Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.
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Artículo de método
Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ
En este artículo
Resumen
Resumen
Este estudio describe un protocolo para la hibridación multiplex in situ (ISH) de los ganglios yugulares-nodosis de ratón, con un énfasis particular en la detección de la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los ganglios de yugular-nodosa fijados con formalina se procesaron con la tecnología RNAscope para detectar simultáneamente la expresión de dos GPCR representativos (receptores de colecistoquinina y grelina) en combinación con un gen marcador de nodosa (homeobox 2b, Phox2b) o neuronas aferentes yugulares (proteína de dedo de zinc de dominio PR 12, Prdm12). Los ganglios marcados fueron fotografiados utilizando microscopía confocal para determinar la distribución y los patrones de expresión de las transcripciones antes mencionadas. Brevemente, se encontró que las neuronas aferentes Phox2b expresan abundantemente el receptor de colecistoquinina (Cck1r) pero no el receptor de grelina (Ghsr). También se encontró que un pequeño subconjunto de neuronas aferentes Prdm12 expresan Ghsr y / o Cck1r. Se discuten posibles advertencias técnicas en el diseño, procesamiento e interpretación de multiplex ISH. El enfoque descrito en este artículo puede ayudar a los científicos a generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.
Introducción
Los cuerpos celulares de los aferentes vagales están contenidos en los ganglios yugular, petrosal y nodosis1,2,3. Sus axones viajan juntos a través de varias ramas del nervio vago a los territorios craneocervicical, torácico y abdominal4,5,6,7. Desde sus terminaciones viscerales, las aferencias vagales pueden responder a una amplia gama de estímulos fisiológicos y nocivos8,9,
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Protocolo
NOTA: Los ratones utilizados en este estudio eran machos de tipo salvaje en un fondo puro de C57BL / 6J. Se utilizaron un total de 4 ratones para multiplex ISH. Todos los ratones tenían aproximadamente 8 semanas de edad en el momento del sacrificio. También se utilizó un ratón macho (aproximadamente de un año de edad) para demostrar la fluorescencia endógena asociada con el envejecimiento. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas dentro de una instalación de barrera con acceso ad libitum a alimentos y agua. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UT Southwestern Medical Center revisó y aprobó los procedimientos que se describen a cont....
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Resultados
Si bien RNAScope se puede aplicar a animales de cualquier edad, sexo o antecedentes genéticos, es recomendable trabajar con adultos jóvenes (<3 meses de edad). Esto se debe a que los artefactos fluorescentes (por ejemplo, lipofuscina) son hallazgos comunes en las neuronas de animales mayores41. Los ganglios fijados con formalina de ratones más viejos a menudo contienen una fluorescencia endógena sorprendentemente intensa que puede confundirse fácilmente con una tinción genuina
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Discusión
La técnica de ISH fue inventada a finales de la década de 196042. Sin embargo, no es hasta mediados de la década de 1980 que se aplicó para la detección de ARNm en los sistemas nerviosos central y periférico43,44. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del sistema nervioso y los problemas recurrentes con los anticuerpos, la localización de una transcripción particular a nivel celular sigue siendo una herramienta invaluable. No obstante, los .......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financiado por la subvención de los NIH #5P01DK119130-02. Los autores desean agradecer la asistencia del UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (encabezado por el Dr. Phelps) y su personal (Abhijit Bugde y Marcel Mettlen), apoyado en parte por la Subvención nih #1S10OD021684-01, un recurso compartido del Centro Oncológico Harold C. Simmons, apoyado en parte por una subvención de apoyo del Centro Oncológico del NCI, P30 CA142543.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763-80 | |
| ° Congelador C | : PHCBI | , MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe software de fotografía y diseño | ||
| horno de horneado | , Thermo Scientific | Modelo:658 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cubierta de vidrio | Laboratorios de Investigación del Cerebro | 2460-1.5D | |
| Criostato | Leica | CM 3050 S | |
| F.S.T. | 11252-20 | ||
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L medio | montaje |
| Horno | de hibridación | ||
| Bolígrafo hidrofóbico | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Tijeras grandes | Henry Schein | 100-7561 | |
| Microtubos de centrífuga | VWR | 20170-333 | |
| Minibomba de caudal variable | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Biomarcador fluorescente |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Biomarcador fluorescente |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Biomarcador fluorescente |
| ProLong Gold Antidecoloración Medio de montaje de montaje | para células marcadas con fluorescencia | ||
| Kit de reactivos fluorescentes RNAscope Multiplex v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | kit multiplex |
| Sonda de ARNscope Ratón Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| Sonda de ARNscope Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| Sonda de ARNscope Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | ||
| Sonda de ARNscope de ratón Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| Sonda de ARNscope de ratón Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase solución descontaminante |
| Tijeras de disección pequeñas | |||
| Superfrost Plus | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medio | Sakura | 4583 | |
| Manual de instrucciones | ACD | 323100 USM | |
| Tijeras de resorte Vannas | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Software de imagen | Zeiss |
Referencias
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets withi....
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Reimpresiones y permisos
