Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

La mayoría de las hembras de mamíferos nacen con un número finito de ovocitos detenidos meóicamente almacenados dentro de los folículos primordiales, constituyendo la reserva ovárica (OR)^1,2. El quirófano determina la esperanza de vida reproductiva y la salud reproductiva femenina en general³. El quirófano normalmente disminuye de tamaño con el envejecimiento y puede agotarse prematuramente tras la exposición a ciertos agentes genotóxicos (radiación/quimioterapia) y estrés ambiental (desnutrición), lo que lleva a la infertilidad ^4,5,6. La infertilidad femenina idiopática a menudo se puede atribuir a la calidad genética y fisiológica de los óvulos que se desarrollan a partir del quirófano y sigue siendo poco conocida ^7,8. Debido a que la dotación del folículo femenino está en gran medida predeterminada por el nacimiento, es esencial comprender los mecanismos reguladores involucrados en el establecimiento y mantenimiento del quirófano.

En ratones, la formación de QUIR comienza con la especificación de células germinales primordiales (PGC) alrededor del día embrionario (E) 7.5². Los PGC migran a las crestas genitales, donde residirán aproximadamente en E10.5⁹. La siguiente proliferación extensa ocurre con citocinesis incompleta que resulta en la formación de quistes que se descompondrán más adelante en el desarrollo^10,11. Aproximadamente en E12.5, se determina el sexo gonadal y la proliferación de PGC se detiene en los ovarios. En las mujeres, los PGC, ahora ovocitos, entran en la profase I meiótica (IPM) en aproximadamente E13,5 ^12,13. Los ovocitos progresan a través de un IPM extendido y se detienen en la etapa de dictyate alrededor del momento del nacimiento. Durante la primera semana después del nacimiento, cada ovocito detenido está rodeado de células de granulosa, formando así un folículo primordial.

El número de folículos primordiales en el quirófano de una hembra depende de cuántos ovocitos sobrevivieron a las ondas de eliminación de ovocitos que ocurren antes y durante la detención de MPI a través de apoptosis, autofagia o necrosis^14,15. La primera ola ocurre durante el desarrollo fetal y se conoce como FOA. La FOA es un proceso conservado evolutivamente en hembras (mamíferos y no mamíferos), por el cual se estima que el 50-80% de los ovocitos se eliminan dependiendo de la especie femenina 16,17,18,19. En ratones, la FOA ocurre durante E15.5 a E18.5 y se ha atribuido a la reactivación y expresión de secuencias de retrotransposones LINE-1 causando la muerte de ovocitos^20,21. La segunda ola de eliminación de ovocitos se produce a través de un punto de control meiótico que elimina ovocitos con defectos meióticos como roturas de doble cadena de ADN no reparadas (DSB)^22,23. La siguiente ola de eliminación de ovocitos ocurre durante la descomposición del quiste, culminando durante la formación de folículos primordiales, cada uno de los cuales contiene un solo ovocito 10,11,24,25.

En ratones, la reserva del folículo primordial se establece en gran medida por la pubertad, después de lo cual disminuye a medida que los folículos primordiales se activan para el crecimiento durante los ciclos reproductivos regulares. El tamaño del quirófano varía entre las mujeres individuales y entre las diferentes cepas genéticas de ratones; sin embargo, la regulación genética del tamaño del quirófano no se entiende bien ^26,27,28,29. Los estudios genéticos de la regulación del quirófano se ven obstaculizados por la falta de protocolos estandarizados para estudiar las ondas de eliminación de ovocitos durante el desarrollo prenatal y postnatal. Se han desarrollado varias metodologías de cuantificación de ovocitos en ratones, siendo la más común y ampliamente utilizada la evaluación histomorfométrica de las secciones histológicas^30,31. En esta técnica, los ovocitos se identifican en secciones seriadas con tinciones histológicas, como hematoxilina y eosina (H&E) y ácido-Schiff periódico (PAS) o marcadores fluorescentes. Esta técnica es confiable si todas las condiciones permanecen constantes, incluido el grosor de la sección, la recuperación eficiente de todas las secciones en todo el ovario y los esquemas de conteo de laboratorios individuales. Sin embargo, los números reportados por diferentes laboratorios a menudo difieren significativamente y, por lo tanto, no son fácilmente comparables.

Además, dadas las diferencias genéticas, el uso de diferentes cepas de ratón también puede influir en los recuentos de ovocitos. Se han desarrollado enfoques computacionales adicionales para la evaluación histomorfométrica e incluyen la detección automatizada de ovocitos utilizando el enfoque fraccionador, el conteo automático utilizando algoritmos computacionales y la reconstrucción 3D de imágenes histológicas para evitar recuentos múltiples del mismo ovocito 31,32,33,34,35,36 . Incluso con estas mejoras añadidas a la evaluación histomorfométrica, la técnica es relativamente laboriosa, particularmente para estudios a gran escala y de alto rendimiento. Los datos recopilados pueden no ser reproducibles y comparables entre los estudios debido a las diferencias en los esquemas de conteo, los algoritmos informáticos y el software utilizado.

Recientemente, acelerado por el desarrollo de nuevos métodos de microscopía multifotónica y de hoja de luz de resolución media y de limpieza óptica de tejidos, las técnicas de modelado y análisis 3D para ovarios intactos se están convirtiendo en el método de elección para cuantificar eficientemente el número de ovocitos y estudiar la localización y dinámica de proteínas^37,38. Estos métodos 3D suelen ser ventajosos en comparación con los métodos histológicos, ya que los tejidos y órganos se conservan mejor y se mantienen intactos. Además, el análisis y el modelado 3D proporcionan información adicional sobre la función y las interacciones dentro y entre los nichos celulares o subestructuras dentro del órgano que pueden perderse en el análisis 2D.

El análisis 3D de órganos completos requiere la optimización de los protocolos de fijación, inmunotinción y limpieza óptica para órganos individuales, como los ovarios, sin distorsión o daño tisular. Se requiere una optimización adicional del montaje de muestras para imágenes para microscopía de alta resolución y puede depender de la plataforma de imágenes disponible. Finalmente, la imagen de todo el ovario intacto genera una gran cantidad de datos para análisis computacionales posteriores. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos 3D estandarizados para contar ovocitos para estudios comparativos y en todas las etapas de desarrollo.

Este protocolo utiliza inmunotinción estándar y protocolos de limpieza previamente informados, centrándose en un enfoque simple, fácil de usar y de alto rendimiento 38,39,40,41. El protocolo está optimizado para analizar un gran número de ovarios prenatales y postnatales hasta el día 28 postnatal (P28) y diferentes tamaños de ovarios de diferentes antecedentes genéticos de ratón. Los pasos de inmunotinción son similares para todas las etapas; sin embargo, los protocolos de aclaramiento difieren para los ovarios puberales debido a su mayor tamaño, ScaleS4(0) y CUBIC para ovarios pequeños y grandes, respectivamente^40,41. Además, la perfusión de todo el cuerpo se realiza en ratones P28 antes de la fijación para prevenir la autofluorescencia de las células sanguíneas. Se construyó un microscopio multifotónico en la plataforma Leica DIVE/4Tune como alternativa a la microscopía de hojas de luz para adquirir imágenes, y se eligió el software de Visualización y Análisis 3D IMARIS con diversas herramientas analíticas para este protocolo. Este protocolo es fácil de seguir y menos práctico, por lo tanto, ahorra tiempo. Además, la cuantificación de ovocitos es relativamente rápida, dependiendo del tamaño del ovario y la disposición de los ovocitos.

Todos los ratones utilizados eran de la cepa genética C57BL/6J (ver la Tabla de Materiales). Esta cepa ha sido completamente secuenciada y es estándar para muchos estudios sobre la estructura y función ovárica. Los ratones fueron alojados de acuerdo con las pautas de los NIH, y los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio Jackson. Los reactivos y composiciones utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales y en la Tabla 1, respectivamente.

