelas en la incubadora.
  2. 48 h después del recubrimiento, verifique la formación de esferoides con un microscopio invertido (campo brillante). Tome fotografías (al menos seis imágenes por tratamiento, 40x) a 96 h de cultivo.
  3. Abra las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes y procese la imagen a 300 píxeles / pulgada y guarde la imagen como un archivo tiff.
  4. Descargue el software ImageJ y ábralo. Haga clic en la opción Archivo y vaya a Abrir.
  5. Convierta las áreas de interés en áreas negras saturadas de manera uniforme para tener una imagen binaria (blanco y negro). Para ello, seleccione la opción Imagen, elija Tipo | 8 bits. Ahora, la imagen es en blanco y negro.
  6. Utilice la herramienta de selección a mano alzada para dibujar el borde de los esferoides.
  7. Para calcular el área de interés y separar el objeto o los píxeles en primer plano de los píxeles de fondo, utilice la función de umbral: Seleccione la opción Imagen, elija Ajustar y haga clic en Umbral.
  8. Ahora se abrirá una ventana emergente umbral. La barra superior indica el valor de umbral mínimo: establezca el valor en cero. La barra inferior indica el valor umbral máximo: mueva la barra hasta que el área de interés se vuelva completamente roja.
    NOTA: Si el color no es rojo, seleccione Rojo en la ventana Umbral.
  9. Ir a Analizar | Establezca Medidas y seleccione Área y perímetro.
  10. Para medir el área de interés, seleccione la opción Analizar y utilice la herramienta Analizar partículas. En la ventana Analizar partículas, establezca el Tamaño a medir (0.00003-Infinity o 3-Infinity, dependiendo del tamaño de los esferoides), seleccione Resumir y Mostrar resultados. Luego, haga clic en Aceptar.
  11. Los resultados aparecerán en un gráfico. Copie las mediciones en una hoja de cálculo para analizar los datos.
    NOTA: El área se calcula como el número de píxeles totales; utilice el Área total para el cálculo.

4. Estudio de inmunohistoquímica esferoide

  1. Preparación de muestras
    1. Placa la mezcla celular de HUVEC y MCF-7 (5 x 103 celdas/pozo) en placas de fondo en U de 96 pocillos en medio de crecimiento HUVEC durante 96 h.
    2. Recolectar aproximadamente 50 esferoides en un tubo de 1,5 ml con una punta cortada de una pipeta P200 μL; deje que se asienten en el fondo del tubo por gravedad y luego deseche el sobrenadante.
    3. Fijar los esferoides con 500 μL de PFA al 4% durante 1 h, RT.
    4. Hervir la solución de agar Nobel al 2% en PBS utilizando una placa caliente con un agitador magnético durante 3-5 min para disolver completamente el polvo de agarosa y enfriar hasta alrededor de 60 ° C.
    5. Retire el PFA con una pipeta P1000, lave los esferoides con 500 μL de PBS y deje que se sedimenten. Deseche el sobrenadante.
    6. Pipetee cuidadosamente 600 μL de solución de agarosa en el tubo de 1,5 ml con esferoides y coloque el tubo inmediatamente en una centrífuga con un rotor horizontal a 177 x g durante 2 min.
    7. Agregue una cuerda corta en el medio de la solución de agarosa para quitar fácilmente el tapón del tubo.
    8. Solidificar el tapón de agarosa sobre hielo o a 4 °C. Agregue 500 μL de PBS en el tubo de 1.5 ml para evitar que se seque el pellet.
      NOTA: Las muestras están listas para la deshidratación posterior, la incrustación de parafina, la seccionamiento, la transferencia a los portaobjetos del microscopio y la tinción de IHC (realizada por Sophistolab).
  2. Adquisición y procesamiento de imágenes
    1. Adquirir imágenes de secciones esferoides utilizando un estereomicroscopio.
    2. Guarde tres imágenes para cada muestra como archivos .jpg.
    3. Abra el software ImageJ. Abra la imagen JPEG, haga clic en Archivo y luego en Abrir.
    4. Seleccione Color y Deconvolución de color en la opción Imagen.
    5. Seleccione los vectores H DAB en la ventana Deconvolución de color 1.7 y aparecerán las tres imágenes.
      NOTA: Las tres imágenes son: El color 1 representa solo la tinción de hematoxilina (azul / púrpura), y el color 2 representa solo la tinción DAB (marrón). El color 3 no es necesario para el análisis de imágenes con dos tinciones.
    6. Seleccione la ventana Color 1 y establezca el Umbral: vaya a imagen | Ajuste y haga clic en Umbral. Aparecerá la ventana Umbral.
    7. Deje el valor de umbral mínimo establecido en cero y ajuste el valor de umbral máximo para eliminar la señal de fondo sin influir en la señal verdadera. Haga clic en Aplicar.
      1. Medición de área
        1. Haga clic en Analizar, elija Establecer medición. Seleccione Área, Valor gris medioy Valor gris mínimo y máximo y haga clic en Aceptar para confirmar.
        2. Mida el tamaño del núcleo mediante la opción Analizar y, a continuación, seleccione Medir.
          NOTA: La ventana Resultados proporciona el nombre de la imagen (Etiqueta), el tamaño de la imagen (Área), la intensidad media de píxeles de la imagen IHC (Media) y los valores de gris mínimo y máximo (Mín, Máx.). Utilice el valor medio para el cálculo.
        3. Repita los pasos 4.2.6-4.7.1.2 para la ventana Color 2 (y Color 3 si hay doble tinción).
      2. Cuantificación celular
        1. Haga clic en Procesar,elija la opción Binario y seleccione Cuenca para separar las celdas.
        2. Vaya a Analizar y haga clic en Analizar partículas. En la ventana emergente Analizar partículas, establezca el tamaño de las celdas para excluir partículas no específicas. A continuación, en la opción Mostrar, haga clic en el cuadro desplegable y seleccione Contornos. Luego, haga clic en Aceptar.
        3. Repita los pasos 4.2.6-4.2.7 y los pasos de cuantificación de celdas (sección 4.2.7.2) para la ventana Color 2 (y Color 3 si hay doble tinción).
          NOTA: Ahora aparecerán tres ventanas: 1) Resultados de resumen (número de celdas contadas, área total, tamaño promedio, % de área y media), 2) Resultados (correspondientes a las celdas que se cuentan) y 3) Ventana de dibujo (imagen representada de las celdas que se cuentan).

