Mejorar el contenido tumoral a través de la macrodisección tumoral

Los tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE), recolectados como parte del proceso de diagnóstico clínico normal y retenidos en repositorios de tejidos clínicos, representan un vasto recurso para la investigación en humanos, incluida la investigación del cáncer¹. A medida que nuestra comprensión de la enfermedad humana se profundiza, se está volviendo cada vez más claro que las enfermedades, que anteriormente se pensaba que eran entidades únicas basadas en características morfológicas e inmunofenotípicas, de hecho se componen de distintos subtipos moleculares que requieren ensayos de subtipificación molecular. En consecuencia, los ensayos genómicos de alta sensibilidad capaces de discernir estos subtipos se han vuelto cada vez más importantes². Aunque los tejidos FFPE son conocidos por ser poco compatibles con las técnicas genómicas debido a problemas relacionados con la fijación, a medida que la tecnología y los protocolos evolucionan, estas técnicas son cada vez más compatibles con este formato de tejido clínicamente ubicuo ^3,4,5. Sin embargo, los tejidos FFPE son a menudo mezclas de materiales tisulares tumorales y no tumorales, donde la presencia de material no tumoral es a menudo no deseada y puede, si está presente en una proporción alta, socavar e impactar significativamente los resultados de los análisis genómicos⁶. De hecho, se utiliza con frecuencia un contenido tumoral mínimo del 60% para tales análisis, donde se pueden excluir los tejidos que no alcanzan este umbral, a pesar de cumplir con los criterios del estudio⁷. Esto puede ser particularmente problemático en entornos de enfermedades raras, donde los tejidos de los pacientes son preciosos y difíciles de recolectar en grandes cantidades.

La macrodisección es un método que minimiza los efectos del bajo contenido tumoral al reducir la cantidad de tejido normal³. La eliminación de dicho material no tumoral confuso antes de la extracción de ácido nucleico puede aumentar significativamente el contenido porcentual del tumor y, por lo tanto, la pureza tumoral de los ácidos nucleicos extraídos. La resección tisular se basa críticamente en la revisión patológica de expertos, en la que la región del tumor se identifica y se rodea en una sección de tejido teñido de hematoxilina y eosina (H&E) recién generada por un patólogo certificado por la junta⁸. El H&E con círculos se utiliza para guiar la eliminación y la recolección de tejidos no deseados y objetivo, respectivamente. Este protocolo describe los pasos de la macrodisección desde la revisión patológica hasta la recolección de tejidos como se realiza en el Laboratorio Técnico Básico del Recurso de Muestras de SIDA y Cáncer (ACSR) en la Clínica Mayo.

Todas las muestras se recolectaron y utilizaron de conformidad con los protocolos IRB aprobados de Mayo Clinic (PR16-000507 y PR2207-02).

1. Preparación de la muestra

1. Encienda el baño de agua de flotación de tejidos. Ajuste la temperatura a 39 °C y deje que el agua llegue a la temperatura. Remoje los palos de recolección de madera en el baño de agua.
2. Identifique y recupere los bloques de tejido FFPE que se van a seccionar.
3. Portaobjetos de microscopio pre-etiqueta utilizando un marcador permanente de grado histológico que puede soportar lavados con solvente.
4. Utilice un microtomo para seccionar los bloques FFPE. Cortar al menos 2 secciones de cara completa a un espesor de 4-5 μm por sección para cada bloque (Figura 1A).
5. Transfiera la cinta recién cortada de las secciones de tejido al baño de flotación de tejido precalentado para el montaje de la diapositiva (Figura 1B, C).
   NOTA: El agua tibia ayuda a "planchar" las arrugas en las secciones (Figura 1C).
6. Al manejar cada sección secuencialmente, use fórceps para separar una sola sección de la cinta de opciones (Figura 1D).
7. Recoja la sección única en un portaobjetos de microscopio preetiquetado.
   1. Sumerja el portaobjetos del microscopio en un ángulo debajo de la sección, colocando el portaobjetos de tal manera que el borde de la sección de tejido toque el portaobjetos (Figura 1E).
   2. Una vez en contacto con la sección de tejido, saque el portaobjetos del baño de flotación lentamente para permitir que la sección de tejido se enderece al ras contra el portaobjetos a medida que emerge del agua (Figura 1F).
8. Monte 1 sección de tejido por diapositiva y repita hasta que se hayan recogido todas las secciones.
9. Permita que las secciones de tejido montadas en deslizamiento se sequen completamente a temperatura ambiente (RT).