1. Preparación de reactivos

1. Fijador: Preparar paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS. Por ejemplo, para 24 muestras (0,5 mL/muestra = 12 mL de volumen total), agregue 3 mL de grado de microscopía electrónica PFA al 16% a 9 mL de 1x PBS.
2. Tampón de permeabilización
   1. Mida el alcohol polivinílico (PVA) en un vaso de precipitados de plástico de 250 ml que contenga 1x PBS el día antes de que se necesite el tampón de permeabilización. Revuelva la solución durante la noche para permitir que el PVA se disuelva por completo.
   2. Agregue borohidruro de sodio al PVA disuelto y deje que la mezcla se homogeneice durante aproximadamente 3-5 min. Espere que la solución haga espuma.
   3. Agregue Triton X-100 a la solución y use el búfer una vez que el Triton X-100 se disuelva.
      NOTA: El PVA tarda mucho tiempo en disolverse (al menos 3 h), y la penetración del anticuerpo depende de qué tan bien se disuelva. Para los ovarios más grandes, es crucial disolver la PVA por completo.
3. Bloqueo del búfer
   1. Mida la albúmina sérica bovina (BSA) en un vaso de precipitados con 1x PBS. Revuelva la solución hasta que la BSA se disuelva.
   2. Agregue glicina, Tritón X-100, penicilina-estreptomicina y azida de sodio. Revuelva hasta que la solución se homogeneice. Transfiera el tampón a una botella y guárdelo a 4 °C. Agregue el suero de cabra normal antes de usar.
4. Tampón de lavado: Mida el PVA en un vaso de precipitados que contenga 1x PBS. Revuelva la solución durante la noche para permitir que el PVA se disuelva. Agregue Triton X-100 y azida de sodio. Una vez mezclado el tampón, guárdelo a 4 °C.
5. Solución ScaleS4(0) (pH 8.1): Disolver D-sorbitol en PBS en un vaso de precipitados con agitación a ≤100 °C. Agregue urea a la solución, y una vez que la urea se disuelva, apague el fuego y permita que la solución se revuelva hasta que se disuelva por completo. Agregue glicerol y dimetilsulfóxido, y revuelva hasta que la solución se homogeneice. Guarde la solución a temperatura ambiente en la oscuridad.
   NOTA: La solución scaleS4(0) debe hacerse fresca el primer día de limpieza de los ovarios.
6. Solución ScaleCUBIC-1
   1. Disolver la urea en un vaso de precipitados que contenga PBS con agitación a temperatura ≤100 °C. Mida N,N,N′,N′-tetrakis(2-hidroxipropil)etilendiamina en un vaso de precipitados separado, luego agregue la urea disuelta y revuelva a una temperatura de ≤100 ° C hasta que los reactivos se disuelvan por completo. Una vez que todos los reactivos estén en solución, apague el fuego y enfríe a temperatura ambiente. Almacenar en la oscuridad.
   2. Desgasifica la solución transfiriéndola a un matraz filtrante. Conecte el matraz al vacío con tubos, cubra el matraz y encienda el vacío hasta que desaparezcan las burbujas en la solución. Use la solución después de esta desgasificación.
      NOTA: La solución se puede almacenar en la oscuridad para usarla hasta por un mes.
7. Solución de sacarosa: Disolver la sacarosa en 1x PBS; luego desgasificar la solución antes de usarla.
   NOTA: Prepare la solución recién antes de usarla.
8. Solución ScaleCUBIC-2
   1. Disolver sacarosa en un vaso de precipitados que contenga PBS con agitación a una temperatura ≤100 °C. Agregue la urea y revuelva a una temperatura de ≤100 ° C hasta que la urea se disuelva. Apaga la calefacción.
   2. Añadir trietanolamina y Tritón X-100. Revuelva hasta que la solución se homogeneice. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente y guárdela en la oscuridad. Desgasificar la solución antes de usarla.
      NOTA: La solución se puede almacenar en la oscuridad para usarla hasta por un mes.

2. Disección y fijación de ovarios prenatales (Figura 1A)

1. Aparear hembras adultas (≥8 semanas) y machos de acuerdo al protocolo institucional aprobado. Compruebe si hay tapones vaginales todas las mañanas.
   NOTA: La mañana de un tapón vaginal se designa como 0.5 días después del coitum (d.p.c) o E0.5.
2. El día de la disección, prepare paraformaldehído al 4% (PFA) y alícuota ~ 0.5 ml en tubos de microcentrífuga, colocados en el lado del banco (~ 4 por hembra embarazada).
   NOTA: El PFA es una sustancia peligrosa y debe manipularse bajo una campana química.
3. Prepare tres placas de 100 mm que contengan ~ 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para cada hembra embarazada (para cosechar útero, diseccionar el complejo mesonefros-ovario y aislar los ovarios).
4. Sacrificar a las hembras embarazadas que portan embriones de la etapa de desarrollo preferida y proceder a la disección. Eutanasia no más de 1-2 hembras a la vez. Utilice un protocolo aprobado para la eutanasia de ratones preñados (por ejemplo, exposición a CO₂ seguida de dislocación cervical).
5. Una vez que una mujer es sacrificada, rocíe el abdomen con etanol al 70%. Usando fórceps, levante la piel abdominal y use tijeras para hacer una incisión en forma de V a través del abdomen y la pared del cuerpo. Corte a lo largo de los dos lados de la incisión y pele la piel hacia atrás para exponer los órganos internos y los fetos en el útero.
6. Con fórceps y tijeras, corte y separe el útero con los fetos de la grasa abdominal y las arterias y venas ováricas. Extraiga el útero y colóquelo en una placa de 100 mm que contenga 1x PBS. Libere a los fetos en PBS cortando la pared uterina y perforando el saco vitelino. Cortar el cordón umbilical.
   NOTA: Para los fetos menores de 15 días de gestación, la eutanasia de la madre y la extracción del útero aseguran la muerte rápida del feto. Los fetos mayores de 15 días de gestación hasta el nacimiento deben ser sacrificados por decapitación.
7. Transfiera un feto a un plato nuevo con 1x PBS fresco. Para decapitar un feto E15.5, fije delicadamente las dos extremidades posteriores separadas en la placa con fórceps para inmovilizar al feto. Usando un segundo par de fórceps sostenidos en la mano dominante, sostenga el cuello entre las puntas de los fórceps y apriete para cortar la cabeza del feto, o use tijeras para cortar el cuello.
8. Con las pinzas de mano dominantes, corte por debajo de las extremidades anteriores y tire suavemente de la parte superior del cuerpo. A continuación, inserte un punto final de los fórceps de mano dominantes en la cavidad peritoneal verticalmente en la abertura de la región abdominal, mientras que el otro punto final de los fórceps permanece afuera. Cierre los fórceps, pellizque la pared del cuerpo para cortarla y exponga los órganos internos.
9. Con los mismos fórceps, retire suavemente los órganos, incluidos los intestinos y el hígado, hasta que el riñón y los órganos reproductivos se vuelvan visibles. Determine el sexo del feto: en E15.5, los ovarios tienen una forma alargada similar a una salchicha, mientras que los testículos son ovalados.
   NOTA: En etapas anteriores, el genotipado puede ser necesario para determinar el sexo.
10. Usando un par de fórceps, sostenga al feto femenino hacia abajo y use los otros fórceps para agarrar cada complejo mesonefros-ovario y separarlo suavemente de los riñones y los conductos müllerianos. Coloque los ovarios en una placa nueva con 1x PBS, deje los mesonefros unidos, pero retire los tejidos circundantes para asegurarse de que los ovarios estén expuestos. Coloque ambos ovarios en ~ 0.5 ml de PFA al 4% en tubos de microcentrífuga y fije a 4 ° C durante la noche. Al día siguiente, reemplace PFA con etanol al 70%.
11. Para la disección y fijación de ovarios E18.5, separe los fetos del útero como se describe anteriormente y luego siga el protocolo para cachorros prepúberes descrito en la sección 3 (Figura 1B).

