Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila

Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. Durante más de 100 años, los neurocientíficos han estado tratando de comprender cómo las neuritas se extienden hacia sus objetivos intermedios y finales con extrema precisión. Como resultado, han identificado genes importantes que codifican señales de guía para el desarrollo de procesos neuronales¹. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que las neuronas receptoras olfativas (ORN, las neuronas sensoriales primarias) se proyectan a 50 glomérulos identificables con tamaño, forma y posición relativa estereotipados, donde forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN), cada una de las cuales envía dendritas a uno de los 50 glomérulos² (Figura 1A ). Por lo tanto, es relativamente fácil identificar fenotipos mutantes a resolución sináptica (glomerular) en el sistema olfativo de la mosca. Esto llevó a descubrimientos de genes importantes que regulan el ensamblaje del circuito olfativo³.

El ensamblaje del circuito olfativo de la mosca se basa en procesos de desarrollo coordinados temporal y espacialmente³. Los ORN y los PN adquieren destinos celulares distintos, que configuran el programa para sus especificidades de cableado. A continuación, las dendritas PN prepatronan el lóbulo antenal (Figura 1B). Los axones de los ORN luego circunnavegan el lóbulo antenal ipsilateral y cruzan la línea media del cerebro para llegar al lóbulo antenal contralateral. Posteriormente, los axones ORN invaden los lóbulos antenales ipsi- y contralaterales y forman sinapsis con dendritas de sus compañeros PNs en glomérulos específicos. Este modelo grueso para el ensamblaje de circuitos olfativos se propuso a partir de la caracterización de muestras fijas a partir de puntos de tiempo intermedios durante el desarrollo. La mala resolución temporal y la incapacidad de seguir los mismos procesos neuronales a través del desarrollo a partir de tejido fijo limitan la comprensión mecanicista del proceso de ensamblaje del circuito.

Es técnicamente difícil vivir los procesos orn y PN in vivo, ya que el proceso de cableado ocurre en la primera mitad de la etapa pupal cuando el lóbulo antenal está rodeado por un cuerpo de grasa opaco dentro de la caja pupal. Por lo tanto, es imposible obtener imágenes directas del circuito olfativo en desarrollo a partir de pupas intactas. Los tejidos disecados cultivados ex vivo pueden eludir la opacidad tisular y se han utilizado con éxito para estudiar el desarrollo neuronal ^4,5,6. El desafío de usar una estrategia de cultivo de explante ex vivo similar para estudiar el cableado neuronal en el cerebro pupal es si recapitula la orientación neuronal precisa en una condición de cultivo. Sobre la base de una condición de cultivo ex vivo previamente informada para el complejo ojo de mosca-cerebro⁷, recientemente se ha desarrollado un explante que contiene todo el cerebro pupal, las antenas y los nervios antenales de conexión intactos, que conserva la orientación precisa del circuito olfativo y puede someterse a imágenes en vivo basadas en microscopía de dos fotones durante hasta 24 h a la frecuencia de cada 20 min⁸ . Aquí, se describe un protocolo detallado del cultivo de explante y las imágenes. El sistema de explante proporciona un método poderoso para estudiar el ensamblaje del circuito olfativo y potencialmente otros circuitos en el cerebro central.

1. Preparación de reactivos

NOTA: Todos los pasos de este protocolo se llevan a cabo a temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que se explique lo contrario.