2. Revisión patológica

1. Realice tinciones de H&E en una sección de tejido representativa para cada bloque⁹.
2. Envíe el H&Es recién teñido para su revisión patológica por un patólogo certificado por la junta.
   NOTA: Durante la revisión, el patólogo determina y registra el porcentaje de contenido tumoral en cada tejido y rodea el área del tumor en cada diapositiva de H&E (consulte la Figura 2 y la Figura 3, Fila 1). La Tabla 1 describe el porcentaje de contenido tumoral por celularidad determinado durante la revisión patológica del H&Es para las muestras A-E que se muestran en la Figura 3, Fila 1. Las secciones con <60% de contenido tumoral requieren macrodisección⁷. El número de secciones necesarias para la extracción de ácidos nucleicos depende del tamaño del área tumoral en círculo. Si se cortaron secciones insuficientes en la sección 1 del protocolo y es posible realizar más cortes, es posible que sea necesario cortar secciones adicionales.

3. Desparafinación

1. En una campana extractora, rellene previamente dos platos de tinción de vidrio con d-limoneno de grado histológico sin diluir o un disolvente a base de d-limoneno y 1 plato de tinción de vidrio con etanol de grado molecular sin diluir a prueba de 200.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto del d-limoneno con la piel y los ojos, evite la inhalación de vapor o niebla y manténgase alejado de las fuentes de ignición. Mantenga el etanol alejado del calor, las chispas y las llamas abiertas, evite derrames y contacto con la piel o los ojos, ventile bien y evite respirar vapores.
   NOTA: Llene los platos lo suficiente como para sumergir los toboganes en estanterías (Figura 4A); Se requieren 250 ml para llenar los platos de tinción de 20 diapositivas que se muestran. Reemplace los lavados de d-limoneno y etanol después de cada 40 diapositivas. El D-limoneno (C₁₀H₁₆) es un agente desparafinante alternativo, igualmente efectivo y menos tóxico al xileno que se está volviendo más común en las metodologías histológicas y produce ácido nucleico de buena calidad después de la extracción 10,11,12,13,14. Aunque este protocolo puede realizarse utilizando alternativas más biopáticas¹⁵, aún no se han determinado sus efectos, si los hay, sobre la calidad de los ácidos nucleicos extraídos.
2. Rack de los deslizadores montados en tejido FFPE sin teñir en los bastidores deslizantes coplin de vidrio (Figura 4A, recuadro).
3. Sumergir los toboganes trasiegados en d-Limonene lavar 1 durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s.
   NOTA: Para minimizar el arrastre entre lavados, al retirar el estante de toboganes de un lavado, permita que el estante escurra brevemente antes de frotar suavemente el fondo del estante en papel de seda para eliminar el exceso de lavado.
4. Sumergir los portaobjetos en racked en D-Limonene wash 2 sin diluir durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. Retire, escurra y vuelva a frotar la rejilla.
5. Sumergir los portaobjetos en el lavado de etanol durante 2 min; agitar suavemente durante los primeros 20 s. Retire la rejilla y colóquela sobre un tejido absorbente para drenar. Deje que los toboganes se sequen al aire durante al menos 10 minutos, pero no más de 2 h.

