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Artículo de método

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

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DOI:

10.3791/62945

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20 de septiembre de 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

En este artículo

Resumen

Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Resumen

Este estudio describe un protocolo para la hibridación multiplex in situ (ISH) de los ganglios yugulares-nodosis de ratón, con un énfasis particular en la detección de la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los ganglios de yugular-nodosa fijados con formalina se procesaron con la tecnología RNAscope para detectar simultáneamente la expresión de dos GPCR representativos (receptores de colecistoquinina y grelina) en combinación con un gen marcador de nodosa (homeobox 2b, Phox2b) o neuronas aferentes yugulares (proteína de dedo de zinc de dominio PR 12, Prdm12). Los ganglios marcados fueron fotografiados utilizando microscopía confocal para determinar la distribución y los patrones de expresión de las transcripciones antes mencionadas. Brevemente, se encontró que las neuronas aferentes Phox2b expresan abundantemente el receptor de colecistoquinina (Cck1r) pero no el receptor de grelina (Ghsr). También se encontró que un pequeño subconjunto de neuronas aferentes Prdm12 expresan Ghsr y / o Cck1r. Se discuten posibles advertencias técnicas en el diseño, procesamiento e interpretación de multiplex ISH. El enfoque descrito en este artículo puede ayudar a los científicos a generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Introducción

Los cuerpos celulares de los aferentes vagales están contenidos en los ganglios yugular, petrosal y nodosis1,2,3. Sus axones viajan juntos a través de varias ramas del nervio vago a los territorios craneocervicical, torácico y abdominal4,5,6,7. Desde sus terminaciones viscerales, las aferencias vagales pueden responder a una amplia gama de estímulos fisiológicos y nocivos8,9,10. Sin embargo, la distribución de las moléculas de señalización y los receptores involucrados en la detección vagagal sigue estando mal caracterizada. Esto se debe en parte a que los ganglios vagales, a pesar de su pequeño tamaño, expresan un amplio espectro de receptores, incluyendo un gran número de GPCR8,11,12,13. Además, las neuronas aferentes vagales son inherentemente heterogéneas y muestran perfiles moleculares distintos14. Para complicar el asunto, los ganglios yugular, petrosal y nodoso se unen en el ratón, formando así una sola masa ganglionar. Por último, en un subconjunto de animales, el ganglio de la nodosa está unido al ganglio cervical superior simpático15.

En el pasado, los investigadores han recurrido a la inmunohistoquímica para estudiar la composición neuroquímica de las neuronas aferentes vagales16,17,18. Si bien la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos validados es útil, los resultados de los estudios inmunohistoquímicos deben interpretarse con precaución. Por ejemplo, numerosos esfuerzos para identificar anticuerpos específicos contra los GPCR han fallado19,20,21,22,23,24,25,lo que lleva a los investigadores a concluir que la mayoría de los anticuerpos contra los GPCR no son confiables. Para eludir estos problemas, la PCR cuantitativa (qPCR) se ha utilizado ampliamente para evaluar la expresión génica en la masa ganglionar vagal de roedores26,27,28,29. Sin embargo, el examen de la expresión génica utilizando qPCR ocurre a costa de una pérdida de información espacial. En particular, no se puede predecir cuántas células o qué tipo de célula expresan un gen particular de interés (por ejemplo, nodosa vs. células yugulares). Los problemas recurrentes también incluyen la contaminación con tejidos adyacentes y la inclusión de longitudes variables del nervio vago, los ganglios cervicales superiores y yugulares durante la disección15. Como resultado de las dificultades anteriores, la controversia rodea la expresión y distribución de varios GPCR en neuronas aferentes vagales. Un ejemplo particularmente desconcertante se relaciona con el receptor de grelina (Ghsr). Mientras que algunos estudios han encontrado una expresión generalizada de este receptor en las neuronas aferentes vagales30,31,32,otros han encontrado que el ARNm de Ghsr es casi indetectable en el ganglio de la nodosis11,14. Por lo tanto, se justifica un mapeo detallado del ARNm de Ghsr en la masa ganglionar vagal.

