Artículo de método

Optimización del modelo de ratón de oclusión de venas retinianas para limitar la variabilidad

DOI:

10.3791/62980

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6 de agosto de 2021

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1Department of Pathology & Cell Biology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Department of Neurology; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 4The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain; Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un protocolo optimizado para la oclusión de la vena retiniana utilizando rosa de bengala y un sistema de microscopio de imágenes de retina guiado por láser con recomendaciones para maximizar su reproducibilidad en cepas modificadas genéticamente.

Resumen

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Los modelos de ratón de oclusión de la vena retiniana (OVR) se utilizan a menudo en oftalmología para estudiar la lesión hipóxico-isquémica en la retina neural. En este informe, se proporciona un método detallado que señala los pasos críticos con recomendaciones de optimización para lograr tasas de oclusión consistentemente exitosas en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente. El modelo de ratón RVO consiste principalmente en la administración intravenosa de un colorante fotosensibilizador seguido de fotocoagulación con láser utilizando un microscopio de imágenes de retina conectado a un láser guiado oftálmico. Se identificaron tres variables como determinantes de la consistencia de la oclusión. Al ajustar el tiempo de espera después de la administración de rosa de bengala y equilibrar la línea de base y la salida experimental del láser, la variabilidad entre los experimentos puede ser limitada y se puede lograr una mayor tasa de éxito de oclusiones. Este método se puede utilizar para estudiar enfermedades de la retina que se caracterizan por edema retiniano y lesión hipóxico-isquémica. Además, como este modelo induce lesión vascular, también se puede aplicar para estudiar la neurovasculatura, la muerte neuronal y la inflamación.

Introducción

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La oclusión de la vena retiniana (OVR) es una enfermedad vascular retiniana común que afectó a aproximadamente 28 millones de personas en todo el mundo en 20151. La OVR conduce a la disminución y pérdida de la visión en adultos en edad laboral y ancianos, lo que representa una enfermedad continua que amenaza la vista y que se estima que aumentará durante la próxima década. Algunas de las distintas patologías de la OVR incluyen lesión hipóxico-isquémica, edema retiniano, inflamación y pérdida neuronal2. Actualmente, la primera línea de tratamiento para este trastorno es a través de la administración de inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Si bien el tratamiento anti-VEGF ha ayudado a mejorar el edema retiniano, muchos pacientes aún enfrentan una disminución de la visión3. Para comprender mejor la fisiopatología de esta enfermedad y probar posibles nuevas líneas de tratamiento, es necesario constituir un protocolo funcional y detallado de modelo de ratón RVO para diferentes cepas de ratones.

Se han desarrollado modelos de ratón implementando el mismo dispositivo láser utilizado en pacientes humanos, junto con un sistema de imágenes escalado al tamaño correcto para un ratón. Este modelo de ratón de RVO fue reportado por primera vez en 20074 y establecido por Ebneter y otros 4,5. Finalmente, el modelo fue optimizado por Fuma et al. para replicar manifestaciones clínicas clave de la OVR, como el edema retiniano6. Desde que se informó por primera vez del modelo, muchos estudios lo han empleado utilizando la administración de un tinte fotosensibilizador seguido de fotocoagulación de las principales venas de la retina con un láser. Sin embargo, la cantidad y el tipo de tinte que se administra, la potencia del láser y el tiempo de exposición varían significativamente entre los estudios que han utilizado este método. Estas diferencias a menudo pueden conducir a una mayor variabilidad en el modelo, lo que dificulta su replicación. Hasta la fecha, no hay estudios publicados con detalles específicos sobre posibles vías para su optimización.

Este informe presenta una metodología detallada del modelo de ratón RVO en la cepa C57BL / 6J y una cepa knockout endotelial 9 inducible por tamoxifeno (iEC Casp9KO) con un fondo C57BL / 6J y de relevancia para la patología RVO como cepa de referencia para un ratón modificado genéticamente. Un estudio previo había demostrado que la activación no apoptótica de la caspasa-9 endotelial instiga el edema retiniano y promueve la muerte neuronal8. La experiencia con esta cepa ayudó a determinar y proporcionar información sobre posibles modificaciones para adaptar el modelo de ratón RVO, que puede ser aplicable a otras cepas modificadas genéticamente.