3. Disección y fijación de ovarios prepúberes (Figura 1B)

1. Prepare 4% de PFA y alícuota ~ 0.5 ml en tubos de 1.5 ml y colóquelos en el lado del banco (~ un tubo por cachorro). Prepare placas de 35 mm con 1x PBS (~ uno por cachorro). Sacrificar a los cachorros utilizando el protocolo institucional aprobado.
   NOTA: La decapitación es el método preferido de eutanasia para ratones de 8 días de edad o menos. Los ratones neonatales pueden ser decapitados usando tijeras de disección de 3-4" o tijeras Mayo de 5-7".
2. Determine el sexo de los cachorros midiendo la distancia anogenital, que es mayor en los machos que en las hembras. Use tijeras de decapitación afiladas para decapitar a las crías hembras. Coloque el cuerpo, con el lado abierto hacia abajo, sobre una toalla de papel para drenar la sangre (~ 5-10 s).
3. Asegure al cachorro en su espalda colocando un alfiler en la almohadilla de la pata de cada pie. Rocíe el abdomen con etanol al 70%. Use fórceps para mantener la piel del cachorro lejos del cuerpo y use tijeras para hacer una pequeña incisión en forma de V en la piel de la parte inferior del abdomen.
4. Inserte las tijeras en la incisión debajo de la piel y corte a lo largo de ambos lados del abdomen. Use los fórceps para pelar suavemente la piel y revelar la parte inferior del abdomen. Mueva suavemente el intestino hacia arriba y ubique los cuernos uterinos junto a la vejiga. Siga cada cuerno uterino hacia el riñón y ubique el ovario con tejido adiposo circundante debajo de cada riñón.
5. Para diseccionar los ovarios, sostenga el cuerno uterino debajo del ovario y el oviducto con un par de fórceps (fórceps A, Figura 1B) y levántelo suavemente del cuerpo. Usando otro par de fórceps (fórceps B), agarre suavemente debajo del primer par de fórceps para que el ovario y el oviducto en la almohadilla adiposa sean visibles por encima del segundo par de fórceps. Luego, corte debajo del segundo par de fórceps con tijeras o tire con cuidado para separar los ovarios y los tejidos unidos.
6. Coloque los órganos aislados en una placa con 1x PBS. Recorte el tejido adiposo adicional, el oviducto y el cuerno uterino para limpiar y aislar el ovario. Abra delicadamente la bolsa que rodea el ovario y exponga todo el ovario.
7. Recorte la membrana de la bolsa sin dañar el ovario y deje tejido alrededor del hilio (estructura similar a un ligamento entre el ovario y el tracto reproductivo) para manejar el ovario, como se muestra en la Figura 1B, P5. Una vez que los ovarios estén recortados, colóquelos en PFA al 4% y fije los ovarios a 4 ° C durante la noche. Al día siguiente, reemplace el PFA al 4% con etanol al 70% y almacene los ovarios a 4 ° C hasta el paso del protocolo de inmunotinción.

4. Perfusión, disección y fijación de ovarios puberales (Figura 1C)

1. Perfundir ratones de acuerdo con protocolos aprobados institucionalmente con el ratón bajo anestesia profunda en una campana de humo químico. Preparar el equipo de perfusión y los reactivos. Véase el protocolo detallado en ⁴².
   NOTA: La perfusión es un procedimiento de eutanasia terminal que reemplaza la sangre en todo el sistema vascular con un fijador de tejido.
2. Pesar un ratón hembra puberal (P28) y registrar el peso del ratón (típicamente entre 13 g y 15 g). Calcule la cantidad del agente anestésico aprobado que se utilizará.
   NOTA: Aquí, se utilizaron 0,35 ml de tribromoetanol por 10 g de peso corporal en este protocolo.
3. Use una jeringa desechable de 10 ml con una aguja de 20 G para llenar la jeringa con el agente anestésico aprobado. Reemplace la aguja de 20 G por una aguja de 26 G x 3/8.
4. Sujete cuidadosamente el mouse desaliñando la piel dorsal del cuello con una mano. Gire el ratón para exponer el abdomen. Inyecte la cantidad previamente calculada de anestésico en la cavidad peritoneal. Coloque el ratón en un recipiente con una cubierta hasta que la anestesia surta efecto (es decir, el ratón ya no se mueva).
5. Una vez que el ratón deje de moverse, pellizque suavemente sus pies para comprobar que no hay respuesta y asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado antes de iniciar la perfusión. Coloque y asegure el ratón sobre su espalda fijando suavemente las cuatro patas a través de las almohadillas de las patas en una tabla. Asegúrese de que las piernas estén fijadas en una posición relajada, no demasiado estiradas.
6. Rocíe el ratón con etanol al 70% desde el abdomen hasta la región del pecho. Use fórceps para pellizcar y levantar suavemente la piel abdominal y luego use tijeras para hacer un pequeño corte en forma de V a través de la piel y la pared del cuerpo.
7. Levante el colgajo de la piel de la cavidad corporal e inserte las tijeras debajo de la piel y la pared del cuerpo. Corte la piel y la pared del cuerpo hacia arriba hacia la cabeza hasta el borde de la cavidad torácica en el esternón.
8. Abra la cavidad torácica cortando cuidadosamente las costillas a ambos lados del esternón justo debajo de la escápula. Tenga cuidado de no perforar los pulmones debajo de la caja torácica. Agarre los colgajos de piel / costilla con fórceps y fíjelos para exponer los órganos internos.
9. Recorte suavemente cualquier tejido, como el timo, que pueda obstruir el acceso claro al corazón. Exponga todos los órganos, incluido el tracto gastrointestinal, para permitir la confirmación visual de que todo el cuerpo está perfundido, incluida la parte inferior del abdomen.
10. Use tijeras de disección para cortar la aurícula derecha del corazón y liberar sangre del sistema. Sostenga suavemente el corazón con fórceps e inserte una aguja de perfusión (conectada a un controlador de bomba peristáltica) en el ventrículo izquierdo.
11. Bombee ~ 10 ml de PBS, con presión suave pero constante, hasta que los tejidos como el hígado, los riñones y el tracto reproductivo (Figura 1E, F) cambien de rosa a blanco. A continuación, reemplace el PBS con PFA al 1% recién hecho y continúe la perfusión con aproximadamente 10 ml de PFA o hasta que se produzcan espasmos en la parte inferior del cuerpo del ratón (por ejemplo, cola).
    NOTA: Estos temblores de fijación indican una perfusión exitosa.
12. Una vez que se completa la perfusión, ubique la almohadilla de grasa con los ovarios debajo del riñón y diseccione suavemente todo el tracto reproductivo, incluida la almohadilla de grasa, los ovarios y los cuernos uterinos, y coloque el tracto en un vial con 4% de PFA. Fije los ovarios a temperatura ambiente durante la noche (~ 16-24 h). Luego, reemplace el PFA al 4% con etanol al 70% durante al menos un día y recorte los ovarios (Figura 1E, F), como se describió anteriormente, antes de comenzar el protocolo de inmunotinción.

5. Inmunotinción de ovario de montaje completo (Figura 2A)

NOTA: Practique técnicas estériles durante el protocolo de inmunotinción, especialmente al cambiar los tampones, para evitar la contaminación durante períodos de incubación prolongados.