3. Macrodisección

1. En el banco, llene previamente un frasco de vidrio Coplin con 50 ml de glicerol al 3% en agua libre de DNasa / RNasa
   NOTA: Reemplace el lavado de glicerol después de cada 40 diapositivas.
2. Pre-etiquetar y precargar microtubos de 1,5 ml con 160 μL de tampón de digestión tisular por microtubo.
   NOTA: Las extracciones de ácido nucleico realizadas después de la macrodisección utilizaron un kit de extracción de ADN/ARN FFPE (Tabla de Materiales). Por lo tanto, el tampón de digestión tisular utilizado en este protocolo comprendía 10 μL de proteinasa K y 150 μL de tampón PKD.
3. Rastree las marcas patológicas en el H&E en la parte posterior de los portaobjetos de tejido desparafinado.
   NOTA: En comparación con los tejidos no desparafinados (Figura 3, Fila 2 y Figura 4B), los tejidos desparafinados son blancos y altamente visibles (Figura 3, Fila 3 y Figura 4C). Es esta mayor visibilidad y discernibilidad de las características del tejido desparafinado lo que permite la macrodisección. Coloque el H&E boca abajo en el banco y coloque la parte delantera del tobogán desparafinado contra la parte posterior del patólogo emparejado revisado H&E (Figura 4D). Alinear el tejido desparafinado con el tejido H&E (Figura 4E). El rastreo de las marcas del patólogo es un paso crítico en el proceso de macrodisección, y se debe tener cuidado de reproducir estas marcas con la mayor precisión posible. Esto puede ser particularmente difícil para tejidos pequeños y/o desconectados, como las muestras B, D y E (Figura 3, Figura 4E y Figura 4E recuadro i). Para ayudar al rastreo, se debe usar un marcador de tinta fina o ultrafina (Figura 4E, recuadro ii) para rastrear las marcas dibujadas por el patólogo. Las toallitas de etanol pueden ser útiles para eliminar errores y permitir el rastreo si es necesario.
4. Gire el tejido deslizante ahora marcado desparafinado boca arriba y trace la línea del marcador con la esquina de una cuchilla de afeitar limpia para cortar previamente los bordes del área del tumor.
5. Manejando cada diapositiva secuencialmente, sumerja las diapositivas desparafinadas en la solución de glicerol al 3%. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido antes de retirar el portaobjetos lentamente (Figura 4F).
   NOTA: El propósito de la inmersión de glicerol es humedecer el tejido para ayudar a la recolección de tejido, pero también para reducir la acumulación de carga estática que puede causar repulsión entre el tejido y el microtubo de plástico en el que se debe colocar el tejido recolectado.
6. Limpie suavemente la parte posterior de la diapositiva con un pañuelo desechable para eliminar el exceso de solución de glicerol y coloque la diapositiva en el banco, limpiada de lado hacia abajo. Deje que los tejidos se aireen brevemente durante 1-2 min.
   NOTA: La transferencia del exceso de glicerol en el proceso de extracción puede afectar negativamente el rendimiento y la calidad de las extracciones de ácidos nucleicos. Los tejidos deben estar ligeramente húmedos pero no visiblemente húmedos cuando se recogen.
7. Dependiendo de dónde se encuentre el área de interés del tumor en el portaobjetos, use el borde plano de la hoja de afeitar para (a) recolectar directamente el tejido tumoral, usando la maquinilla de afeitar para raspar / recolectar el tejido de interés del portaobjetos, o (b) extraer y desechar el tejido no tumoral primero antes de recolectar el tejido tumoral de interés (Figura 3).
   NOTA: El tejido recolectado tiende a acumularse o enrollarse en la parte inferior de la cuchilla (Figura 4G)
8. Use un palo de madera para extraer el tejido recolectado de la cuchilla (Figura 4H y recuadro) y transfiéralo al microtubo preetiquetado y precargado apropiado (Figura 4I).
   NOTA: El tampón de digestión sirve para "tirar" del tejido de la púa de madera hacia el líquido.
9. Proceder a la extracción de ácido nucleico.
   NOTA: Las extracciones de ácido nucleico se completaron utilizando el kit de extracción de ADN / ARN FFPE según las instrucciones del fabricante, y los ácidos nucleicos resultantes se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro UV-vis. El ARN resultante se ejecutó en el ensayo DLBCL90 basado en perfiles de expresión génica digital¹⁶.