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Protocolo

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Este protocolo sigue la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los experimentos con roedores fueron aprobados y monitoreados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Columbia.

NOTA: Todos los experimentos utilizaron ratones machos de dos meses de edad que pesaban aproximadamente 20 g.

1. Preparación y administración de tamoxifeno para la ablación genética inducible de genes floxed

NOTA: El diámetro de los vasos retinianos puede verse afectado por el peso del animal. Asegúrese de que todos los animales utilizados para un experimento tengan pesos similares.

  1. Diluir tamoxifeno en aceite de maíz a una concentración de 20 mg / ml.
    NOTA: El tamoxifeno es un tóxico y es sensible a la luz. Protéjase de la luz, por ejemplo, con papel de aluminio.
  2. Vórtice la solución durante un par de segundos.
  3. Dejar en el horno a 55 °C durante 15 min.
    NOTA: Asegúrese de que el tamoxifeno se haya disuelto completamente. Puede ser necesario un vórtice adicional.
  4. Conservar la solución a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
  5. Use una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 g para la inyección de tamoxifeno. Limpie el área de inyección con etanol al 70%.  Administrar 2 mg de tamoxifeno (100 μL de 20 mg/ml) por vía intraperitoneal (IP) una vez al día durante el tiempo establecido según la línea Cre inducible específica.
  6. Permita dos días de descanso para los animales antes de comenzar los experimentos.

2. Preparación de reactivos para fotocoagulación láser

  1. Rosa de bengala
    NOTA: La rosa de bengala es sensible a la luz. Almacenar en la oscuridad hasta su uso y preparar fresco para obtener mejores resultados.
    1. Prepare la rosa de bengala diluyéndola a 5 mg/ml en solución salina estéril y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    2. Prepare una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G con rosa de bengala.
  2. Ketamina/xilazina
    1. Diluir ketamina y xilazina en solución salina estéril en consecuencia para las siguientes concentraciones: ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg).
  3. Carprofeno
    1. Diluir el carprofeno a 1 mg/ml en solución salina estéril.
    2. Prepare una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 26 G con carprofeno.
  4. Solución salina estéril
    1. Prepare una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 26 g con solución salina estéril.

3. Configuración del láser

  1. Manipule suavemente el cable de fibra óptica y conéctelo a la caja de control láser y al adaptador láser del microscopio de imágenes de retina.
  2. Encienda la caja de la lámpara del microscopio de imágenes de retina.
  3. Encienda el equipo y abra el programa de imágenes.
  4. Ajuste el balance de blancos utilizando un trozo de papel blanco y colocándolo delante del ocular del ratón y haciendo clic en Ajustar en el programa de imágenes.
  5. Encienda la caja de control láser girando la llave y siguiendo las instrucciones en la pantalla de la caja de control láser.
    NOTA: El láser utilizado en este experimento es de clase 3B y puede causar daño ocular. Use gafas protectoras cuando opere el láser.
  6. Verifique la potencia láser de referencia.
    1. Utilice un medidor de potencia láser.
    2. Ajuste la pantalla de la caja de control láser a los siguientes parámetros: 50 mW y 2.000 ms.
    3. Encienda el láser y coloque el medidor de potencia delante del ocular.
      NOTA: Asegúrese de que la luz del microscopio esté apagada mientras prueba la potencia láser de referencia.
    4. Presione el pedal del pedal para activar el láser.
    5. Apunte a que la lectura de potencia del láser sea de 13-15 mW.
      NOTA: La lectura de potencia del láser determinará la tasa de éxito de las oclusiones de las venas retinianas. Si la lectura de potencia del láser es demasiado baja, se pueden realizar ajustes en la potencia y el tiempo de exposición al láser. Véanse las recomendaciones en el cuadro 1 .
  7. Ajuste la potencia del láser experimental configurando la pantalla de la caja de control láser para los siguientes parámetros: 100 mW, 1.000 ms.
  8. Apague el láser.
    NOTA: Por seguridad y para evitar el sobrecalentamiento, es mejor mantener el láser apagado entre ratones.

