Artículo de método

Medición cuantitativa asistida por software del grosor óseo subcondral osteoartrítico

DOI:

10.3791/62973

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18 de marzo de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Harrington Laboratory for Molecular Orthopedics, Department of Orthopedic Surgery, University of Kansas Medical Center, 2Division of Sports Medicine, Department of Orthopedic Surgery, University of Kansas Medical Center, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo de metodología presenta un protocolo de medición cuantitativa asistido por software para cuantificar el grosor óseo subcondral histológico en articulaciones de rodilla osteoartríticas murinas y articulaciones normales de rodilla como controles. Este protocolo es altamente sensible al engrosamiento sutil y es adecuado para detectar cambios óseos subcondrales osteoartríticos tempranos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El engrosamiento óseo subcondral y la esclerosis son las principales características de la osteoartritis (OA), tanto en modelos animales como en humanos. Actualmente, la gravedad del engrosamiento histológico del hueso subcondral está determinada principalmente por sistemas de clasificación semicuantitativos basados en la estimación visual. Este artículo presenta un protocolo reproducible y de fácil ejecución para medir cuantitativamente el grosor del hueso subcondral en un modelo de ratón de OA de rodilla inducida por desestabilización del menisco medial (DMM). Este protocolo utilizó el software ImageJ para cuantificar el grosor del hueso subcondral en imágenes histológicas después de definir una región de interés en el cóndilo femoral medial y la meseta tibial médica donde el engrosamiento del hueso subcondral generalmente ocurre en la OA de rodilla inducida por DMM. Se utilizaron imágenes histológicas de las articulaciones de la rodilla con un procedimiento simulado como controles. El análisis estadístico indicó que el sistema de medición ósea subcondral cuantitativa recientemente desarrollado era altamente reproducible con bajas variabilidades intra e interobservadores. Los resultados sugieren que el nuevo protocolo es más sensible al engrosamiento óseo subcondral sutil o leve que los sistemas de clasificación visual ampliamente utilizados. Este protocolo es adecuado para detectar cambios óseos subcondrales osteoartríticos tempranos y progresivos y para evaluar la eficacia in vivo de los tratamientos de OA en concierto con la clasificación del cartílago de OA.

Introducción

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La artrosis (OA), caracterizada radiográficamente por el estrechamiento del espacio articular debido a la pérdida de cartílago articular, osteofitos y esclerosis del hueso subcondral (SCB), es la forma más común de artritis1,2. Aunque el papel del hueso periarticular en la etiología de la OA no se entiende completamente, generalmente se cree que la formación de osteofitos y la esclerosis SCB son los resultados del proceso de la enfermedad en lugar de factores causales, pero los cambios en la arquitectura / forma y biología del hueso periarticular pueden contribuir al desarrollo y progresión de OA3,4 . El desarrollo de un sistema de clasificación de OA preciso y fácil de ejecutar, incluida la medición de SCB, es fundamental para los estudios comparativos entre laboratorios de investigación y para evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos diseñados para prevenir o atenuar la progresión de la OA.

SCB está construido con una placa ósea delgada en forma de cúpula y una capa subyacente de hueso trabecular. La placa SCB es la lámina cortical, que se encuentra paralela e inmediatamente debajo del cartílago calcificado. Pequeñas ramas de vasos arteriales y venosos, así como nervios, penetran a través de los canales en la placa SCB, comunicándose entre el cartílago calcificado y el hueso trabecular. El hueso trabecular subcondral contiene vasos sanguíneos, nervios sensoriales, médula ósea y es más poroso y metabólicamente activo que la placa SCB. Por lo tanto, el SCB ejerce funciones de absorción de impactos y de apoyo y también es importante para el suministro de nutrientes del cartílago y el metabolismo en las articulaciones normales5,6,7,8.