Se seccionaron un total de 5 bloques de tejido FFPE de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), y las secciones resultantes se macrodiseccionaron o no antes de la extracción de ácido nucleico. El ARN extraído se ejecutó en el ensayo DLBCL9016. Las muestras macrodiseccionadas se ejecutaron dos veces, una vez utilizando 5 μL de concentración de stock de ARN pero no más de 300 ng de entrada total de ARN y una vez usando 5 μL de stock de ARN diluido para que coincida con las entradas de ARN de sus respectivas contrapartes no diseccionadas. Los resultados de DLBCL90 se describen en la Tabla 2.

DLBCL está compuesto por 3 subtipos distintos de células de origen (COO) con diferente capacidad de respuesta terapéutica, a saber, GCB, ABC y un grupo intermedio conocido como no clasificado o UNC17,18. Las translocaciones que involucran MYC, BCL2 y/o BCL6 solo o en combinación (doble o triple golpe) también se observan con frecuencia en DLBCL, particularmente en el subtipoGCB 19. El ensayo DLBCL90 es una expansión de su predecesor, el ensayo clínico Lymph2Cx, y por lo tanto es capaz de determinar el subtipo DLBCL COO, pero se desarrolló principalmente para identificar muestras que albergan translocaciones de doble golpe (DH) que involucran BCL2 utilizando la expresión génica digital como alternativa a la hibridación fluorescente in situ (FISH)16,20. Los resultados de la Tabla 2 muestran que la macrodisección cambió el COO o el estado de DHITsig requiere el 60% (3/5) de las muestras examinadas.

La macrodisección de la muestra A no tuvo ningún efecto en la llamada de COO, pero cambió la llamada de DHITsig de NEG a UNCLASS, y este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada y con puntuaciones de probabilidad similares (0,224, 0,254). Por el contrario, la macrodisección de la muestra C no tuvo ningún efecto en la llamada de DHITsig, pero cambió la llamada de COO de GCB a UNC. Una vez más, este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada. Sin embargo, en 0.117, la probabilidad de llamada de COO estaba más cerca del umbral de llamada de 0.1 para la muestra macrodiseccionada con entrada de ARN reducida. Al igual que la muestra A, la macrodisección de la muestra E no tuvo ningún efecto en la llamada de COO, pero cambió la llamada de DHITsig. Sin embargo, para la muestra E, la llamada cambió de UNCLASS a NEG y lo hizo independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodiseccionada con llamadas de probabilidad razonablemente similares (0.849, 0.833). En particular, este cambio de llamada a DHITsig NEG tiene sentido biológico dado que la muestra E se encontró a ABC-DLBCL, y se ha informado que las translocaciones de doble golpe que involucran BCL2 se observan exclusivamente en GCB-DLBCL19.

