Los reguladores de las funciones de los melanocitos gobiernan las diferencias visibles en el resultado de la pigmentación. Descifrar la función molecular del gen de pigmentación candidato plantea un desafío. Aquí, demostramos el uso de un sistema modelo de pez cebra para identificar candidatos y clasificarlos en reguladores del contenido de melanina y el número de melanocitos.
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Artículo de método
Enfoque genético inverso para identificar reguladores de pigmentación usando pez cebra
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Resumen
Resumen
Los melanocitos son células especializadas derivadas de la cresta neural presentes en la piel epidérmica. Estas células sintetizan pigmento de melanina que protege el genoma de las radiaciones ultravioletas dañinas. Las perturbaciones en el funcionamiento de los melanocitos conducen a trastornos pigmentarios como piebaldismo, albinismo, vitiligo, melasma y melanoma. El pez cebra es un excelente sistema modelo para comprender las funciones de los melanocitos. La presencia de melanocitos pigmentados conspicuos, la facilidad de manipulación genética y la disponibilidad de líneas fluorescentes transgénicas facilitan el estudio de la pigmentación. Este estudio emplea el uso de líneas de pez cebra transgénicas y de tipo salvaje que impulsan la expresión de proteínas fluorescentes verdes (GFP) bajo promotores mitfa y tyrp1 que marcan varias etapas de los melanocitos.
El silenciamiento basado en morfolino de genes candidatos se logra para evaluar el resultado fenotípico en la pigmentación larvaria y es aplicable a la detección de reguladores de pigmentación. Este protocolo demuestra el método desde la microinyección hasta la disección de fenotipos basada en imágenes y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando dos genes candidatos, anhidrasa carbónica 14 (Ca14) y una variante de histona (H2afv), para evaluar exhaustivamente el resultado de la pigmentación. Además, este protocolo demuestra la segregación de genes candidatos en especificadores y diferenciadores de melanocitos que alteran selectivamente el número de melanocitos y el contenido de melanina por célula, respectivamente.
Introducción
Si bien el uso de melanina para la fotoprotección ha evolucionado varias veces en todo el reino animal, los vertebrados aparentemente han perfeccionado el proceso. Las células dedicadas productoras de pigmento con una maquinaria elaborada para sintetizar y contener melanina se conservan desde los peces hasta los humanos1. Sin embargo, el resultado de la pigmentación es dramáticamente variado, variando en el color a la recipiencia y se presenta como patrones vívidos en los tegumentos, la piel y el cabello2. A pesar de la diversidad, el repertorio de genes implicados en la respuesta de pigmentación se conserva sorprendente....
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Protocolo
Los experimentos con pez cebra se realizaron en estricta conformidad con la aprobación ética animal institucional (AICE) del CSIR-Instituto de Genómica y Biología Integrativa (IGIB), India (Propuesta n.º 45a). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
1. Inyección de morfolino en embriones de pez cebra
- Usando un extractor de agujas estándar, dibuje pipetas muy afiladas y de punta cerrada.
- Cargue la solución que contiene morfolino en las micropipetas utilizando una punta de microcargador e insértela en el aparato microinyector. Apriete el tornillo correctamente para bl....
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Resultados
El flujo de trabajo descrito en la Figura 1 se utilizó para realizar perturbaciones genéticas basadas en morfolinos en la etapa unicelular del pez cebra. El análisis de pigmentación se realizó utilizando varios métodos, como se menciona a continuación. Para ilustrar los resultados representativos, se inyectaron volúmenes estandarizados de morfolino antisentido dirigidos a los genes h2afv y ca14 en la etapa de yema o de una célula del embrión de pez cebra. El fenotipado inic.......
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Discusión
El fenotipo de pigmentación a menudo se manifiesta como alteraciones en el contenido de melanina o en el número de melanocitos que contienen pigmento. El método descrito en este documento permite la disección de esta dicotomía y permite una evaluación cualitativa y cuantitativa del contenido de melanina y del número de melanóforos por embrión, independientemente del contenido de melanina. La alta fecundidad del pez cebra, la naturaleza visible de los melanocitos pigmentados y la falta de transferencia de melanosomas perm.......
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Divulgaciones
Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo financiero del Consejo de Investigación Científica e Industrial vide proyecto MLP2008 y del Departamento de Ciencia y Tecnología para el proyecto GAP165 para apoyar el trabajo presentado en este manuscrito. Agradecemos a Jeyashri Rengaraju y Chetan Mishra por su ayuda con los experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Microtubos | Axygen | MCT-150-A | Para la preparación de la solución de MO |
| 2 mL Microtubos | Axygen | MCT-200-C | Para las etapas de lavado en el protocolo FACS |
| Agarosa | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | Para microinyección |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | Para la clasificación de células |
| Tubo capilar | Drummond | 1-000-0010 | |
| Filtro de células | Corning Corning CLS431751 | Para hacer suspensión de una sola célula | |
| DMEM Medios de alta glucosa | Sigma-Aldrich | D5648 | Protocolo FACS |
| 3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (tricaína) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | para inmovilizar ZF para la obtención de imágenes |
| Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | Para tampón de lisis en frío |
| Tubos FACS | BD-Biosciences | 342065 | Protocolo FACS |
| Suero fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 10270 | Protocolo FACS |
| Prisma Graphpad Software | Graphstats Technologies | NA | Para la representación de datos |
| ImageJ Software | Instituto Nacional de Salud | NA | Para el análisis |
| Jeringas de insulina (1 mL) | DispoVan | NA | Para la descorionación manual |
| Melanina Sintética | Sigma-Aldrich | M8631 | Para el ensayo del contenido de melanina |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | M7027-250G | para inmovilizar ZF para la obtención de imágenes Puntas |
| microcargador | Eppendorf | 5242956003 | Para microinyección |
| Morfolino | Gene-tools | NA | Para experimentos de derribo |
| N-Feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | para inhibir la formación de melanina |
| Extractor de agujas | Sutter Instrument | P-97 | Para microinyección |
| Nunc 15 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos | Thermo Fisher Scientific | 339650 | Protocolo FACS |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | Para placas embrionarias |
| fluoruro de fenilmetilsulfonilo | Sigma-Aldrich | 10837091001 | Para tampón de lisis en frío |
| Tampón de fosfato salino (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | Para el lavado de células |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | Para la descorionación |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Sigma-Aldrich | P8340 | Para tampón de lisis en frío |
| Vaina fluido | BD FACSFlowTM | 342003 | Protocolo FACS |
| Fosfato sódico | Merck | 7558-79-4 | Tampón de lisis en frío |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Para tampón de lisis en frío |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | Para tripsinización |
Referencias
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H.
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Reimpresiones y permisos