La hibridación in situ (ISH) también se ha utilizado para evaluar patrones de expresión génica en la masa ganglionar vagal7,11,12,33,34,35. Debido a que las técnicas basadas en ARN siguen siendo más confiables y específicas que las técnicas basadas en anticuerpos en la mayoría de las circunstancias36,37, los estudios de ISH han demostrado ser valiosos para una mejor comprensión de la codificación neuroquímica de las neuronas aferentes vagales. Sin embargo, las técnicas tradicionales de ISH en sí mismas no están exentas de advertencias. La ISH radiactiva es sensible pero genera fondo y sigue siendo engorrosa38. La ISH no radiactiva es menos complicada pero también menos sensible38. En contraste, el método RNAscope ISH recientemente desarrollado es altamente sensible y genera un fondo mínimo39. El estudio actual aplicó RNAscope fluorescente multiplex a la detección de GPCR en neuronas aferentes vagales del ratón. Nos centramos en mapear la distribución de Ghsr y comparamos su distribución con la del receptor de colecistoquinina (Cck1r), otro GPCR bien conocido por expresarse en el ganglio de la nodosis34. Por último, los dos factores de transcripción, homeobox 2b (Phox2b) y proteína 12 del dedo de zinc del dominio PR (Prdm12), se utilizaron como marcadores selectivos para las neuronas aferentes de nodosa y yugular, respectivamente14. Sin visualizar Phox2b o Prdm12, sería difícil identificar las aferencias yugulares frente a las nodosas con certeza. Las posibles trampas técnicas también se discuten a lo largo del artículo.

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Protocolo

NOTA: Los ratones utilizados en este estudio eran machos de tipo salvaje en un fondo puro de C57BL / 6J. Se utilizaron un total de 4 ratones para multiplex ISH. Todos los ratones tenían aproximadamente 8 semanas de edad en el momento del sacrificio. También se utilizó un ratón macho (aproximadamente de un año de edad) para demostrar la fluorescencia endógena asociada con el envejecimiento. Los animales fueron alojados en jaulas ventiladas dentro de una instalación de barrera con acceso ad libitum a alimentos y agua. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UT Southwestern Medical Center revisó y aprobó los procedimientos que se describen a continuación. Los detalles sobre reactivos y herramientas se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.

1. Recogida de muestras

  1. El día del sacrificio, administrar una sobredosis de hidrato de cloral (500 mg/kg, i.p.) a los ratones. Perfundir los ratones profundamente anestesiados transcárdicamente utilizando una bomba peristáltica con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de 50 ml de formalina al 10% a temperatura ambiente.
    NOTA: Esto se hace en una campana extractora de humos para evitar la inhalación de formalina.
  2. Como los ganglios nodosos, petrosales y yugulares se fusionan para formar una sola masa ganglionar en elratón 15,recoja cuidadosamente toda la masa ganglionar vagal de cada lado (izquierda y derecha) con la ayuda de un endoscopio de disección y tijeras y fórceps de resorte fino (consulte la Tabla de materiales).
  3. Al decapitar al ratón con un par de tijeras grandes (consulte la Tabla de materiales),evite aplastar el tronco encefálico.
  4. Siguiendo un enfoque de disección descrito anteriormente en larata 40,retire los músculos esternohioideo y omohioideo lateral a la tráquea con pequeñas pinzas(Tabla de Materiales)para exponer el hueso occipital. Limpie toda la región del músculo, el tejido adiposo y el tejido conjuntivo hasta que la arteria carótida, el nervio vago, el nervio hipogloso y el foramen magnum sean visibles. Cortar todo el nervio hipogloso con pequeñas tijeras de resorte(Tabla de Materiales).
  5. Busque el ganglio de dosis como una masa translúcida cerca del foramen magnum15. Usando tijeras pequeñas(Tabla de Materiales),rompa cuidadosamente el hueso occipital para exponer aún más el ganglio yugular. Busque melanocitos negros en la superficie de la yugular como un hito visual.
  6. Corte las uniones nerviosas entre la masa ganglionar vagal y extraiga toda la masa ganglionar tirando suavemente del extremo periférico del nervio vago mientras corta simultáneamente el ganglio yugular hacia el tronco encefálico con pequeñas tijeras de resorte(Tabla de materiales).
  7. Elimine el tejido conjuntivo y la grasa que se adhieren al nervio vago y la masa ganglionar tanto como sea posible.
  8. Como es fácil perder un ganglio durante la transferencia de un tubo al otro, mantenga ~ 0,5 cm del nervio vago para facilitar el manejo y la localización de las muestras.
  9. Colocar los ganglios con la ayuda de fórceps finos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e incubar a 4 °C en foralina durante 24 h y con sacarosa al 30% durante otras 24 h.
  10. Coloque los ganglios dentro de una pequeña gota (~ 4 mm Ø) de temperatura óptima de corte (OCT) media en una pieza de papel de aluminio. A continuación, congele la muestra en un lecho de hielo seco.
  11. Cortar las muestras con un criostato a -20 °C en secciones de 14 μm de espesor y recoger en portaobjetos de microscopio de vidrio como 3 series a 42 μm de distancia.
    NOTA: Evite colocar secciones cerca de los bordes de la diapositiva. Para ahorrar reactivos, mantenga las secciones de tejido lo más apretadas posible, pero sin superponerse.
  12. Guarde las muestras en un congelador de -80 °C hasta que sea necesario para ISH durante al menos 6 meses.
    NOTA: Consulte la Figura 1 para solucionar problemas de fluorescencia endógena.