5. Tinción viva/muerta en esferoides

  1. Preparar soluciones madre de 4 mM de Calceína AM en DMSO (tiñe células vivas de verde) y 2 mM de homodímero de Etidio en DMSO (tiñe de glóbulos muertos de rojo) en tubos de 1,5 mL.
  2. Calcule la cantidad de solución necesaria para agregar 10 μL/pocillo de una mezcla de Calceína AM y homodímero de Etidio diluido 1:50 en EBM-2.
  3. Agregue la mezcla de tinción a los esferoides y coloque la placa en la incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos durante 30-60 min.
  4. Adquiera imágenes (40x) utilizando el microscopio estereoscópico de fluorescencia.

6. Aislamiento de proteínas y ARN de esferoides

  1. Prepare suspensiones celulares a 3.4 x 105 células/ ml por tipo de célula, mézclelas en una proporción de 1: 1 y selle la mezcla celular usando una pipeta P20 en forma de gotas de 15 μL en la tapa de una placa de Petri de 10 cm. Invierta la tapa y colóquela en la incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos durante 96 h.
  2. Use 5-6 ml de PBS para recolectar esferoides en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 15 ml utilizando pipetas de poliestireno estériles de 5 ml.
    NOTA: También es posible utilizar tubos cónicos de 15 ml.
  3. Centrifugar la suspensión de los esferoides a 250 x g durante 5 min, y luego aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
  4. Añadir 500 μL de tripsina (100%) y pipetear hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta P1000 durante 30 s para desagregar los esferoides, consiguiendo una suspensión celular.
  5. Neutralizar la tripsina con medio FCS al 10%, centrifugar los tubos a 250 x g durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
  6. De acuerdo con el protocolo del fabricante (kit específico para el aislamiento de ARN libre de ADN), use 300 μL de tampón de lisis de ARN para lisar el gránulo celular.
    NOTA: El tampón de lisis también se puede agregar directamente a los esferoides intactos (no se requiere un paso de tripsina) para extraer el ARN. Agregue 300 μL del tampón de lisis a los esferoides granulados, coloque tubos en hielo y triture 10 veces con una pipeta P200. Posteriormente, aísle el ARN como se mencionó anteriormente. La disociación esferoide puede ser necesaria si la recuperación del ARN es baja debido a la interferencia de la matriz.
  7. Alternativamente, use 70 μL del tampón de lisis para el aislamiento de proteínas. Homogeneizar para 2-4 s por sonicación y determinar la concentración de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando un kit de ensayo BCA.
    NOTA: Para el aislamiento de proteínas, los esferoides granulados se pueden lisar directamente en el tampón de lisis seguido de sonicación. Use 25 μg de proteína total para realizar western blot.