1. Para preparar la placa de cultivo para inmovilizar el explante durante la toma de imágenes de lapso de tiempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espesor (mezcle bien dos componentes líquidos en una proporción de 10: 1 antes de usarla) en la superficie inferior de una placa de Petri de 60 mm x 15 mm y déjela curar durante 48 h a temperatura ambiente (Figura 2A, denominada placa Sylgard en el siguiente texto).
2. Para preparar micro pines para inmovilizar el explante en esta placa, use un par de pinzas para pegar múltiples micro pines en una cinta con los extremos afilados alineados en un lado (Figura 2B). Use un par de tijeras para cortar ~ 2 mm de los extremos afilados de los micro pines (Figura 2B'). Use pinzas para sujetar los micro pasadores cortados e insértelos en la capa de Sylgard de una placa de Sylgard prefabricada (Figura 2C). Se utilizan dos micro pines para inmovilizar un explante.
3. Use un cepillo para recolectar pupas blancas, que forman pupario dentro de 1 h, de hsFLP, guijarros-GAL4 / +; UAS-FRT^100-stop-FRT 100-mCD8-GFP ⁸ genotipo y transferirlos a nuevos viales. Choque térmico en un baño de agua a 37 °C durante 40 min para inducir clones de ORN dispersos de tipos aleatorios. Después del choque térmico, coloque los viales a 25 ° C durante 30 h, lo que resulta en pupas envejecidas a las 30 h después de la formación de pupario (APF).
4. Para preparar el medio de cultivo para el explante, agregue 5 ml de penicilina-estreptomicina (10,000 U / ml) a 500 ml de Drosophila Medium de Schneider. Filtra el medio y haz alícuotas de 45 mL en tubos cónicos de 50 mL. El medio se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 meses.
5. El día de la obtención de imágenes, tome un tubo de 45 ml del medio Drosophila de Schneider y agregue 5 ml de suero fetal bovino (10% v / v), 125 μL de solución madre de insulina humana de 4 mg / ml (concentración final de 10 μg / ml), 50 μL de solución madre de 20 mg / ml de 20-hidroxiecdisona disuelta en etanol (concentración final de 1 μg / ml). Mezcle bien y transfiera 15 ml de medio completo en un nuevo tubo cónico de 50 ml. El resto del medio completo se puede almacenar a 4 °C durante una semana. El suero fetal bovino, la solución madre de insulina humana y la solución madre de 20-hidroxiecdisona se alicitan y almacenan a -20 °C.
6. Oxigenar el medio completo de 15 ml bombeando burbujas de oxígeno desde un cilindro de oxígeno debajo de la superficie del líquido a través de una punta de pipeta estéril de 5 ml a razón de una burbuja / s durante 20-30 min. Use una película de parafina para cubrir la abertura del tubo durante este proceso.
7. Esterilizar la superficie del pozo de disección y la placa Sylgard (con micro pines insertados en la capa Sylgard, preparados en los pasos A1 y A2) con etanol al 70%. Déjalos secar antes de usarlos.