Figura 1: Generación de secciones de tejido montadas en diapositivas utilizando un microtomo. (A) Bloque de tejido FFPE sostenido en su lugar por el mandril del microtomo y cortado para producir una cinta de secciones secuenciales de tejido FFPE. (B) Usando palos de madera pre-empapados, la cinta se recoge del microtomo y se transfiere a un baño de agua tibia. (C) El calor del agua ayuda a planchar los pliegues en la cinta de tejido. (D) Las secciones individuales de tejido FFPE se eliminan de la cinta de tejido colocando pinzas cerradas en la unión de dos secciones y abriendo suavemente las pinzas, lo que separa las secciones entre sí. (E) Las secciones se recogen del agua sumergiendo un portaobjetos de vidrio en ángulo y moviendo suavemente el lado hacia la sección de tejido hasta que el borde de la sección toque el portaobjetos de vidrio. (F) Una vez que la diapositiva y la sección estén tocando, retire lentamente la diapositiva del agua, permitiendo que la sección de tejido caiga al ras contra la diapositiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Revisión patológica e histológica de una sección teñida de hematoxilina y eosina (H&E). (A, B) La sección de tejido de H&E es sometida a revisión microscópica por un patólogo certificado por la junta. (C,D) Una vez que el patólogo ha visto todo el tejido y ha encontrado que no es 100% tejido tumoral, el patólogo utilizará un marcador para rodear el área tumoral del tejido. (E,F) Mantener el H&E marcado contra el bloque de tejido FFPE original muestra que no todo el tejido es material tumoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Muestras de tejido. Esta imagen muestra los H&Es patológicamente revisados y marcados con tumores (Fila 1), secciones de tejido FFPE montadas en diapositivas no procesadas (Fila 2), secciones de tejido FFPE desparafinadas montadas en diapositivas (Fila 3), secciones de tejido FFPE desparafinadas montadas en diapositivas con marcas de patología trazadas en la parte posterior de la diapositiva (Fila 4), secciones de tejido FFPE desparafinadas y macrodiseccionadas montadas en diapositivas (Fila 5) para las 5 muestras (A-E) utilizadas para demostrar este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Desparafinación y macrodisección de secciones de tejido FFPE: (A) En una campana de humos, los tejidos FFPE montados en un estante deslizante se lavan en dos lavados d-limoneno y un lavado de etanol. (B,C) Después del lavado, se ha eliminado toda la parafina y solo queda el tejido en el portaobjetos, que ahora es blanco y altamente visible en comparación con su contraparte prelavada. (D) La sección de tejido desparafinada montada en un portaobjetos se coloca boca abajo en la parte posterior de su marca H&E. (E) Las marcas del área tumoral en el H&E se trazan en la parte posterior del portaobjetos desparafinado utilizando un marcador permanente fino o ultrafino (F) La sección de tejido marcada con deslizamiento desparafinado se sumerge en un lavado de glicerol para humedecer la sección de tejido para la recolección. El portaobjetos se retira lentamente del glicerol, y la parte posterior del portaobjetos se limpia con un pañuelo desechable para eliminar el exceso de glicerol antes de colocar el tejido del portaobjetos boca arriba en el banco. (G) Usando el lado plano de una cuchilla de afeitar limpia, el tejido se macrodisecciona y el tejido no deseado fuera de las marcas del patólogo se descarta antes de recolectar el tejido de interés, que se reúne a lo largo del borde de la cuchilla. (H) Se utiliza un palo de madera para extraer el tejido recogido del borde de la cuchilla. (I) El tejido se transfiere a un tampón de digestión de tejido precargado de microtubos preetiquetado y está listo para la extracción de ácido nucleico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Datos de revisión patológica. La tabla muestra (a) el porcentaje de tumor viable en toda la sección de tejido por área, (b) el porcentaje de tumor viable en el área rodeada / marcada por el patólogo durante la revisión por celularidad, (c) la celularidad tumoral global estimada de todo el tejido (a x b), (d) el aumento estimado del pliegue en la celularidad tumoral logrado con macrodisección, e y f) el número de secciones de tejido ffPE no teñidas de 5 μm sin teñir extraídas y las concentraciones de ARN resultantes para muestras no macrodiseccionadas y macrodiseccionadas compatibles. % Otro se refiere a todos los demás tejidos presentes en una muestra dada que no es tejido tumoral y puede incluir tejido conectivo, fibroblastos estromales, vasos sanguíneos y otros elementos estromales inherentes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Resultados del ensayo de expresión génica digital DLBCL90. Cinco muestras (A-E) no fueron macrodiseccionadas o macrodiseccionadas antes de que se realizaran extracciones con ácido nucleico. El ARN resultante se ejecutó en el ensayo DLBCL90, para el cual el volumen máximo de entrada de ARN es de 5 μL. Las muestras no macrodiseccionadas se ejecutaron utilizando 5 μL de ARN madre. Cada muestra macrodiseccionada se ejecutó dos veces utilizando (a) 5 μL de ARN de stock a menos que fueran posibles alícuotas de 60 ng/μL y (b) 5 μL de ARN stock diluido para igualar las concentraciones/entrada de sus contrapartes no macrodiseccionadas. El sufijo _M denota que esa muestra fue macrodiseccionada. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores no tienen nada que revelar.