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Resultados

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El modelo de esferoides que utiliza cocultivos epiteliales y endoteliales es necesario para imitar de cerca las condiciones in vivo de los tumores de mama para experimentos in vitro. El esquema de la Figura 1 representa el protocolo para formar esferoides con células epiteliales de cáncer de mama y células endoteliales vasculares o linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula se siembra por separado en un plato redondo de 3,5 cm y se trata con est...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En comparación con los cultivos celulares 2D, la revolucionaria tecnología de cultivo de esferoides 3D es una herramienta mejor y más poderosa para reconstruir el microambiente de un órgano, las interacciones célula-célula y las respuestas a los medicamentos in vitro. Este es el primer protocolo que describe la formación de esferoides a partir de líneas celulares multicelulares (epiteliales y endoteliales) para la investigación del cáncer de mama. Este protocolo garantiza el crecimiento esferoidal en 3D de los e...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por la subvención KFS-4125-02-2017 de la Fundación para la Investigación del Cáncer / Liga Suiza del Cáncer y la subvención DK079307 del Instituto Nacional de Salud a EKJ.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100 mm y 20 mm placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidosCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mmFalcon353001
5 mL Pipeta serológica, poliestireno, empaquetado individualmente, estérilFalcon357543
Adobe PhotoshopVersión: 13.0.1 (64- bit)
Solución antibiótica antimicótica (100×)Sigma-AldrichA5955
Calceína-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (grupo de diferenciación 31)Cell Marque131M-95clon monoclonal de ratón ab JC70
CellTracker Green CMFDA (diacetato de 5-clorometilfluoresceína)InvitrogenC7025
CK8/18 (citoqueratinas 8 y 18)DBSMob189-05ratón monoclonal ab, clon 5D3
CKX41 Microscopio invertidoOlympus Life ScienceCámara digital Olympus DP27
Caspasa escindidaSeñalización celular9661Lconejo policlonal ab
Colágeno (cola de rata)Roche11 179 179 001
Coulter ISOTON II DiluyenteBeckman Coulter844 80 11Diluyente II
Coulter Z1, Contador de célulasCoulter Electrónica, Luton, Reino Unido
Medios de cultivo deshidratados: AgarBD DifcoBD 214220
Neonatal endotelial microvascular dérmico, donantes agrupados (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio/Mezcla de nutrientes F-12 JamónSigma-AldrichD6434
EBM-2 Crecimiento de células endoteliales Medio basal-2Lonza190860
Homodímero de etidioSigma-Aldrich46043
Suero fetal de ternera (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Suero fetal de ternera despojado de carbón (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Microscopios estereoscópicos de fluorescencia Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050038
HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenolGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Células endoteliales de la vena umbilical humanaLonzaCC-2517
ImageJInstituto Nacional de Salud, EE. UU.Wayne Rasband
Versión: 1.52a (64 bits)
Ki67Cell Marque275R-16monoclonal AB, clon SP6
Microscopio estereoscópico de fluorescencia totalmente motorizado LeicaMicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Microtomo149MULTI0C1
Kit de suplemento de crecimiento sérico bajo (kit LSGS)GibcoS003K
MCF-7 células – línea celular de adenocarcinoma de mama humanaClínica de Ginecología, Hospital Universitario de ZúrichSobrevivido por el Dr. Andrè Fedier obtenido de ATCC
Nunclon Sphera Placa de 96 pocillosThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehído (PFA)Sigma-AldrichP6148
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1xGibco10010015
Pierce Kit de ensayo de proteínas BCAThermo Scientific23225
Tampón de lisis de proteínasSeñalización celular, Danvers, EE. UU9803
Kit de minipreparación de ARN rápidoZymo ResearchR1055
Tampón de lisis de ARNZymo ResearchR1060-1-100Contenido en el kit de minipreparación de ARN rápido
Centrífuga Rotina 46R TubosHettich
, 5 mLFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlín, DE
Lector de microplacas Tecan Infinite serie M200Tecan, Salzburgo, AU
Matraces de cultivo de tejidos 75TPP90076
Solución de tripsina-EDTASigma-AldrichT3924
plato de cultivo de tejidos 3 noble conejo rotatorio . de poliestireno de fondo redondo

Referencias

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