2. Disección de explantes

1. Use un cepillo para transferir 30 h de pupas APF (30 h después de la formación del pupario) a un pañuelo de papel y seque la superficie externa de las pupas durante 5 minutos.
2. Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio. Coloque cuidadosamente las pupas secas en la superficie pegajosa de la cinta con el lado dorsal hacia arriba. Presione suavemente las pupas con un cepillo para ayudar a que el lado ventral de las pupas se adhiera bien a la cinta (Figura 3A). No dañe la pupa.
3. Use un par de fórceps para quitar la caja de pupa marrón que cubre el lado dorsal de la cabeza (Figura 3A, B). Inserte una punta afilada de los fórceps entre la caja de pupa marrón y la pupa del lado lateral y rompa cuidadosamente la caja de pupa marrón a través de una línea hasta el extremo posterior de la pupa (Figura 3B, C). Abra la caja de pupa marrón. Use un par de fórceps para sostener suavemente la pupa y transferirla al pozo de disección con 1 ml de medio completo oxigenado. Sumergir la pupa flotante en la superficie media para ayudar a que se hunda hasta el fondo del pozo (Figura 3D).
   NOTA: No inserte la punta de los fórceps demasiado profundamente dentro de la caja de pupa marrón para evitar lesionar la pupa con las pinzas.
4. Para diseccionar el explante antena-cerebro de la pupa, use fórceps para sostener suavemente la pupa con una mano y use un par de microscisoras para cortar un pequeño agujero desde el lado posterior de la pupa con la otra mano (Figura 3E). Este pequeño orificio libera la alta presión dentro de la pupa.
5. Corte a través de la línea media ventral de la pupa desde el orificio hasta el cuello (la estructura estrecha que conecta la cabeza y el tórax) con las microescisoras (Figura 3F). Luego, corte a través de la circunferencia del cuello para separar la cabeza del cuerpo de la pupa (Figura 3G). Retire el cuerpo y colóquelo en un pozo diferente.
   NOTA: No corte el cuello directamente desde el lado dorsal / ventral de la pupa, que puede apretar el cerebro.
6. Cortar la cutícula transparente que cubre el lado dorsal del cerebro (Figura 3H). Esto expondrá el cuerpo gordo en la parte superior del cerebro. Mantenga un poco de cutícula a la que se unen la retina y las antenas. Repita el mismo procedimiento en el lado ventral del cerebro.
   NOTA: No inserte la hoja de las tijeras demasiado profundamente debajo de la cutícula, ya que esto causará la ruptura de los nervios antenales que conectan las antenas y el cerebro (Figura 3H').
7. Use una pipeta P10 para lavar suavemente el cuerpo graso que cubre el cerebro y las antenas mediante el pipeteo del medio hacia las regiones abiertas en los lados dorsal y ventral de la cabeza (Figura 3I).
   NOTA: Sea muy suave al pipetear el medio, ya que el cerebro puede desprenderse fácilmente de la cutícula. Asegúrese de que todo el cuerpo graso se elimine durante este paso. Se observó un desarrollo detenido de los axones ORN cuando el cuerpo graso no se limpió bien, probablemente debido al acceso deficiente al oxígeno del medio.
8. Para estudiar la interacción de los axones ORN bilaterales o axones ORN con la orientación de dendritas PN, corte uno o dos nervios antenales con las microescisoras durante esta etapa⁸ (Figura 3J). Coloque cuidadosamente las cuchillas de las tijeras entre la cutícula y el cerebro y corte los nervios antenales interesados.
9. Para transferir el explante diseccionado a la placa de Sylgard, coloque una gota de medio completo oxigenado (~ 200 μL) en la superficie de Sylgard. Cubra la superficie interna de una punta de pipeta de punta ancha de 200 μL con el cuerpo graso del tronco diseccionado (paso 1.6) pipeteando el cuerpo graso varias veces, lo que evita que los explantes peguen la punta de la pipeta durante la transferencia. Luego, use esta punta de pipeta de punta ancha para transferir el explante del pozo de disección a la gota mediana en la placa de cultivo (Figura 3K).
10. Use fórceps para fijar el explante en la capa de Sylgard en los dos lóbulos ópticos (Figura 3L). Coloque cuidadosamente la placa Sylgard en la estación de imágenes e inmovilice la placa con cintas. Agregue lentamente 10 ml de medio completo oxigenado a la placa Sylgard usando pipeta P1000.
    NOTA: Evite interrumpir el explante al agregar el medio a la placa Sylgard.

3. Imágenes en vivo basadas en microscopía de dos fotones

1. Para realizar imágenes de lapso de tiempo, utilice un microscopio de dos fotones, un láser Ti:Sapphire, un objetivo de inmersión en agua 20x (1.0 NA) y un software de imágenes. Utilice la longitud de onda de excitación a 920 nm para obtener imágenes de proteínas GFP. Ajuste el tiempo de permanencia de píxeles a 10 μs.
2. Ajuste la posición de la estación de imagen para que los explantes estén aproximadamente debajo del objetivo. Use etanol al 70% para esterilizar la lente antes de obtener imágenes. Baje lentamente el objetivo bajo el medio cerca de los explantes. Compruebe si hay alguna burbuja en la lente del objetivo.
   1. Si es así, levanta el objetivo por encima del medio y repite esto hasta que la burbuja se haya ido. Encuentra los explantes usando el ocular y centra un explante en el campo.
3. Para garantizar un explante con unas pocas ORN escasamente etiquetadas para imágenes de lapso de tiempo, diseccione ~ 10 explantes cada vez y alinee en el eje y en la placa de cultivo. Evalúe todos los explantes moviendo el objetivo a lo largo del eje y elija un explante en el que unos pocos axones ORN individuales acaban de llegar al lóbulo antenal para obtener imágenes (Figura 4A).
   1. Reconocer el lóbulo antenal por su forma ovalada y los axones ORN que están empezando a circunnavegarlo. Imagine un área de ~150 μm x 150 μm en el plano xy (zoom 3x con el objetivo 20x). Estimar el límite de los dos lóbulos antenales y centrarlos en el área de imágenes.
4. Seleccione una región de imagen inicial a lo largo del eje z definiendo la sección inferior y la sección superior del escaneo. Configure el área de imágenes a lo largo del eje z. Establezca la sección más profunda con señales de axón ORN como la primera sesión de imágenes y la sesión 100 μm por encima (lado más superficial) como la última sesión de imágenes (Figura 4B).
   NOTA: Esto deja algunas secciones en la parte superior (lado superficial) de los axones ORN y evita el desplazamiento de los axones ORN hacia arriba fuera del área de imágenes debido al crecimiento del cerebro durante el cultivo.
   1. Imagen a intervalos de 2 μm. Configure el escaneo automático de imágenes a la frecuencia de cada 20 minutos utilizando un software de imágenes.
5. Desplace la región de la imagen 20 μm hacia arriba a lo largo del eje z después de las primeras 4 h de imagen y otros 20 μm hacia arriba a lo largo del eje z después de la imagen de 16 h. Esto se puede lograr estableciendo un script y diferentes pilas z en el software de imágenes.
6. Cultive el explante durante un período adicional después de la obtención de imágenes (hasta 24 h ex vivo) antes de la fijación y tinción con N-cadherina, un marcador neuropil, para revelar la identidad genética de cada ORN por el glomérulo al que se dirige.