1. Realice todos los pasos de inmunotinción en una placa de 24 pocillos, como se muestra en la Figura 2A. Ajuste los volúmenes de reactivos para otros formatos. Cambie los tampones con cuidado para evitar perder pequeños ovarios prenatales y prepúberes.
   NOTA: Se pueden usar otros formatos, como placas de 48 y 96 pocillos, pero los pozos más profundos y las aberturas más estrechas dificultan la aspiración de tampones sin perder o dañar los ovarios.
2. Día 1
   1. Pipetear 1 ml de PBS/pozo en el número de pozos necesarios en una placa limpia de 24 pocillos. Corte la punta de una punta de pipeta de 200 μL para hacer una abertura amplia y úsela para transferir suavemente los ovarios prepúberes de tubos de 1,5 ml con etanol al 70% a los pozos. Para los ovarios puberales, use una punta de pipeta de 1000 μL con la punta cortada para la transferencia.
      NOTA: La abertura más ancha de la punta evita el daño tisular durante la transferencia.
   2. Una vez que todas las muestras se transfieran a los pozos, use una nueva punta para aspirar el PBS y reemplácelo con 0.8 ml nuevos de PBS / pozo. Incubar las muestras a temperatura ambiente en un agitador a ~100-150 rpm durante la noche. Iniciar la preparación del tampón de permeabilización (ver Tabla 1 y sección 1).
      NOTA: La nueva punta evita que los ovarios se peguen a la punta, y el paso de incubación de PBS permite que los ovarios se equilibren en PBS y se rehidraten antes de teñirse.
3. Día 2
   1. Finaliza la preparación del tampón de permeabilización. Aspire PBS de los pozos y reemplácelo con 0.8 ml del tampón de permeabilización por pozo. Coloque las placas de nuevo en el agitador e incube las muestras a temperatura ambiente durante 4 h.
   2. Después de 4 h de incubación, aspire completamente el tampón de permeabilización y reemplácelo con 0,5 ml de tampón de bloqueo (ver Tabla 1 y sección 1). Selle la placa con parafilm para evitar la evaporación, colóquela en un recipiente cubierto de forma segura en un agitador e incube las muestras con agitación suave en un tampón de bloqueo durante la noche (16-24 h) a temperatura ambiente.
4. Día 3
   1. Preparar los anticuerpos primarios por dilución en tampón de bloqueo. Para visualizar los ovocitos, use marcadores de ovocitos, por ejemplo, peptidasa ácida nuclear anti-células germinales de rata (GCNA)/TRA98 para ovarios prenatales y prepúberes y helicasa 4 (DDX4)/vasa homóloga de ratón (MVH) para ovarios prepúberes y puberales. Para cuantificar la expresión de LINE-1 ORF1p en ovarios prenatales, use orF1p anti-LINE-1 de conejo u otro anticuerpo disponible.
      NOTA: La señal GCNA/TRA98 no es detectable en los ovarios puberales.
   2. Aspire el tampón de bloqueo de las muestras y reemplácelo con 0,5 ml de anticuerpos primarios diluidos. Selle la placa con parafilm para evitar la evaporación. Coloque las placas en un recipiente con una cubierta para evitar el secado de las muestras durante la incubación. Coloque el recipiente en el agitador e incube las muestras durante 3-4 días a temperatura ambiente.
5. Día 7
   1. Retire suavemente la parapelícula de las placas y aspire la mezcla de anticuerpos primarios de las muestras. Almacene las mezclas de anticuerpos primarios a 4 °C (hasta un mes o tres usos) y reutilícelas más tarde suplementándolas con anticuerpos frescos (por ejemplo, 2 μL de alícuota de anticuerpos frescos por 5 ml de la mezcla utilizada anteriormente).
   2. Añadir 1 ml de tampón de lavado (ver Tabla 1 y sección 1) por pozo a las muestras y mecer suavemente las placas durante unos segundos para enjuagar los anticuerpos residuales. Aspire y reemplace cuidadosamente el tampón de lavado con 0.8 ml de tampón de lavado fresco y agite las placas a temperatura ambiente durante la noche.
6. Día 8
   1. Aspire el tampón de lavado durante la noche, reemplácelo con 0,8 ml de tampón de lavado fresco y agite a temperatura ambiente durante 2 h. Repita el paso de lavado con un tampón de lavado fresco durante otras 2 h.
   2. Después del último lavado, reemplace el tampón de lavado con 0.5 ml de mezclas de anticuerpos secundarios diluidos en un tampón de bloqueo, por ejemplo, alexa Fluor 555 antirata de cabra y alexa Fluor fluor 647 de cabra anti-conejo en dilución de 1: 1,000. Prepare la mezcla secundaria de anticuerpos fresca para cada experimento de inmunotinción.
   3. Selle la placa con parafilm para evitar la evaporación durante la incubación. Incubar las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad o en placas cubiertas con papel de aluminio con agitación suave durante 3 días.
      NOTA: Este paso y todos los pasos posteriores se llevan a cabo en la oscuridad o con envoltura de papel de aluminio.
7. Día 11
   1. Aspire la mezcla secundaria de anticuerpos y realice un lavado inicial con 1 ml de tampón de lavado. Balancee suavemente las placas durante unos segundos para enjuagar los anticuerpos secundarios residuales.
   2. Aspire el tampón de lavado, reemplácelo con 0,8 ml de tampón de lavado fresco e incube las muestras a temperatura ambiente durante 2 h con agitación, protegido de la luz. Repita el paso de lavado 2 veces para un total de 3 lavados. Después del tercer lavado, proceda al paso de limpieza (sección 6).

6. Limpieza de ovarios de montura entera inmunoteñidos (Figura 2A).

NOTA: Realice todos los pasos de limpieza en la oscuridad envolviendo las placas en papel de aluminio o colocándolas en recipientes opacos. Los pasos de limpieza difieren para los ovarios prepúberes y puberales.

1. Día 11 [Los ovarios prenatales y prepúberes se eliminan en un protocolo de un solo paso]
   1. Después del último lavado, aspire el tampón de lavado y sustitúyalo por 0,8 ml de solución ScaleS4(0) recién hecha (ver Tabla 1 y sección 1). Selle la placa con parafilm e incube las muestras en la oscuridad con agitación a temperatura ambiente durante tres o cuatro días antes de la toma de imágenes.
   2. Reemplace la solución ScaleS4(0) con una solución nueva diariamente si es necesario; Tenga cuidado al reemplazar las soluciones, ya que los ovarios despejados se vuelven transparentes y son difíciles de ver. Después de la limpieza, proceda a la configuración de la muestra y a la obtención de imágenes (sección 7).
      NOTA: El cambio de soluciones no mejoró significativamente la calidad de la imagen. Los cambios diarios aumentan la probabilidad de perder muestras pequeñas y en su mayoría transparentes.
2. Días 11-15 [Los ovarios puberales se eliminan en un protocolo de dos pasos]
   1. Después del último lavado de inmunotinción, aspire el tampón de lavado y reemplácelo por 0,8 ml de ScaleCUBIC-1 (ver Tabla 1 y sección 1). Selle la placa con parafilm y agite suavemente las muestras a 37 °C durante 3 días en la oscuridad. Reemplace la solución ScaleCUBIC-1 con la solución fresca diariamente.
   2. El día 15, lave las muestras 3 veces durante 10 minutos cada vez en 0,8 ml de PBS a temperatura ambiente con un suave agitación. Reemplace el PBS con 0.8 ml de sacarosa desgasificada al 20% preparada recién hecha con PBS. Agitar suavemente a temperatura ambiente durante 1 h.
   3. Reemplace la solución de sacarosa al 20% con 0,8 ml de solución ScaleCUBIC-2 (consulte la Tabla 1 y la sección 1), selle la placa con parafilm y agite suavemente a temperatura ambiente con los cambios diarios de la solución ScaleCUBIC-2. Borrar durante 4-5 días y proceder a la imagen. Tenga cuidado al intercambiar soluciones para evitar la pérdida de muestras, ya que los ovarios despejados son transparentes y difíciles de ver. Proceda a la configuración de la muestra y a la obtención de imágenes (sección 7).

