Plaquing es un método de rutina utilizado para cuantificar virus vivos en una población. Aunque el plaquing se enseña con frecuencia en varios currículos de microbiología con bacterias y bacteriófagos, el plaquing de virus de mamíferos es más complejo y requiere más tiempo. Este protocolo describe los procedimientos que funcionan de manera confiable para el trabajo regular con virus del herpes simple.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Plaquing de los virus del herpes simple
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Existen numerosos protocolos publicados para detectar virus, incluidas referencias dentro de la literatura primaria para la metodología. Sin embargo, la detección de virus puede ser difícil de realizar, lo que requiere centrarse en sus especificaciones y refinamiento. Es un método increíblemente desafiante para que los nuevos estudiantes lo dominen, principalmente porque requiere una atención meticulosa a los detalles más minuciosos. Esta demostración de plagar los virus del herpes simple debería ayudar a aquellos que han luchado con la visualización del método, especialmente sus matices, a lo largo de los años. Si bien este manuscrito se basa en los mismos principios de la metodología estándar de plaquing, difiere en que contiene una descripción detallada de (1) la mejor manera de manejar las células huésped para evitar interrupciones durante el proceso, (2) un medio viscoso más útil que la agarosa para limitar la difusión de viriones, y (3) un procedimiento simple de fijación y tinción que produce resultados reproducibles de manera confiable. Además, el video que lo acompaña ayuda a demostrar las distinciones más finas en el proceso, que con frecuencia se pasan por alto cuando se instruye a otros sobre la realización de ensayos de placa.
Introducción
Los inicios de los ensayos de placa viral se remontan a los primeros descubrimientos de virus en la década de 18901. El virus del mosaico del tabaco se aisló por primera vez y se transmitió a las hojas de tabaco, donde las manchas individuales de infección pudieron reconocerse y cuantificarse como originarias de una sola entidad de virus viva2, más tarde identificada como un virión2. Estudios seminales posteriores con bacterias y bacteriófagos perfeccionaron las técnicas utilizadas para placar estos virus, incluidas las bacterias en la fase media del crecimiento, la dilución en serie de muestras d....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos con las células Vero y los herpesvirus vivos han sido aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Towson. En la Figura 1 se representa un esquema generalizado de estos procedimientos.
1. Siembra de las células Vero
- El día antes de iniciar el ensayo de placa, tripsinize las células Vero y resuspóndelas en el Medio Modified Eagles (DMEM) de Dulbecco regular y complemente según la metodología estándar de cultivo celular19. Resuspend las células tripsinizadas en 10 mL de DMEM por matraz T-75 de las células Ver....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Tabla 1 muestra un experimento que tiene resultados óptimos. Todas las diluciones de 10 veces siguen a una disminución de aproximadamente 10 veces en los recuentos de placa. Este tipo de datos también se pueden ver en la Figura 2, un ensayo de placa real donde el número contable de placas cayó en el rango de 10-4 para las tres réplicas. Lo mismo se puede ver en la Figura 3, la fila superior, donde el número contable de placas estab.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Si bien los ensayos de placa son casi tan antiguos como el propio cultivo celular de mamíferos, parece que cada laboratorio tiene su propio conjunto de protocolos para ejecutar este ensayo básico5,6,10,11,12,13,14,15,16,20
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a innumerables estudiantes en nuestros laboratorios (PJD y BJM) que han trabajado con nosotros a lo largo de los años refinando estos métodos. Un agradecimiento especial a Stan Person, bajo cuya tutela se desarrolló por primera vez esta metodología. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el fondo de apoyo a la investigación de pregrado fisher College of Science and Math de la Universidad de Towson y la subvención NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Naci....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de 12 pocillos | Corning | 3512 | |
| Placas de 6 pocillos | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiótico/antimicótico | Gibco | 15240096 | |
| Violeta cristal | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| PBS de Dulbecco (sin Mg++ o Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Suero fetal para terneros | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanil-L-glutamina (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacitómetro | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Metilcelulosa | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Agente cuaternario (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Tripsina Cytiva | SH30042.01 | ||
| Celdas Vero | ATCC | CCL-81 |
Referencias
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