El engrosamiento de SCB (en histología) y la esclerosis (en radiografía) son las principales características distintivas de la OA y las áreas de investigación clave de la fisiopatología de la OA. La medición del engrosamiento de SCB es un componente importante de las evaluaciones histológicas de la gravedad de la OA. La microrradiografía digital previamente informada para medir la densidad mineral de SCB en roedores9, así como la medición cuantitativa de SCB basada en micro-tomografía computarizada (micro-CT) en modelos de roedores de OA10,11,12,13 han mejorado nuestra comprensión de la estructura de SCB y el papel de los cambios de SCB en la fisiopatología de OA. El área y el grosor del SCB también se han cuantificado con diapositivas histológicas utilizando un sofisticado sistema informático con un software de histomorfometría ósea específico y costoso14. Sin embargo, los sistemas de clasificación de OA semicuantitativos basados en estimaciones visuales, incluida la clasificación de espesamiento SCB, se utilizan más ampliamente que la micro-TC en la actualidad porque los sistemas de clasificación son fáciles de usar, particularmente para la detección de numerosas imágenes histológicas. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de clasificación de OA existentes se centran principalmente en los cambios de cartílago15,16,17. Un método de clasificación de espesor de SCB osteoartrítico ampliamente utilizado que clasifica el engrosamiento de SCB como leve, moderado y severo es en gran medida subjetivo, y su confiabilidad no ha sido completamente validada15. Un protocolo de medición de espesor SCB osteoartrítico confiable y fácil de ejecutar paso a paso no está completamente desarrollado o no está estandarizado.

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo reproducible, sensible y fácilmente ejecutable para medir cuantitativamente el espesor de SCB en un modelo de ratón de OA. Nuestras rigurosas pruebas de medición y análisis estadístico demostraron que este protocolo de medición cuantitativa asistido por software ImageJ podría cuantificar el grosor de SCB en articulaciones de rodilla normales y osteoartríticas. El protocolo recientemente desarrollado es reproducible y más sensible a los cambios leves de SCB que los sistemas de clasificación visual ampliamente utilizados. Se puede utilizar para detectar cambios tempranos en el SCB osteoartrítico y para evaluar la eficacia in vivo de los tratamientos con OA en concierto con la clasificación del cartílago OA.

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Protocolo

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Todos los procedimientos de animales incluidos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Médico de la Universidad de Kansas, en cumplimiento con todas las leyes y regulaciones federales y estatales.

1. Creación de OA de rodilla en ratones

  1. Crear un modelo de ratón de OA de rodilla mediante desestabilización quirúrgica del menisco medial (DMM) descrito por Glasson et al.18 en 22 ratones BALB/c de tipo salvaje a las 10-11 semanas de edad. Realice una cirugía simulada como procedimiento de control en ocho ratones con el mismo fondo y edad.
    NOTA: Ambos sexos se utilizaron para que el proyecto original cumpliera con el requisito de los NIH de considerar el sexo como una variable biológica, aunque el examen de la diferencia de sexo no es el alcance de este protocolo.
  2. Anestesiar a los animales por inhalación de Isoflurano. Verifique la profundidad de la anestesia monitoreando su frecuencia respiratoria / esfuerzo y la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie / cola. Coloque a los animales en posición supina.
  3. Afeitar la piel en el área de la rodilla y limpiar la piel con Povidona-Yodo + exfoliante de piel con alcohol; tres ciclos alternos.
  4. Realice el procedimiento DMM en la rodilla derecha bajo un microscopio quirúrgico. Exponga la articulación de la rodilla a través de una incisión parapatelar medial (1,2-1,5 cm de longitud) e incise la cápsula articular. Mantenga la rótula y el tendón rotuliano intactos. Después de una exposición cuidadosa del ligamento meniscotibial medial (MML) que ancla el menisco medial a la meseta tibial, transectarlo con tijeras microquirúrgicas para desestabilizar el menisco medial.
  5. Realizar una cirugía simulada en la rodilla derecha como procedimiento de control, en el que se visualizó la MML pero no se transectó.
  6. Cierre la cápsula articular con 8-0 suturas absorbibles de poliglactina e incisión en la piel con 7-0 suturas no absorbibles para DMM y procedimientos simulados para asegurar el uso adecuado de la rodilla una vez que se haya producido la curación.
  7. Inyecte SR buprenorfina (0.20-0.5 mg / kg) por vía subcutánea (SC) inmediatamente antes del procedimiento quirúrgico para la analgesia, que proporciona alivio del dolor hasta 72 h después de una sola inyección. Monitoree a los animales operados después de la cirugía.
  8. Sacrificar animales usando una cámara de CO2 a las 2, 8 y 16 semanas después de la cirugía. Después de la inconsciencia, confirme la muerte de los animales por un método físico (abrir la cavidad torácica). Estos métodos de eutanasia son consistentes con las recomendaciones del Panel sobre Eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA).
  9. Cosechar las articulaciones de la rodilla para análisis histológicos a las 2, 8 y 16 semanas después de la cirugía DMM y a las 2 y 16 semanas después de la cirugía simulada para obtener articulaciones de rodilla de ratón con diferentes grados de gravedad de OA o engrosamiento de SCB.