7. Configuración de muestras e imágenes con un microscopio multifotónico

NOTA: Todos los pasos descritos a continuación se realizaron con un Leica DIVE/4TUNE/FALCON con dos láseres multifotón Ti:Sapphire sintonizables bloqueados en modo con una duración de pulso de 120 fs con un objetivo multiinmersión 16x/NA0.6 (líquido de inmersión = glicerol) con una distancia de trabajo máxima de 2,2 mm. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el software de adquisición de imágenes. La Tabla suplementaria S1 y la Figura suplementaria S1 muestran la configuración utilizada para este protocolo. Para otras plataformas de imágenes, consulte con el núcleo de microscopía o siga las especificaciones / recomendaciones de los fabricantes.

1. Configuración de ejemplo
   1. Prepare la configuración para el montaje de las muestras. Por ejemplo, use una junta de silicona pegajosa y flexible para crear un pozo adhesivo. Coloque el pozo adhesivo en una cubierta micro No. 1.5 de 25 mm x 25 mm para crear un pozo en el que se colocarán los ovarios (Figura 2B).
      NOTA: Una junta de 1 mm de espesor acomoda todos los tamaños de ovarios. Se recomienda esta configuración, ya que elimina el movimiento del ovario durante la toma de imágenes, que puede ocurrir cuando los ovarios se colocan en montura en un plato con fondo de vidrio.
   2. Usando una punta de pipeta con la punta cortada (20 μL para prenatal y prepuberal), transfiera los ovarios con ~ 5-10 μL de solución ScaleS4(0) al centro del pozo adhesivo como se muestra en la Figura 2B. Para los ovarios puberales, use una punta de pipeta de 200 μL con la punta cortada lo suficiente como para transferir los ovarios. Agregue ~ 15-20 μL de la solución ScaleCUBIC-2 en el medio del pozo adhesivo.
      NOTA: Demasiada solución puede causar fugas en la etapa del microscopio, y muy poca solución dará como resultado una mala calidad de imagen. Use un microscopio de disección para transferir muestras a medida que los ovarios despejados se vuelven transparentes y son difíciles de ver.
   3. Una vez que los ovarios se transfieren a pozos individuales con una gota de solución de limpieza, coloque suavemente otro vidrio de cubierta en el pozo adhesivo, presione para crear un sello y mantenga las muestras en su lugar en un pequeño grupo de solución de limpieza intercalada entre las dos cubiertas (Figura 2B). Para la obtención de imágenes, coloque el "sándwich" de la cubierta en una diapositiva del adaptador de microscopio impresa en 3D (por ejemplo, ⁴³ ).
      NOTA: Los pozos adhesivos son reutilizables después de deconstruir el "sándwich" y lavarlo con agua.
2. Imágenes (Tabla suplementaria S1 y Figura suplementaria S1)
   1. Encienda el microscopio y el software de acuerdo con las pautas del núcleo de microscopía o del fabricante. Coloque las muestras montadas en el escenario del microscopio y mire a través del ocular para localizar la muestra iluminada con una lámpara de fluorescencia LED de baja potencia.
   2. Una vez que se encuentren las muestras, encienda los láseres y asigne cada detector a un tinte / marcador Alexa Fluor específico. Para múltiples láseres, permita la adquisición secuencial de imágenes. Adquiera toda la pila antes de cambiar los láseres.
      NOTA: Para este protocolo, se utilizó un láser para la adquisición de imágenes de fluoróforos de 555 nm y 647 nm.
   3. Configure los parámetros para la adquisición de imágenes de acuerdo con las especificaciones del núcleo de microscopía o del fabricante. Utilice la adquisición bidireccional de imágenes, si está disponible, para reducir el tiempo de escaneo y mejorar la eficiencia. Ajuste otros ajustes, incluidos el promedio de línea (1), el promedio de fotogramas (1) y la acumulación de fotogramas (1).
      NOTA: La adquisición bidireccional de imágenes permite que los láseres escaneen en ambas direcciones a medida que se mueven en el eje X.
   4. Configure el Z-Stack identificando el principio (parte inferior de la cubierta de vidrio de la muestra/ inferior) y la posición final (parte superior de la cubierta de vidrio de la muestra/parte superior). Seleccione un tamaño de paso Z de 2 μm para los ovarios prepúberes y 5 μm para los ovarios puberales.
   5. Active la función de compensación Z y, dentro de esta función, active la ganancia de excitación. Establezca la compensación Z para la parte inferior y superior de la muestra seleccionando una intensidad láser tanto para la pila inferior (baja intensidad) como para la superior (alta intensidad). Consulte la Figura suplementaria S1, Compensación Z lineal, donde se selecciona la caja de ganancia de excitación, y la intensidad del láser para la parte inferior (0) y superior (347.75) se establece como 10 y 12, respectivamente.
   6. Utilice el modo de mosaico para muestras más grandes que no se pueden capturar en un solo campo de visión. Active el navegador de imágenes e indique el número de mosaicos necesarios para capturar toda la muestra utilizando la herramienta de marcado rectangular.
   7. Inicie la adquisición de imágenes. Para imágenes con varios mosaicos, inicie la adquisición de imágenes con el navegador para capturar todos los mosaicos. Una vez completada la adquisición de imágenes, primero guarde todas las imágenes y, si se adquirieron varios mosaicos, ejecute la herramienta de combinación de mosaicos para fusionar los mosaicos en una sola imagen.
   8. Guarde los archivos combinados en una carpeta de proyecto separada para facilitar el trabajo con las imágenes de tamaño Gigabyte. Transfiera los archivos para el procesamiento de imágenes con el software de visualización y análisis de imágenes 3D. La Figura 3 muestra imágenes representativas tomadas en diferentes etapas con dos marcadores (GCNA y DDX4).

8. Procesamiento de imágenes

NOTA: Todos los pasos descritos a continuación se desarrollaron y realizaron utilizando el software de visualización y análisis de imágenes 3D IMARIS.

1. Importe las imágenes en el software de visualización y análisis de imágenes 3D y, si es necesario, convierta los archivos del formato original (por ejemplo, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) al formato .ims.
2. Si es necesario, procese las imágenes con el filtro gaussiano para reducir la pixelación (Figura 4A). Con la función de vista 3D , coloque la imagen y anule la selección de la opción de fotograma (para eliminar el fotograma).
   NOTA: Hay otros filtros opcionales, que también se pueden utilizar para disminuir la pixelación y reducir la intensidad del fondo.
3. Amplíe la imagen a una escala específica y utilice la función Instantánea. Establezca las preferencias de la siguiente manera: seleccione 300 DPI, guardar como imagen TIFF y Fondo transparente. Tome una instantánea de la imagen y guárdela. La Figura 3 muestra imágenes ensambladas completas.

9. Cuantificación de ovocitos

NOTA: La inmunofluorescencia de ovario completo y la visualización y análisis de imágenes 3D se pueden utilizar para la estimación del número de ovocitos en ovarios enteros (Figura 3 y Figura 4) utilizando la función Spot. La señal GCNA se puede utilizar para cuantificar ovocitos en ovarios prenatales y prepúberes, como se muestra en la Figura 4 (P5). En los ovarios puberales, utilice la señal DDX4 para cuantificar dos poblaciones de ovocitos en folículos que no crecen ("estructura en forma de anillo", flecha cerrada) y folículos en crecimiento (estructuras grandes, flecha abierta, Figura 4, P28).

