Este protocolo describe el procedimiento de disección, la condición de cultivo y las imágenes en vivo de un sistema de explante antena-cerebro para el estudio del ensamblaje del circuito olfativo.
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Artículo de método
Un sistema de explante para estudios de imágenes de lapso de tiempo del ensamblaje de circuitos olfativos en Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que 50 tipos de neuronas receptoras olfativas (ORN) de las antenas y palpos maxilares proyectan sus axones a 50 glomérulos identificables en el lóbulo antenal y forman conexiones sinápticas con dendritas de 50 tipos de neuronas de proyección de segundo orden (PN). Estudios previos se centraron principalmente en identificar moléculas importantes que regulan la orientación precisa en el circuito olfativo utilizando tejidos fijos. Aquí, se describe un sistema de explante antena-cerebro que recapitula los hitos clave del desarrollo del ensamblaje del circuito olfativo en cultivo. A través de la disección de la cutícula externa y la limpieza de cuerpos grasos opacos que cubren el cerebro pupal en desarrollo, se pueden recopilar imágenes de alta calidad de neuronas individuales de cerebros vivos utilizando microscopía de dos fotones. Esto permite obtener imágenes de lapso de tiempo de un solo axón ORN dirigido desde tejido vivo. Este enfoque ayudará a revelar contextos biológicos celulares importantes y funciones de genes importantes previamente identificados e identificar mecanismos que sustentan el proceso dinámico de ensamblaje de circuitos.
Introducción
Las neuronas están interconectadas con precisión para formar circuitos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro. Durante más de 100 años, los neurocientíficos han estado tratando de comprender cómo las neuritas se extienden hacia sus objetivos intermedios y finales con extrema precisión. Como resultado, han identificado genes importantes que codifican señales de guía para el desarrollo de procesos neuronales1. El sistema olfativo de Drosophila proporciona un excelente modelo para investigar este proceso, ya que las neuronas receptoras olfativas (ORN, las neuronas sensoriales primarias) se proyectan a 50 glomérulos identif....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos
NOTA: Todos los pasos de este protocolo se llevan a cabo a temperatura ambiente (20-25 °C) a menos que se explique lo contrario.
- Para preparar la placa de cultivo para inmovilizar el explante durante la toma de imágenes de lapso de tiempo, coloque Sylgard de 0,5 cm de espesor (mezcle bien dos componentes líquidos en una proporción de 10: 1 antes de usarla) en la superficie inferior de una placa de Petri de 60 mm x 15 mm y déjela curar durante 48 h a temperatura ambiente (Figura 2A, denominada placa Sylgard en el siguiente texto).
- Para preparar mic....
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Resultados
Los axones ORN llegan al lóbulo antenal entre 18 h y 36 h APF. Luego navegan por el lóbulo antenal, cruzan la línea media e inervan los glomérulos. El video 1 es un video representativo que muestra todo el proceso para varios axones identificables individualmente, tomados a la frecuencia de cada 20 minutos durante 24 h. Antes del registro con TurboReg, los axones exhiben cierta deriva lateral a medida que se desarrolla el cerebro (primera mitad del video). Después del registro, se corrige la deriva (segu.......
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Discusión
El explante de antenas-cerebro de Drosophila conserva la orientación normal del circuito olfativo. Notamos que el desarrollo es 2 veces más lento ex vivo en comparación con in vivo. Se observa que el sistema de explante no retiene el palpo maxilar, que alberga seis tipos de ORN. Para garantizar que el desarrollo normal se recapite ex vivo, se debe evitar el estiramiento de los nervios antenales durante la disección del explante. Durante el cultivo ex vivo, el crecimiento de ba.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a N. Özel y R. Hiesinger por sus consejos sobre la cultura de explantes; M. Wagner para la ayuda técnica de la microscopía de dos fotones; D.J. Luginbuhl por generar moscas transgénicas; D. Friedmann para sugerencias de análisis de programas informáticos de Fiji; Y. Ge para asistencia en el trabajo de vuelo; C. McLaughlin y K.K.L. Wong por comentarios sobre el manuscrito. L.L. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud 1K99DC01883001 (a T.L.) y R01-DC005982 (a L.L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20-hidroxiecdisona | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Láser de zafiro | Coherente | Coherente MRU X1 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Insulina humana | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Software de imagen | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Pines Minutien | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Bombona de oxígeno | Praxair | OX M-E | |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific 15140122 | ||
| Schneider' s Drosophila Medio | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Elastómero de silicona | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Microscopía de dos fotones Objetivo de | Bruker | ||
| (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referencias
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neu....
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Reimpresiones y permisos