2. Preparación de secciones de tejido e imágenes histológicas

  1. Fije muestras de tejido articular de rodilla de ratón en paraformaldehído al 2%, descalcifique en ácido fórmico al 25%, incruste parafina y sección coronal para examinar los compartimentos medial y lateral.
  2. Corte las muestras de rodilla del lado posterior de la rodilla con un microtomo y recolecte secciones de tejido que tengan un grosor de 5 μm a intervalos de 70-80 μm para obtener aproximadamente 40 deslizamientos de tejido a través de toda la articulación de la rodilla. Una estimación asistida por micrómetros sugiere que los números de diapositivas 1-6 son de la parte posterior lejana, 11-18 de la parte media posterior, 23-30 de la parte media anterior y 35-40 de la porción lejana anterior de la articulación de la rodilla. Deseche o recoja las secciones intermedias para detectar manchas adicionales.
  3. Realice safranina-O y manchas verdes rápidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para identificar específicamente las células y matrices del cartílago en cada cinco diapositivas. Realizar tinción de hematoxilina-eosina de acuerdo con las instrucciones del fabricante para examinar las articulaciones de la rodilla a nivel celular y tisular como se describió anteriormente19,20,21,22.
  4. Adquiera imágenes histológicas con un microscopio equipado con una cámara digital. El análisis histopatológico general y la clasificación histológica de la OA se realizaron como se describió anteriormente15,19,20,21,22.