4. Inyección de rosa bengala en la vena de la cola del ratón

  1. Vierta 300 ml de agua en un vaso de precipitados de 500 ml.
  2. Caliente el vaso de precipitados en un horno de microondas durante 1 min.
  3. Ponga una gasa en el agua tibia en el vaso de precipitados.
  4. Coloque el ratón en un retenedor.
  5. Presione la gasa en la cola del ratón suavemente y busque las venas dilatadas. Desinfecte el lugar de la inyección con una toallita con alcohol después de la dilatación con agua tibia.
  6. Inserte la aguja en el lugar de la inyección y tire de la jeringa para asegurarse de que está en la vena. Luego, inyecte la vena de la cola del ratón, administrando la cantidad correcta de acuerdo con el peso del animal (37.5 mg / kg). Aplique presión en el lugar de la inyección para evitar hematomas o sangrado. Limpie el sitio.
  7. Suelte el ratón del sistema de sujeción y devuélvalo a la jaula.
  8. Deje que circulen 8 minutos para que la rosa de bengala circule antes de la inyección de anestésicos.
    NOTA: Esto proporcionará un total de 10 minutos entre la inyección de rosa de bengala y la irradiación láser.

5. Oclusión de las venas principales

  1. Encienda la plataforma del ratón con calefacción.
  2. Agregue una gota de fenilefrina y tropicamida en cada ojo.
  3. Inyectar 150 μL de los anestésicos, ketamina (80-100 mg/kg) y xilazina (5-10 mg/kg) IP.
    NOTA: Durante este procedimiento, el ratón recibió dos inyecciones IP. Por lo tanto, los lados se alternaron. La inyección IP para la anestesia se administró en el cuadrante abdominal inferior derecho, y la solución salina se inyectó en el cuadrante abdominal inferior izquierdo. Se recomienda tirar de la jeringa antes de inyectarla para asegurarse de que la aguja esté en el abdomen y no en ningún órgano.
  4. Pellizque el dedo del pie al animal para determinar la profundidad de la anestesia y espere hasta que no responda.
  5. Agregue una gota de clorhidrato de proparacaína por ojo (analgésico).
  6. Agregue ungüento de gel a ambos ojos.
  7. Inyecte 150 μL de carprofeno por vía subcutánea entre las orejas.
  8. Coloque el ratón en la plataforma.
  9. Ajuste la plataforma hasta que la vista del fondo de la retina sea clara y enfocada.
  10. Cuente las venas de la retina y tome una imagen del fondo de ojo.
    NOTA: Las venas retinianas son más oscuras y anchas que las arterias. Las venas y las arterias se alternan; Sin embargo, a veces puede haber una arteria ramificada cerca del nervio óptico y, por lo tanto, dos arterias adyacentes.
  11. Encienda el láser y apunte hacia una vena retiniana a aproximadamente 375 μm del disco óptico.
  12. Irradiar el recipiente presionando el interruptor de pedal y moviendo ligeramente el rayo láser hasta 100 μm. Repita este paso tres veces y mueva el rayo láser después de cada pulso para que la irradiación no se enfoque en un punto.
  13. Repita la irradiación en otros vasos principales para lograr 2-3 oclusiones.

6. Establecer el número de venas ocluidas en el día 0

  1. Apague la lámpara después de irradiar los recipientes y espere 10 minutos.
    NOTA: La exposición a la luz puede causar daño e inflamación en la retina; Apague la lámpara durante el tiempo de espera para minimizar la exposición7.
  2. Vuelva a encender la lámpara y cuente el número de venas ocluidas.
  3. Tome una imagen del fondo de ojo.

