Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

Anthos Christofides; Carol Cao; Rinku Pal; Halil I. Aksoylar; Vassiliki  A. Boussiotis

doi:10.3791/62985

Artículo de método

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

DOI:

10.3791/62985

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16 de noviembre de 2021

Anthos Christofides¹^,² , Carol Cao¹^,²^,³ , Rinku Pal¹^,² , Halil I. Aksoylar¹^,² , Vassiliki A. Boussiotis¹^,²

¹Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, ²Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, ³Harvard College

En este artículo

Resumen

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En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Resumen

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El tracto respiratorio está en contacto directo con el entorno exterior y requiere un sistema inmunológico regulado con precisión para proporcionar protección al tiempo que suprime las reacciones no deseadas a los antígenos ambientales. Los pulmones albergan varias poblaciones de células inmunes innatas y adaptativas que proporcionan vigilancia inmune, pero también median respuestas inmunes protectoras. Estas células, que mantienen el sistema inmunológico pulmonar sano en equilibrio, también participan en varias condiciones patológicas como el asma, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión selectiva de proteínas de superficie e intracelulares proporciona propiedades inmunofenotípicas únicas a las células inmunes del pulmón. En consecuencia, la citometría de flujo tiene un papel instrumental en la identificación de tales poblaciones celulares durante el estado estacionario y las condiciones patológicas. Este artículo presenta un protocolo que describe un método consistente y reproducible para identificar las células inmunes que residen en los pulmones de ratones sanos en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para identificar cambios en estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad para ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad en el panorama inmunológico pulmonar.

Introducción

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El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima ^pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206^....

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Protocolo

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Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo pautas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Beth Israel Deaconess. Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis a diez semanas de edad de ambos sexos para desarrollar este protocolo.

1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos

Eutanasiar al ratón inyectando intraperitonealmente 1 ml de tribromoetanol (preparado según protocolo estándar; Tabla de Materiales).
NOTA: La asfixia por _CO2 debe evitarse en los estudios pulmonares, ya que podría causar lesiones pulmonare....

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Resultados

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Estrategia de cierre
El primer paso de nuestra estrategia de cierre es la exclusión de los escombros y dobletes (Figura 1A). La exclusión cuidadosa de los dobletes es fundamental para evitar poblaciones falsamente positivas (Figura suplementaria S2). Luego, las células inmunes se identifican utilizando CD45⁺, un marcador para las células hematopoyéticas (Figura 1B). La mancha de muerto vivo se puede agregar para ex.......

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Discusión

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La identificación de las células inmunes pulmonares puede ser un desafío debido a los múltiples tipos de células inmunes que residen en el pulmón y sus características inmunofenotípicas únicas en comparación con sus contrapartes que residen en otros tejidos. En varias condiciones patológicas, las células con características fenotípicas distintas aparecen en los pulmones. Por ejemplo, la lesión pulmonar inducida por bleomicina resulta en el reclutamiento de macrófagos circulantes derivados de monocitos en el espacio alveo.......

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Divulgaciones

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V.A.B. tiene patentes sobre la vía PD-1 licenciadas por Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis y Dako. Los autores no declaran otros intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA238263 y R01CA229784 (VAB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Émbolo de jeringa de 10 mL	EXELINT	26265
Agujas de 18 G	Aguja BD Precision Glide	305165
Agujas de 21 g	Aguja BD Precision Glide	305195
Tubos cónicos de 50 mL	Falcon	3520
70 μ Filtro de células	ThermoFisher 22363548
placas de 96 pocillos	Falcon/corning	3799
ACK tampón de lisado	ThermoFisher	A10492-01
anti-ratón CD11b	Biolegend	101215	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
anti-ratón CD11c	Biolegend	117339 / 117337	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
anti-ratón CD45	Biolegend	103115	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
anti-ratón CD64	Biolegend	139319	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
anti-ratón CD68	Biolegend	137009	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
anti-ratón GR-1	Biolegend	108433	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
Siglec F	Biolegend	155503	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	Para más detalles, véase la Tabla 2
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	Para más detalles, véase la Tabla 2
CD24	Biolegend	138503	Para más detalles, véase la Tabla 2
CD3	Biolegend	100205	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
Centrífuga
Colagenasa Tipo 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	Para obtener más detalles, consulte la Tabla 2
DNasa I	Millipore Sigma 10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	Para más detalles, véase la Tabla 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	Para más detalles, véase la Tabla 2
Suero fetal bovino	R& D Systems
Pinzas dentadas finas	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Juego de tampones de tinción con factor de transcripción	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel Merit	Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	Para obtener más detalles, consulte la Tabla 2
MERTK	Biolegend	151505	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
MHC-II	Biolegend	107621	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
NK1.1	Biolegend	108705	Para obtener más información, consulte la Tabla 2
Agitador orbital	VWR	Modelo 200
Placa de Petri	Falcon	351029
Centrífuga de sobremesa refrigerada	SORVAL ST 16R
tijera curva pequeña	Roboz Surgical Instrument Co

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Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
Tan, S. Y., Krasnow, M. A.

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