3. Medición cuantitativa del hueso subcondral osteoartrítico con el software ImageJ

  1. Descargue el software ImageJ y abra imágenes histológicas de interés.
    1. Descargue el ImageJ incluido con Java 1.8.0_172 desde https://imagej.nih.gov/ij/.
    2. Abra el programa ImageJ. Haga clic en la pestaña Archivo de la cinta de opciones y haga clic en la opción Abrir para abrir la imagen histológica.
    3. Busque la dirección del directorio de archivos, seleccione el archivo de imagen y haga clic en Abrir.
  2. Calibrar ImageJ con el micrómetro de las imágenes histológicas.
    1. Utilice la herramienta de línea recta para esbozar una unidad de longitud en el micrómetro y haga clic en Analizar > (a continuación) Establecer escala. Establezca la distancia conocida y la relación de aspecto de píxeles en 1 y haga clic en Aceptar. ImageJ puede convertir la longitud del píxel a la longitud de la unidad en micrómetro.
    2. Establezca el factor medido en área. Haga clic en Analizar > establecer medición y marque la casilla Área y límite al umbral en la nueva ventana. Este paso configura ImageJ para medir el parámetro "Área" dentro del "Umbral" seleccionado.
  3. Mida el área de interés del hueso subcondral total (SCB).
    1. Defina la región de interés (ROI) de SCB como se muestra en los cuadros naranjas de la Figura 1A, que cubre la placa cortical SCB y una porción del hueso trabecular subyacente adyacente a la placa cortical en el cóndilo femoral medial (MFC) y la meseta tibial medial (MTP) con dimensiones específicas para cada ROI. El engrosamiento osteoartrítico de SCB generalmente ocurre en estas áreas. Defina el ROI de SCB con la misma forma y dimensión en cada MFC o MTP para todas las articulaciones examinadas para garantizar que se midió el mismo tamaño del ROI específico para todos los animales.
    2. Esboce el contorno del área total de interés de SCB utilizando la herramienta de selección Polígono en la ventana principal de ImageJ.
      NOTA: Las herramientas de selección proporcionan al sistema un umbral para limitar el área medida.
    3. Medir el área total de SCB: una vez seleccionado el umbral, haga clic en Analizar > medir. Se abrirá una ventana de "Resultados" con medición de área.
  4. Mida el área de la sustancia ósea que contiene hueso sólido sin médula ósea.
    1. Haga clic en Editar > Borrar exterior para excluir el área fuera del área total de SCB.
      NOTA: Solo el área SCB total es visible después de hacer clic en la opción Borrar exterior . La imagen fuera del área total de SCB se volverá negra. Este paso permite a los observadores centrarse en el área de la sustancia ósea dentro del área de interés.
    2. Haga clic en Imagen > Ajustar > umbral de color para abrir la ventana "Color de umbral". Haga clic en Original en la parte inferior de la ventana "Color de umbral" para restaurar la imagen al estado original. Utilice las herramientas de selección del paso 3.3.2 para dibujar una caja pequeña en la región de la sustancia ósea. Haga clic en la opción Muestra en la parte inferior de la ventana "Color de umbral" para definir el área de sustancia ósea.
      NOTA: La opción "Muestra" en la ventana "Color de umbral" permite a ImageJ seleccionar todos los mismos píxeles en el área total de SCB que el área de muestra de sustancia ósea. El área de la sustancia ósea seleccionada se volverá roja.
    3. Haga clic en Seleccionar en la parte inferior de la ventana de equilibrio de color de umbral para crear un umbral de medición de área. Haga clic en Analizar > medir en el menú principal de ImageJ y el resultado de la medición del área de sustancia ósea se mostrará en la ventana "Resultados".
    4. Guarde los datos del área total de SCB y el área de sustancia ósea.
  5. Calcule la relación entre el área de sustancia ósea (mm2) y el área total de SCB (mm2) de interés que representa el grosor de la sustancia ósea (mm2/ 1.0 mm2) dentro del área total de SCB.
  6. Mida el grosor del SCB de las secciones/imágenes histológicas (como se describe en los pasos 3.1-3.5) de las áreas far-posterior, media-posterior, media-anterior y far-anterior (como se describe en el paso 2.2) de la OA inducida por DMM para evaluar el grosor de SCB específico del área de 6 articulaciones de la rodilla (Figura 1B).
    NOTA: Esto puede validar la fiabilidad de este protocolo de medición cuantitativa porque se sabe que los cambios osteoartríticos de SCB se colocalizan con lesiones de cartílago y que el daño del cartílago osteoartrítico con engrosamiento de SCB es más severo en las áreas de soporte de peso (porción media) de las articulaciones de rodilla de roedores14,15. Por lo tanto, es apropiado utilizar secciones medias para la medición cuantitativa del engrosamiento osteoartrítico de SCB.

4. Estadísticas

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando datos de medición cuantitativa y clasificación visual del espesor de SCB. Determinar la variabilidad y reproducibilidad entre e intraobservadores mediante los análisis del coeficiente de correlación de Pearson.
  2. Determinar la importancia de las diferencias entre los grupos de estudio utilizando las pruebas t de Student o ANOVA unidireccional, seguidas de una prueba post-hoc (Tukey) utilizando software de hoja de cálculo. Considere que un valor p de menos de 0,05 es estadísticamente significativo.

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Resultados

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Comparación de reproducibilidad entre la clasificación de estimaciones visuales y la medición cuantitativa asistida por ImageJ:
El grosor de SCB en 48 regiones de interés (ROI) (24 MFC y 24 MTP), definido a partir de una sección media de cada rodilla de 24 rodillas/animales, fue calificado por tres individuos independientes utilizando el esquema de puntuación visual 0-3 existente como se describe en la literatura15,23, donde 0 = engrosamiento ...

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Discusión

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La medición del engrosamiento de SCB es un componente importante de las evaluaciones histológicas de la gravedad de la OA. La mayoría de los sistemas de clasificación de OA existentes se centran principalmente en los cambios de cartílago15,16,17. Un método de clasificación de espesor SCB osteoartrítico murino ampliamente utilizado que clasifica el engrosamiento SCB como leve, moderado y severo es en gran medida subjetivo, y su c...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no hay conflictos de intereses en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R01 AR059088, el Departamento de Defensa (DoD) bajo el número de premio de investigación W81XWH-12-1-0304, y el Mary and Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Safranin-OSigma-AldrichS8884
Fast greenSigma-AldrichF7252
HematoxylinSigma-AldrichGHS216
EosinSigma-AldrichE4382
illustratorAdobeNo aplicable

Referencias

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