1. Determine el tamaño de los ovocitos que se utilizarán como parámetro para cuantificar los ovocitos con la función Manchas en el paso 9.2.
   1. Abra la imagen y seleccione la opción Slice para abrir la imagen Z-stack.
   2. Seleccione la opción Línea en el panel Medida y mida la distancia dibujando una línea desde una arista de un ovocito/marcador hasta la otra arista en el punto más ancho para determinar el diámetro XY del tipo/tamaño de ovocitos que se va a contar. Muévete por la pila y obtén el rango de diámetros para múltiples ovocitos del mismo tipo. Utilice la longitud más corta como criterio de selección de tamaño para los recuentos de ovocitos.
2. Función De manchas : Seleccione la opción Vista 3D y active la función Agregar nuevas manchas en el panel Escena para abrir el panel Algoritmo . Anule la selección de todos los ajustes del algoritmo, ya que se utilizará el filtro de selección de tamaño con el tamaño de ovocito obtenido en el paso 9.1.
   1. Haga clic en la flecha única hacia adelante para pasar al canal de origen. Seleccione el canal con el marcador preferido y escriba el diámetro XY estimado obtenido en el paso 9.1. Por ejemplo, utilice un diámetro XY estimado de 7 μm para los ovocitos prenatales y 11 μm para los ovocitos P5 (GCNA = señal verde; Figura 3 y Figura 4A).
   2. Utilice 30 μm para la señal DDX4 para estimar el número de ovocitos en folículos en crecimiento en ovarios P5 (DDX4 = señal magenta; Figura 3 y Figura 4A). Para los ovarios puberales, utilice la señal DDX4 para las cuantificaciones de ovocitos. Por ejemplo, use diámetros XY de 15 μm y 80 μm para identificar ovocitos dentro de folículos que no crecen y folículos en crecimiento, respectivamente, como se muestra en la Figura 4A.
      NOTA: El tamaño seleccionado puede variar debido a los criterios de adquisición de imágenes y al tipo de microscopio utilizado. La selección también puede variar entre las cepas genéticas, ya que los ovarios con más ovocitos requerirán selecciones de tamaño más pequeñas para una mejor detección automatizada de ovocitos.
   3. Después de la selección de tamaño, active el alargamiento PSF del modelo y la resta de fondo, que se determinan automáticamente. Seleccione la flecha única hacia adelante para desplazarse al panel Filtrar manchas . Agregue el filtro Calidad y determine un umbral. Para garantizar la estimación precisa del número de ovocitos, amplíe la imagen a medida que se ajusta el umbral para elegir un valor umbral que seleccione la mayoría de los ovocitos. Haga clic en la flecha doble para finalizar los recuentos automatizados.
   4. Compruebe manualmente los ovocitos seleccionados mediante la ficha Editar para seleccionar los ovocitos perdidos o anule la selección de las partículas no ovocitos seleccionadas por el umbral automático. Registre los datos en la pestaña Estadísticas en la pestaña General para un análisis más detallado.
      NOTA: Los parámetros utilizados para contar los puntos se pueden guardar y usar para otro conjunto de muestras, pero se recomienda realizar una comprobación manual antes de ejecutar el análisis por lotes.
   5. Para almacenar los parámetros, haga clic en la pestaña Creación y haga clic en Almacenar parámetros para batch.
      NOTA: Los marcadores nucleares (ovocitos GCNA+, Figura 4A) se identifican fácilmente por la característica puntual y pueden no requerir mucho ajuste manual. Sin embargo, el marcador citoplasmático (ovocito DDX4+, Figura 3 (P28, flecha cerrada) y Figura 4A) requerirá más ajuste manual para garantizar la identificación del tamaño/tipo correcto de ovocitos.

10. Cuantificación de la expresión de proteínas en los ovarios

NOTA: Hay varias maneras de cuantificar la expresión de ovocitos de marcadores específicos utilizando tanto la función Manchas (sección 9 y paso 10.1) como la función Superficies (paso 10.2). La función Manchas se puede usar para proteínas con patrones de localización distintos, como marcadores nucleares (GCNA), y la función Superficies se puede usar para proteínas con patrones de localización no uniformes como se muestra en la Figura 5A , donde se midieron las intensidades LINE-1 ORF1p en los ovarios E15.5 y E18.5. Para calcular y comparar la intensidad de la proteína de interés entre dos muestras (por ejemplo, puntos de tiempo, tratamientos o genotipos), recopile imágenes con las mismas propiedades. Utilice muestras con una señal más intensa para determinar los parámetros que se pueden almacenar y utilizar para las otras muestras.

1. Para obtener la expresión proteica con la función Manchas , primero identifique los ovocitos como resaltados (sección 9).
   1. Luego, en la función Spots , seleccione la pestaña Estadísticas , seguida de la pestaña Detallado . Haga clic en la flecha hacia abajo y seleccione Valores específicos, que abrirá otra pestaña debajo de ella que contiene diferentes medidas. Seleccione la media de intensidad del canal utilizado para la generación de superficie (o seleccione otras mediciones de intensidad, como la mediana de intensidad).
   2. Para obtener la información estadística combinada/media, seleccione el criterio Valores medios . Una vez hecho esto, exporte y guarde los datos para su posterior análisis.
2. Para obtener la expresión de proteínas con la función Superficies , abra la imagen, seleccione la opción Vista 3D y active la función Agregar nuevas superficies en el panel Escena para abrir el panel Algoritmo . Anule la selección de todos los ajustes del algoritmo si no es necesario y haga clic en la flecha hacia adelante para desplazarse al canal de origen.
   1. Seleccione el canal con la señal de anticuerpos que desea medir. Otras propiedades para seleccionar son opciones específicas del usuario. Aquí, la señal LINE-1 se utilizó como marcador. Los valores Detalle de superficies y Sustracción de fondo (contraste local) se mantuvieron en valores predeterminados de 1,42 y 5,33, respectivamente.
   2. Haga clic en la flecha hacia adelante para desplazarse al panel Umbral . Elija un valor de umbral que sea comparable en ambas muestras (por ejemplo, aquí, se utilizó la expresión LINE-1 en E18.5 para elegir un umbral). Seleccione Habilitar con un diámetro de puntos de semilla predeterminado de 7,10 (este valor se encontró óptimo para las imágenes, pero puede depender del tamaño de píxel esperado de las características).
   3. Haga clic en la flecha hacia adelante para desplazarse al panel Filtrar superficies . Se utilizó un filtro de calidad , y basar el valor, al igual que con el valor umbral , en la expresión de las proteínas en ambas muestras de ovario. Una vez seleccionada la propiedad filter, haga clic en la flecha doble hacia adelante para completar la generación de la superficie.
   4. Para obtener los valores de intensidad, seleccione la ficha Estadísticas , seguida de la ficha Detallado . Haga clic en la flecha hacia abajo y seleccione Valores específicos, que abrirá otra pestaña debajo de ella que contiene diferentes medidas.
   5. Seleccione la media de intensidad del canal utilizado para la generación de superficie (o seleccione otras mediciones de intensidad, como la mediana de intensidad).
   6. Para obtener la información estadística combinada/media, seleccione el criterio Valores medios . Una vez hecho esto, exporte y guarde los datos para su posterior análisis (Figura 5C).

11. Estimación del número total de ovocitos en ovario dañado con corrección computacional

NOTA: Si se produce un daño ovárico menor durante la disección, puede ser posible estimar computacionalmente el recuento total de ovocitos. Se recomienda utilizar ovarios intactos de la misma cepa y etapa de desarrollo para la estimación del número de ovocitos como se muestra en la Figura 6. Las simulaciones realizadas con ovarios en E15.5 indican que la corrección de una pérdida del ≥30% resulta en una desviación significativa de los números reales (Figura 6C).

