Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para obtener imágenes de ovarios enteros para análisis cuantitativos y cualitativos utilizando inmunotinción de montaje completo, microscopía multifotónica y visualización y análisis 3D. Este protocolo se adapta al procesamiento de alto rendimiento, confiable y repetible que es aplicable para toxicología, diagnóstico clínico y ensayos genómicos de la función ovárica.

Resumen

La fertilidad femenina y la esperanza reproductiva dependen de la calidad y cantidad de la reserva ovárica de ovocitos. Se estima que el 80% de las células germinales femeninas que entran en la profase I meiótica se eliminan durante el desgaste fetal de ovocitos (FOA) y la primera semana de vida postnatal. Tres mecanismos principales regulan el número de ovocitos que sobreviven durante el desarrollo y establecen la reserva ovárica en las mujeres que entran en la pubertad. En la primera ola de pérdida de ovocitos, el 30-50% de los ovocitos se eliminan durante la FOA temprana, un fenómeno que se atribuye a la alta expresión del elemento nuclear largo intercalado-1 (LINE-1). La segunda ola de pérdida de ovocitos es la eliminación de ovocitos con defectos meióticos mediante un punto de control de calidad meiótica. La tercera ola de pérdida de ovocitos ocurre perinatalmente durante la formación del folículo primordial cuando algunos ovocitos no logran formar folículos. No está claro qué regula cada una de estas tres ondas de pérdida de ovocitos y cómo dan forma a la reserva ovárica en ratones o humanos.

La inmunofluorescencia y la visualización 3D han abierto una nueva vía para obtener imágenes y analizar el desarrollo de ovocitos en el contexto de todo el ovario en lugar de en secciones 2D menos informativas. Este artículo proporciona un protocolo completo para la inmunotinción de ovario completo y la limpieza óptica, lo que produce preparaciones para la obtención de imágenes utilizando microscopía multifotónica y modelado 3D utilizando software disponible comercialmente. Muestra cómo este método se puede utilizar para mostrar la dinámica del desgaste de los ovocitos durante el desarrollo ovárico en ratones C57BL / 6J y cuantificar la pérdida de ovocitos durante las tres ondas de eliminación de ovocitos. Este protocolo se puede aplicar a los ovarios prenatales y postnatales tempranos para la visualización y cuantificación de ovocitos, así como a otros enfoques cuantitativos. Es importante destacar que el protocolo se desarrolló estratégicamente para acomodar el procesamiento de alto rendimiento, confiable y repetible que puede satisfacer las necesidades en toxicología, diagnóstico clínico y ensayos genómicos de la función ovárica.

Introducción

La mayoría de las hembras de mamíferos nacen con un número finito de ovocitos detenidos meóicamente almacenados dentro de los folículos primordiales, constituyendo la reserva ovárica (OR)^1,2. El quirófano determina la esperanza de vida reproductiva y la salud reproductiva femenina en general³. El quirófano normalmente disminuye de tamaño con el envejecimiento y puede agotarse prematuramente tras la exposición a ciertos agentes genotóxicos (radiación/quimioterapia) y estrés ambiental (desnutrición), lo que lleva a la infertilidad ^4,5,6....

Protocolo

Todos los ratones utilizados eran de la cepa genética C57BL/6J (ver la Tabla de Materiales). Esta cepa ha sido completamente secuenciada y es estándar para muchos estudios sobre la estructura y función ovárica. Los ratones fueron alojados de acuerdo con las pautas de los NIH, y los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio Jackson. Los reactivos y composiciones utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales y en la Tabla 1, respectivamente.

1. Preparación de reactivos

1. Fijador: Preparar pa....

Resultados

La inmunotinción e imagen de todo el ovario permite la visualización y cuantificación de ovocitos o expresión de proteínas en ovarios en diferentes etapas de desarrollo utilizando la misma técnica y marcadores (Figura 3). Este protocolo fue desarrollado para un proyecto a gran escala en el que se requirió el análisis de ovarios en múltiples etapas y a partir de múltiples cepas de ratón. Aquí, presentamos los datos recopilados para la cepa C57BL6 / J, una cepa estándar para el análisis genéti.......

Discusión

Este artículo presenta un protocolo detallado de inmunotinción e imágenes 3D para ovarios prenatales y postnatales para estudios comparativos y de alto rendimiento para la cuantificación de células germinales y la localización de proteínas. Desarrollamos este protocolo para analizar el número de ovocitos en ovarios (N = 6-12) en seis puntos de tiempo de desarrollo en 10-16 cepas diferentes, donde 2-4 placas de 24 pocillos se procesan típicamente a la vez. Este método se puede adaptar para otros órganos o marcadores celul.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
incubadora de sobremesa	Benchmark Scientific	H2200-H	37 ° Incubadora C
Albúmina sérica bovina (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	cepa endogámica
de ratón Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Material peligroso
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Pinzas	FST	91150-20
Barreras de reactivos FastWells	GraceBio	664113	Junta de silicona pegajosa y flexible (pozo adhesivo)
Tijeras finas	FST	91460-11
Glicerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glicina	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Cabra anti-conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilución 1:1000
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-rata anti-rata, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilución 1:1000
Suero de cabra	Sigma-Aldrich	G9023
Software IMARIS Oxford	Instruments	versión 9.7.0	Software de visualización y análisis de imágenes
Insight X3	Spectra-Physics	InSight  Láser ultrarrápido sintonizable X3	Láser para imágenes multifotónicas
Software LASX	Leica	versión 3.5.6	Software de adquisición de imágenes
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica Leica	Dmi8, preparado para 2P-M: # Microscopio	multifotónico
158005406 MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Láser láser ultrarrápido	para imágenes multifotónicas
Controlador de bomba Masterflex	SPW	Industrial Modelo: 7553-50	Bomba peristáltica para perfusión
Tijeras Mayo	FST	14010-17	5" – 7" tijeras romas/romas para la decapitación
Micro Cubreobjetos, Cuadrados, Nº 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific B3D1020		agitador/nutator para 37 ° Incubadora
C Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	Microscopio	estereoscópico
SMZ1270 Paraformaldehído 16% (solución acuosa de formaldehído)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710	Materiales
peligrosos PBS Tabletas, solución salina tamponada con fosfato	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Disolver en agua Milli-Q
Penicilina-Estreptomicina, 200x, Solución antibiótica doble	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Alcohol polivinílico (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropiletilendiamina)	Sigma-Aldrich	122262
Conejo anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilución 1:500
Conejo anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilución 1:500
Rata anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilución 1:500
Azida sódica	Sigma-Aldrich	S2002	Material peligroso
Borohidruro de sodio	Sigma-Aldrich	452882	Material peligroso
Sacarosa	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Agitador orbital	Bimedis	VXR-S10	para temperatura ambiente
Trietanolamina	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Set de infusión	MYCO Medical	7001-23	agujas para perfusión
Urea	Amresco	97061-920
X-CITE 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	lámpara de fluorescencia LED de baja potencia