7. Cuidados posteriores

  1. Inyecte 1 ml de solución salina IP estéril.
    NOTA: Consulte los detalles de la inyección IP en la sección 5, paso 3.
  2. Agregue gotas oftálmicas lubricantes en ambos ojos.
  3. Agregue ungüento de gel a ambos ojos.
  4. Observe al ratón mientras se recupera de la anestesia y no lo devuelva a la jaula con los otros animales hasta que esté completamente recuperado. El carprofeno (5 mg/kg) se puede administrar diariamente hasta 2 días después del procedimiento. Si se aplica a los seres humanos, el dolor no es un síntoma de RVO.
    NOTA: No deje a los animales desatendidos hasta que se recuperen completamente de la anestesia.

8. Evaluación del edema retiniano mediante tomografía de coherencia óptica (OCT)

NOTA: Este paso se puede realizar en el momento de interés del investigador. El pico de edema retiniano para un ratón C57BL / 6J es 1 día después del procedimiento RVO. Este punto de tiempo puede variar dependiendo del fondo del mouse.

  1. Encienda la caja de luz del microscopio de imágenes de retina, la máquina OCT y la plataforma de ratón calentado.
  2. El día después de la oclusión, siga los pasos 5.2 a 5.7 para preparar al animal.
  3. Abra los programas de software de creación de imágenes y OCT.
  4. En el programa OCT, ajuste el empujón a 5.
  5. Tome OCT a 75 μm distal de la quemadura o 4 clics.
  6. Tome imágenes de OCT en cuatro cuadrantes de la retina.
  7. Analice las imágenes de OCT con el software de rastreo.
  8. Compare el grosor retiniano de las medidas preirradiadas con 1 día después de la OVR o en el momento de interés.
    NOTA: Al analizar los datos, tenga en cuenta el número de venas irradiadas, ya que esto puede influir en el desarrollo de edema retiniano. Luego, los animales son sacrificados mediante la administración de anestesia seguida de cirugía de no supervivencia por perfusión.

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Resultados

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El modelo de ratón RVO tiene como objetivo lograr con éxito oclusiones en las venas retinianas, lo que lleva a la lesión hipóxico-isquémica, ruptura de la barrera retiniana sanguínea, muerte neuronal y edema retiniano8. La Figura 1 muestra una línea de tiempo de pasos para garantizar la reproducibilidad, un esquema del diseño experimental y describe los pasos que se pueden optimizar aún más dependiendo de las preguntas experimentales. Los tres pasos principales que se...

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Discusión

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El modelo RVO de ratón proporciona una vía para comprender mejor la patología de RVO y probar posibles terapias. Si bien el modelo RVO del ratón se usa ampliamente en el campo, existe la necesidad de un protocolo detallado actual del modelo que aborde su variabilidad y describa la optimización del modelo. Aquí, proporcionamos una guía con ejemplos de la experiencia sobre lo que se puede alterar para obtener los resultados más consistentes en una cohorte de animales experimentales y proporcionar datos confiables.

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (a CCO), el Instituto Nacional del Ojo (NEI) 5T32EY013933 (a AMP) y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) R21AG063012 (a CMT).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CarprofenoRimadylNADA #141-199mantener a 4 & deg; C
Aceitede maíz Sigma-AldrichC8267
Cable de conexión de fibraThor LabsM14L02
GenTealAlcon00658 06401
Clorhidrato de ketaminaHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
LasercheckCoherente1098293
FenilefrinaAkornNDCL174478-201-15
Phoneix Micron IV con Meridian,  StreamPix, y módulos OCTPhoenix Technology Group
Clorhidrato de proparacaínaAkornNDC: 17478-263-12mantener en 4 ° C
RefreshAllergan94170
Rosa BengalaSigma-Aldrich330000-5G
TamoxifenoSigma-AldrichT5648-5G
TropicamidaAkornNDC: 174478-102-12
XilacinaAkornNDCL 59399-110-20
sensible a la luz

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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