1. Abra imágenes de ovarios intactos con IMARIS y seleccione la función Marco . En Configuración de marco, seleccione las etiquetas Cuadro, Cuadrícula, Marcas de graduación y Eje . En la pestaña Posición X/Y/Z , seleccione 200 μm para generar marcas de verificación con espacios de 200 μm en todas las posiciones X/Y/Z.
   NOTA: Las marcas de verificación crean una cuadrícula/regla en los planos X, Y y Z para identificar ovocitos dentro de una región específica.
2. Active la función Manchas para identificar los ovocitos como se resalta en la sección 9 (Figura 4). Cree un modelo 3D utilizando los ovocitos identificados en todos los ovarios intactos que se utilizan para la simulación seleccionando Esfera en la pestaña Estilo/Calidad de puntos en la función Manchas .
   NOTA: El ancho de píxel también se puede cambiar en la pestaña Estilo/Calidad de puntos .
3. Con el cuadro generado en el paso 11.1, alinee los modelos 3D de los ovarios intactos en la misma orientación que se muestra en la Figura 6A.
4. Usando las marcas de 200 μm (paso 11.1), seleccione ovocitos que caigan dentro del 50% del volumen de cada ovario. Haga clic en la función Manchas y seleccione Editar etiquetas para clasificar los ovocitos que se encuentran dentro de la región del 50% por color, como se muestra en la Figura 6A.
   NOTA: Una vez que los ovocitos se clasifican en una región, se proporcionará el número de ovocitos que caen dentro de cada clase.
5. Haga zoom en la región del 50% y cambie las marcas de verificación de 200 μm a 50 μm para hacer una regla más pequeña para la identificación de ovocitos. Mantenga el % de zoom en todas las imágenes. Con las marcas de 50 μm como guía, divida la región del 50% en cinco partes iguales.
   NOTA: Los ovocitos dentro de cada parte representarán el 10% del volumen como se destaca en la Figura 6A, donde un ovario intacto muestra ovocitos en la mitad superior del ovario clasificados por cinco colores diferentes con cada color representando ovocitos dentro de una región volumétrica del 10%.
6. Registre los números de ovocitos en cada región del 10% como se muestra en la Figura 6A, B. Calcule el número promedio de ovocitos para incrementos de 10, 20, 30, 40 y 50%.
7. Utilice lo resaltado en los pasos 11.1 a 11.6 para obtener números de ovocitos en el ovario parcial dañado. Coloque el ovario dañado en la misma orientación que los ovarios intactos y estime el volumen/porcentaje faltante como se describió anteriormente.
8. Para estimar el número total de ovocitos en todo el ovario, agregue el número promedio de ovocitos calculado para un volumen similar al número obtenido del ovario parcial (Figura 6B).

La inmunotinción e imagen de todo el ovario permite la visualización y cuantificación de ovocitos o expresión de proteínas en ovarios en diferentes etapas de desarrollo utilizando la misma técnica y marcadores (Figura 3). Este protocolo fue desarrollado para un proyecto a gran escala en el que se requirió el análisis de ovarios en múltiples etapas y a partir de múltiples cepas de ratón. Aquí, presentamos los datos recopilados para la cepa C57BL6 / J, una cepa estándar para el análisis genético. La técnica presentada aquí es sencilla, los resultados se pueden obtener dentro de los 14-19 días (Figura 2D) y se pueden usar para ovarios de mujeres prenatales, prepúberes y puberales (Figura 1 y Figura 2A, B).

Este enfoque se utilizó para estudiar la dinámica de la pérdida de ovocitos que ocurre naturalmente durante la formación de la reserva ovárica de ovocitos. En muchos organismos, incluido el ratón, se cree que el número de ovocitos alcanza su punto máximo durante la vida fetal alrededor del momento en que los ovocitos entran en la meiosis ~ E13.5. El número de ovocitos disminuye debido al proceso aún no completamente comprendido de desgaste fetal de ovocitos (FOA) (de ~ E15.5 a E18.5), que se ha relacionado mecánicamente con la expresión del retrotransposón LINE-120,21. Se eliminan más ovocitos después de E18.5 a P0 debido a la eliminación de ovocitos anormales por un punto de control de calidad meiótica22,23. Para investigar estos procesos utilizando este protocolo, inmunoteñimos y tomamos imágenes de ovarios en diferentes etapas de desarrollo utilizando DDX4 y GCNA como marcadores de ovocitos como se muestra en la Figura 3.

Los ovocitos pequeños que expresan GCNA y DDX4 se ven desde E15.5 en adelante y representan ovocitos durante MPI o detenidos en dictyate dentro de los folículos primordiales. Los ovocitos en crecimiento más grandes con una fuerte expresión de DDX4 ya se detectan en los ovarios P2, donde probablemente representan la primera ola de folículos44. Se observa un número creciente de ovocitos más grandes en los ovarios P5 y P28. Las imágenes obtenidas por microscopía multifotónica (Figura 4A) se procesaron utilizando el software IMARIS y se realizó renderizado 3D para identificar ovocitos en crecimiento pequeños y más grandes en función de la señal gcna nuclear y el tamaño delineado por la señal DDX4 (Figura 4A y Video 1). Los ovocitos se contaron como se describe en el protocolo y los resultados se resumen en la Figura 4B. De acuerdo con estudios previos, observamos una pérdida significativa de ovocitos de E15.5 a E18.5 (~32%) y E18.5 a P2 (~24%). Para cuando las mujeres alcanzan la pubertad (P28), solo ~ 30% de los ovocitos presentes en E15.5 han sobrevivido.

Este método también se puede utilizar para observar las consecuencias de los tratamientos genotóxicos como la irradiación, que se ha demostrado que elimina por completo la reserva del folículo primordial en una semana 23,38,45. Una diferencia visual significativa es evidente entre todo el ovario tratado con radiación y el control no tratado en la Figura 3 (comparando los ovarios P28 de mujeres tratadas y no tratadas). En el ovario P28 sin exposición a la radiación, observamos dos poblaciones de ovocitos marcadas con DDX4; abundantes ovocitos pequeños en folículos primordiales (flecha cerrada); y ovocitos más grandes de varios tamaños que se encuentran típicamente en folículos en crecimiento (por ejemplo, primarios, secundarios y preantrales) (Figura 3). En contraste, el ovario de una hembra expuesta a 0.5Gy de radiación γ en P7 está completamente desprovisto de ovocitos pequeños en los folículos primordiales como se observó previamente en las secciones 2D. Curiosamente, solo los ovocitos más grandes de tamaño similar sobrevivieron a la radiación; estos pueden ser los folículos de primera onda que ya están creciendo en el ovario P7, ya que se sabe que son resistentes a la radiación46 (Figura 3, P28).

Además de la cuantificación del número de ovocitos, este protocolo se puede utilizar para la inmunotinción y los análisis cuantitativos de otras proteínas implicadas en el desarrollo de ovocitos. Por ejemplo, utilizamos anticuerpos contra la proteína LINE-1ORF1p, una proteína chaperona de unión al ARN, producida por retrotransposones LINE-1 (Figura 5). Se ha propuesto que el aumento en la abundancia de elementos LINE-1 de E15.5 a E18.5 cause la eliminación de ovocitos 20,21. De hecho, utilizando imágenes capturadas por multifotones y análisis de intensidad de señal en IMARIS, se observó que los niveles de LINE-1 ORF1p aumentaron significativamente en los ovocitos durante este tiempo, lo que se correlaciona con una caída significativa en el número de ovocitos como se muestra en la Figura 4B.