4. Procesamiento de imágenes

1. Para procesar imágenes de pila z de series de secciones tomadas en cada punto de tiempo utilizando el software Fiji, abra la serie de secciones de imágenes, haga clic en Imagen | Pilas | Proyecto Z [/].
2. Para corregir la deriva lateral de la muestra durante el cultivo, instale turboReg Plugin en Fiji.
   1. Abra una serie de imágenes de pila z y una sola imagen de pila z de la serie. Abrir plugins | | de registro TurboReg.
   2. Seleccione la serie de imágenes de pila z en Origen y la imagen de pila z única en Destino | Traducción. Haga clic en el botón Lote para registrar todas las imágenes de la serie de imágenes de la pila z abierta.
3. Para maximizar la utilidad de las muestras con imágenes, separe los axones individuales escasamente etiquetados en las proximidades entre sí de las imágenes de la pila z siguiendo las secciones de imágenes 3D.
   1. Para extraer axones ORN individuales de unos pocos axones en la misma imagen, abra la serie de secciones de imágenes, haga clic en Plugins | Segmentación | Editor de segmentación [/]. Seleccione la herramienta de pincel y la máscara del axón ORN interesado en la ventana de trabajo del Editor de segmentación utilizando los botones Seleccionar "+" o "-" en cada sección de la imagen.
   2. Haga clic en proceso | Calculadora de imágenes [/]. Seleccione "Imagen X" en la Imagen 1, "Multiplicar" en Operación, "Imagen X. etiquetas" en la Imagen 2, [/]. Esto genera un nuevo archivo de serie de imágenes con el axón interesado solamente. Realice el paso 4.1 para procesar la imagen de la pila z. Repita este paso para todos los puntos de tiempo para generar un archivo de imagen de serie temporal.
4. Para pseudocolorear diferentes axones de la misma imagen, primero realice el paso 4.3 para generar el archivo de imagen de serie temporal de cada axón por separado. Abra los archivos de imagen de series temporales para diferentes axones individuales desde la misma imagen de datos sin procesar. Haga clic en el | de la imagen | de color Fusionar canales. Seleccione diferentes archivos de imagen de series temporales en diferentes canales de color y haga clic en Aceptar.

Los axones ORN llegan al lóbulo antenal entre 18 h y 36 h APF. Luego navegan por el lóbulo antenal, cruzan la línea media e inervan los glomérulos. El video 1 es un video representativo que muestra todo el proceso para varios axones identificables individualmente, tomados a la frecuencia de cada 20 minutos durante 24 h. Antes del registro con TurboReg, los axones exhiben cierta deriva lateral a medida que se desarrolla el cerebro (primera mitad del video). Después del registro, se corrige la deriva (segunda mitad del video).

Para separar algunos axones ORN del mismo explante, se muestra un ejemplo en la Figura 5. Siguiendo el procedimiento del paso 4.3, se extrajeron los axones VA1d y VA1v del explante que se muestra en la Figura 5A para generar una nueva imagen de pila z con solo estos dos axones (Figura 5B). Del mismo modo, se extrajeron los axones VM2 y VM3 (Figura 5B') y el axón DL2 (Figura 5B''). La Figura 5C muestra una combinación de imágenes en la Figura 5B-B'' con pseudocolores. Las identidades genéticas de cada axón ORN se revelaron mediante la inmunotinción de un marcador neuropil N-cadherina del explante fijo (Figura 5D,E).