2. Pretratamiento e ISH

  1. Antes del día de los experimentos, la cristalería de laboratorio en autoclave se utilizará para ISH, incluidos los platos de tinción y el lavado de frascos de tampón.
    NOTA: Si bien trabajar en condiciones libres de RNasa no es crítico, use guantes en todo momento. Mantenga las botellas de solución de descontaminación RNasa(Tabla de Materiales)al alcance de la mano en caso de sospecha de contaminación.
  2. El primer día, lleve los toboganes a temperatura ambiente en un banco dedicado específicamente a ISH. Enjuague los portaobjetos en 1x PBS y hornéelos durante 30 minutos a 60 °C en un horno de cocción(Tabla de materiales).
  3. Post-fijar las diapositivas en formalina al 4% durante 15 min a 4 °C.
  4. Llevar los reactivos del kit multiplex(Tabla de Materiales)a temperatura ambiente.
  5. Deshidratar los portaobjetos en 50%, 70% y 100% etanol durante 5 min cada uno. Aplique la solución H2O2 a las muestras durante 10 minutos y luego enjuague en agua de doble destilación (ddH2O).
  6. Tratar las muestras con el reactivo de recuperación objetivo durante 5 min, enjuagar en ddH2O seguido de etanol al 100% y secar al aire. Usando una pluma hidrofóbica, cree una barrera alrededor de las muestras.
    NOTA: No aplique la barrera hidrofóbica demasiado cerca de las secciones de tejido.
  7. Aplicar proteasa durante 30 min a 40 °C en un horno de hibridación (Tabla de Materiales).
  8. Mientras tanto, precalencie las sondas a 40 °C y enfríelas a temperatura ambiente antes de usarlas. Incubar los portaobjetos con la combinación deseada de sondas objetivo (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; o Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) durante 2 h a 40 °C en un horno de hibridación.
  9. Incubar el tejido de control negativo con la sonda C1 diana de la dihidrodipicolinato reductasa (DapB) durante 2 h a 40 °C en un horno de hibridación.
  10. Enjuague las diapositivas en tampón de lavado y guárdelas durante la noche en citrato de sodio salino (SSC) 5x a temperatura ambiente. Para mayor comodidad, divida el experimento en dos días. Al día siguiente, enjuague las diapositivas con tampón de lavado e incube con los reactivos de amplificación que se enumeran a continuación (consulte el manual del usuario en tabla de materiales).
  11. Aplique AMP1 (30 min a 40 °C), AMP2 (30 min a 40 °C) y AMP 3 (15 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
  12. Disuelva cada colorante opal(Tabla de materiales)en dimetilsulfóxido y almacene las soluciones a 4 °C hasta que sea necesario.
  13. Para el canal 1, incubar los portaobjetos con HRP-C1 (15 min a 40 °C) y Opal 520 (color verde; dilución 1/1.500; 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
  14. Para el canal 2, incubar los portaobjetos con HRP-C2 (15 min a 40 °C) y Opal 570 (color amarillo; dilución 1/1.500; durante 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
  15. Para el canal 3, incubar los portaobjetos con HRP-C3 (15 min a 40 °C) y Opal 690 (color rojo lejano; dilución 1/1.500; durante 30 min a 40 °C). Enjuague en tampón de lavado entre cada paso.
  16. Lave las diapositivas y expóngalas a 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 30 s.
  17. Aplique inmediatamente el medio de montaje en cada diapositiva y coloque una cubierta sobre la sección de tejido.
  18. Mantenga los tejidos horizontales en un soporte deslizante a 4 °C hasta la toma de imágenes.

3. Microscopía y análisis de datos

NOTA: Los datos multiplex ISH se pueden obtener imágenes con una amplia gama de instrumentos con los filtros apropiados. Sin embargo, un método de imagen preferido es la microscopía confocal con objetivos de 20x y 63x (aceite); consulte la discusión para conocer las razones. Consulte la Figura 2 para determinar la relación señal-ruido óptima.