En circunstancias en las que una parte de un ovario está dañada o perdida, los ovarios de la misma cepa y etapa de desarrollo se pueden utilizar para estimar computacionalmente el número de ovocitos dentro de la región faltante como se muestra en la Figura 6. Los datos de los ovarios E15.5 se utilizaron para simulaciones para probar la precisión de las correcciones computacionales. Se puede estimar computacionalmente que los ovocitos en los ovarios con hasta un 30% de daño tisular tienen una desviación del ≤10% en comparación con los ovocitos en un ovario intacto, lo que sugiere que la tinción y el modelado de ovarios en 3D se pueden usar de manera efectiva para rescatar datos de tejidos preciosos. Las simulaciones realizadas con ovarios en E15.5 indican que la corrección de una pérdida del ≥30% resulta en una desviación significativa de los números reales (Figura 6C).

Figura 1: Disección y perfusión de ovarios de mujeres de etapas prenatales y postnatales. (A-C) La disección de ovarios de diferentes etapas requiere diferentes técnicas, que se representan esquemáticamente para complementar las descripciones en el video. (D) Los ovarios en el día postnatal 5 (P5) son mucho más pequeños que en P28, lo que requiere un protocolo de limpieza diferente como se describe en el protocolo. (E,F) La perfusión adecuada de los ovarios es importante para eliminar la tinción de fondo de los glóbulos rojos. Los tractos reproductivos y ovarios no perfundidos tienen un tono rosado, mientras que los órganos perfundidos se volverán blancos. Abreviatura: RI = tractos reproductivos no perfundidos. Las imágenes A-C fueron creadas con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Inmunotinción, limpieza e imágenes de ovarios enteros de ratón. (A) El diagrama de flujo representa los pasos compartidos y específicos para el protocolo de inmunotinción y limpieza para ovarios prenatales / prepúberes y puberales. (B) Los ovarios despejados se montan en una gota de solución de limpieza en medio de un pozo adhesivo intercalado entre dos deslizamientos de cubierta. Para la obtención de imágenes, las muestras montadas se colocan en una diapositiva de adaptador impresa en 3D. (C) Imágenes multifotónicas en escala de grises de ovarios no perfundidos vs. perfundidos, inmunoteñidos con el marcador de ovocitos DDX4, que muestran una mejor calidad de imagen y una menor tinción inespecífica después de la perfusión. La flecha cerrada indica un ovocito con una capa delgada de tinción citoplasmática DDX4 típica de los folículos primordiales, y las flechas abiertas muestran ovocitos más grandes dentro de los folículos en crecimiento. El asterisco indica autofluorescencia de los vasos sanguíneos. (D) Renders 3D a partir de imágenes confocales vs. multifotónicas de ovarios P5, inmunoteñidas con marcadores de ovocitos GCNA (verde) y DDX4 (magenta), mostrando una aberración esférica significativa de la microscopía confocal y prácticamente ninguna de multifotón. Barras de escala = 100 μm (C, D) y 50 μm (recuadros en D). Abreviaturas: GCNA = peptidasa ácida nuclear de células germinales; DDX4 = HELICASA DEAD-box 4. La imagen A se creó con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas renderizadas en 3D de ovarios de diferentes etapas del desarrollo. Representaciones 3D a partir de imágenes multifotónicas de ovarios de montura completa inmunoteñidos con GCNA (verde) y LINE-1 ORF1p (azul) o DDX4 (magenta), en ovarios prenatales y postnatales, respectivamente. Los canales individuales se presentan en escala de grises para mostrar señales nucleares y citoplasmáticas. Los cuadros blancos delinean regiones ampliadas en los recuadros inferiores izquierdos. Se muestran dos ovarios diferentes para P28. El ovario de la hembra no irradiada de control (arriba) contiene una gran población de ovocitos pequeños en folículos primordiales (ver recuadro). Por el contrario, el ovario de la hembra irradiado a P7 con 0,5 Gy de radiación γ (IR) está completamente desprovisto de ovocitos pequeños en los folículos primordiales (ver recuadro). La flecha cerrada indica un ovocito con una capa delgada de tinción citoplasmática DDX4 típica de los folículos primordiales, y las flechas abiertas muestran ovocitos más grandes dentro de los folículos en crecimiento. Barras de escala = 100 μm; 30 μm para recuadros P28; 10 μm para todos los demás recuadros. Los recuadros contienen vistas ampliadas de imágenes renderizadas en 3D generadas en IMARIS y pueden diferir ligeramente de las imágenes de bajo aumento debido a la perspectiva. Abreviaturas: No IR = control no irradiado; IR = irradiado a P7 con 0,5 Gy de γ-radiación; GCNA = peptidasa ácida nuclear de células germinales; DDX4 = HELICASA DE CAJA MUERTA 4; LINE-1 = elemento nuclear largo intercalado-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Procesamiento de imágenes, visualización 3D de ovocitos y resultados de cuantificación. (A) Los renders 3D de imágenes multifotónicas (izquierda) se procesaron en IMARIS utilizando el filtro gaussiano (centro) y los ovocitos de tamaños pequeños y grandes se identificaron utilizando la función de punto (derecha). Los ovarios P5 y P28 se muestran como ejemplo. Barras de escala = 100 μm (P5); 10 μm (recuadros P5); 300 μm (P28); 50 μm (recuadros P28). (B) Se cuantificaron ovocitos pequeños positivos para GCNA en ovarios de diferentes estadios utilizando características puntuales (arriba). Para ilustrar la disminución del número de ovocitos durante el desarrollo, se calculó el porcentaje promedio de ovocitos en cada etapa en comparación con el número promedio presente en la etapa más temprana contada en E15.5 (abajo). Tenga en cuenta la gran caída en el número de ovocitos de E15.5 a E18.5. Los datos se presentan como medias ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism y se analizaron mediante ANOVA unidireccional, y la importancia se determinó mediante la prueba de comparación múltiple post hoc de Bonferroni. * P ≤ 0,05; P ≤ 0,0001; ns >0.05. Abreviatura: GCNA = peptidasa ácida nuclear de células germinales; ns = no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Detección y cuantificación de la expresión de LINE-1 ORF1p en ovocitos fetales. (A) Las representaciones 3D de imágenes multifotónicas muestran la expresión line-1 ORF1p (azul) en ovocitos fetales E15.5 y E18.5 (marcados por GCNA verde). (B) Superficies 3D generadas en IMARIS utilizando imágenes de la fila superior en el panel A. (C) El análisis de intensidad de LINE-1 ORF1p muestra una mayor expresión de LINE-1 ORF1p por ovocito en E18.5 que en E15.5. Barras de escala = 100 μm; 10 μm (recuadros del panel A ); 30 μm (recuadros del panel B ). Los datos se presentan como medias ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism y se analizaron mediante la prueba t de Student, y la significación se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney. P ≤ 0,0001; ns >0.05. Abreviaturas: GCNA = peptidasa ácida nuclear de células germinales; LINE-1 = elemento nuclear largo intercalado-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Método para estimar el número total de ovocitos en muestras ováricas dañadas con corrección computacional. (A) Modelo de ovocitos E15.5 GCNA positivos (verdes) con cinco regiones del 10% resaltadas en rojo, azul, gris, magenta y marrón en un ovario intacto. Cada imagen sucesiva, después del ovario intacto, representa un ovario simulado con un 10% de regiones incrementales que faltan hasta un 50%. (B) Esquema del método computacional para estimar el número de ovocitos en la muestra dañada. (C) El número total de ovocitos en ovarios simulados se comparó con los números en los ovarios intactos originales (considerados 100%) y la diferencia se presenta como % de desviación. Simulación a partir de seis ovarios individuales con un volumen faltante del 10-50%. Barras de escala = 80 μm. Abreviatura: GCNA = peptidasa ácida nuclear de células germinales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Renderizado 3D y modelado 3D de ovocitos en ovarios P5. Haga clic aquí para descargar este video.

Tabla 1: Soluciones y buffers.

Figura suplementaria S1: Preferencias de adquisición de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Configuración de adquisición de imágenes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.