Figura 1: Estructura del circuito olfativo de la mosca. (A) Una cabeza de mosca adulta se muestra con un ORN de las antenas derechas (verde) enviando su axón a ambos lóbulos antenales (AL) en el cerebro y formando conexión sináptica en un glomérulo específico con dendritas de PNs (rojo) en los ALpsilaterales y contralaterales. La línea vertical discontinua indica la línea media en este y en los diagramas e imágenes posteriores. (B) Diagrama que muestra el desarrollo del circuito olfativo. (1) Las dendritas PN primero inervan una región en el lóbulo antenal (rojo). Los axones ORN llegan a los lóbulos antenales en el cerebro. (2) Los axones ORN toman una trayectoria dorsolateral (verde) o ventromedial (azul) para circunnavegar el lóbulo antenal. (3) Los axones ORN cruzan la línea media. (4) Los axones ORN inervan glomérulos en el lóbulo antenal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación de la cámara de imagen para el explante. (A) Coloque una capa de elastómero de silicona (~ 0,5 cm) en la parte inferior de una placa de Petri de 60 mm. (B-B') Alinee los pasadores en una cinta y córtelos a ~ 2 mm de largo con un par de tijeras. (C) Fije los micro pines en la capa de elastómero de silicona de la placa de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El procedimiento de disección para el explante antena-cerebro. (A) Coloque el lado ventral de una pupa seca de papel en una cinta de doble cara en un portaobjetos de vidrio. (B-C) Use fórceps para cortar la cutícula marrón externa para exponer la pupa en el interior. (D) Transfiera la pupa a un pozo de disección con medio completo oxigenado. (E-G) Separe cuidadosamente el tronco pupal de la cabeza usando microscisores. (H) Cortar los trozos de cutícula semitransparente que cubren los lados dorsal y ventral del cerebro. Mantenga un poco de cutícula en los lados anterior y lateral del cerebro para retener las conexiones entre la retina, las antenas y el cerebro. (H') Evite cortar el nervio antenal durante este paso. (I) Limpie el cuerpo graso que cubre el cerebro mediante pipeteos suaves. (J) Cortar uno o dos nervios antenales usando microscisores en ciertos experimentos. (K) Coloque una gota de medio lleno oxigenado en la superficie de la placa de cultivo. Transfiera el explante diseccionado usando una punta de pipeta de punta ancha. (L) Use pinzas para fijar los dos lóbulos ópticos del explante en la capa de elastómero de silicona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes de lapso de tiempo de un solo axón ORN dirigido desde un explante. (A) Seleccione un explante con unos pocos axones ORN que acaban de llegar al lóbulo antenal. Estimar la forma de dos lóbulos antenales por la curvatura de los axones y centrar los lóbulos antenales en el campo de imágenes. (B) Establezca la región de imagen a lo largo del eje z. Considere que el lóbulo antenal se desplazará hacia arriba a medida que el cerebro crezca y se desarrolle. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Extraer ORN individuales y revelar sus identidades glomerulares. (A) Una imagen de proyección máxima de un explante con 5-10 axones ORN individuales utilizando microscopía de dos fotones con objetivo 20x y zoom 3x. (B-B'') Se extraen 1-2 axones individuales de (A) creando manualmente máscaras en secciones de imagen a partir de los datos de imagen sin procesar. (C) Fusionar las imágenes de (B-B'') con cada axón pseudo-coloreado de manera diferente. (D-D') Imágenes confocales de máxima proyección tomadas con objetivo 40x y zoom 1.5x. El explante mostrado en (A) fue fijo seguido de tinción con anti-GFP y anti-N-cadherina (marcador neuropil). Las mitades anterior y posterior de los lóbulos antenales se apilan por separado en (D) y (D'). (E) El mapa del lóbulo antenal muestra los axones ORN extraídos en (B, C). Algunas imágenes que se muestran en esta figura están modificadas a partir de un estudio previo8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Las imágenes de lapso de tiempo basadas en microscopía de dos fotones muestran la orientación de dos axones ORN, antes y después del registro de imágenes. Haga clic aquí para descargar este video.

Los autores no tienen nada que revelar.