  1. Utilice un microscopio confocal equipado con líneas láser de 488, 561 y 633 nm. Utilice los siguientes parámetros de adquisición (consulte la Tabla 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, rango de detección 668-696 nm, potencia 2.0, ganancia 724); Opal 570 (láser DPSS 561 nm, rango de detección 579-627 nm,
  2. Para mejorar la calidad de las imágenes, adquiera con una línea promedio de 4 y un tamaño de píxel de al menos 1024 x 1024.
    NOTA: Los parámetros anteriores solo se proporcionan como ejemplo, y se recomiendan modificaciones dependiendo de un instrumento, aumento (20x o 63x), niveles de expresión y niveles endógenos de fluorescencia para cualquier tejido dado.
  3. Una vez satisfecho con los parámetros de adquisición, recopile imágenes utilizando la misma configuración. Atribuye colores falsos a cada canal para facilitar la visualización.
    NOTA: Por ejemplo, rojo (Phox2b o Prdm12), cian (Cck1r), amarillo (Ghsr) y gris (DAPI).
  4. Realice el conteo de células utilizando las imágenes digitales identificando el contorno de los perfiles positivos de RNAscope con un núcleo ligeramente teñido con DAPI. Calcular el porcentaje de perfiles RNAscope-positivos expresando cada transcripción [Figura 3A-C].
  5. Para mejorar el rigor y la precisión de las estimaciones, cuente al menos 2.000 perfiles neuronales de al menos 4 animales diferentes. Realice el conteo de los ganglios izquierdo y derecho por separado.
  6. Introduzca los datos en un gráfico circular con el número total de perfiles contados.
  7. Utilice un software de imágenes para adquirir imágenes y unir imágenes 20x. Utilice ImageJ-Fiji y otro software de fotografía y diseño para generar las placas finales. Aplique ajustes de contraste y ligereza de manera uniforme a todas las imágenes.

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Resultados

Si bien RNAScope se puede aplicar a animales de cualquier edad, sexo o antecedentes genéticos, es recomendable trabajar con adultos jóvenes (<3 meses de edad). Esto se debe a que los artefactos fluorescentes (por ejemplo, lipofuscina) son hallazgos comunes en las neuronas de animales mayores41. Los ganglios fijados con formalina de ratones más viejos a menudo contienen una fluorescencia endógena sorprendentemente intensa que puede confundirse fácilmente con una tinción genuina

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Discusión

La técnica de ISH fue inventada a finales de la década de 196042. Sin embargo, no es hasta mediados de la década de 1980 que se aplicó para la detección de ARNm en los sistemas nerviosos central y periférico43,44. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del sistema nervioso y los problemas recurrentes con los anticuerpos, la localización de una transcripción particular a nivel celular sigue siendo una herramienta invaluable. No obstante, los ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financiado por la subvención de los NIH #5P01DK119130-02. Los autores desean agradecer la asistencia del UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (encabezado por el Dr. Phelps) y su personal (Abhijit Bugde y Marcel Mettlen), apoyado en parte por la Subvención nih #1S10OD021684-01, un recurso compartido del Centro Oncológico Harold C. Simmons, apoyado en parte por una subvención de apoyo del Centro Oncológico del NCI, P30 CA142543.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x PBSFisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° Congelador C: PHCBI, MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobe software de fotografía y diseño
horno de horneado, Thermo ScientificModelo:658
Microscopio confocalZeissLSM880 Airyscan
Cubierta de vidrioLaboratorios de Investigación del Cerebro2460-1.5D
CriostatoLeicaCM 3050 S
F.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897L mediomontaje
Hornode hibridación
Bolígrafo hidrofóbicoVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Tijeras grandesHenry Schein100-7561
Microtubos de centrífugaVWR20170-333
Minibomba de caudal variableFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTBiomarcador fluorescente
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTBiomarcador fluorescente
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTBiomarcador fluorescente
ProLong Gold Antidecoloración Medio de montaje de montajepara células marcadas con fluorescencia
Kit de reactivos fluorescentes RNAscope Multiplex v2ACD /Bio-Techne323100kit multiplex
Sonda de ARNscope Ratón Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
Sonda de ARNscope Mouse DapBACD /Bio-Techne310043
Sonda de ARNscope Mouse GhsrACD /Bio-Techne
Sonda de ARNscope de ratón Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
Sonda de ARNscope de ratón Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase solución descontaminante
Tijeras de disección pequeñas
Superfrost PlusFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT medioSakura4583
Manual de instruccionesACD323100 USM
Tijeras de resorte VannasRobozRS 5620
ZEN Software de imagenZeiss
, , Dumont #5 Pinzas de HybEZ horno 426141 portaobjetos Millipore Sigma Z265977

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Receptores acoplados a prote nas GISH multiplexganglios nodosos yugularestecnolog a RNAscopemicroscop a confocalreceptor de colecistoquininareceptor de ghrelinamarcador Phox2b
Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ
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