En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino
En este artículo
Resumen
Resumen
El tracto respiratorio está en contacto directo con el entorno exterior y requiere un sistema inmunológico regulado con precisión para proporcionar protección al tiempo que suprime las reacciones no deseadas a los antígenos ambientales. Los pulmones albergan varias poblaciones de células inmunes innatas y adaptativas que proporcionan vigilancia inmune, pero también median respuestas inmunes protectoras. Estas células, que mantienen el sistema inmunológico pulmonar sano en equilibrio, también participan en varias condiciones patológicas como el asma, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión selectiva de proteínas de superficie e intracelulares proporciona propiedades inmunofenotípicas únicas a las células inmunes del pulmón. En consecuencia, la citometría de flujo tiene un papel instrumental en la identificación de tales poblaciones celulares durante el estado estacionario y las condiciones patológicas. Este artículo presenta un protocolo que describe un método consistente y reproducible para identificar las células inmunes que residen en los pulmones de ratones sanos en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para identificar cambios en estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad para ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad en el panorama inmunológico pulmonar.
Introducción
El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los estudios y experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo bajo pautas de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Médico Beth Israel Deaconess. Se utilizaron ratones C57BL/6 de seis a diez semanas de edad de ambos sexos para desarrollar este protocolo.
1. Escisión quirúrgica y preparación de tejidos
- Eutanasiar al ratón inyectando intraperitonealmente 1 ml de tribromoetanol (preparado según protocolo estándar; Tabla de Materiales).
NOTA: La asfixia por CO2 debe evitarse en los estudios pulmonares, ya que podría causar lesiones pulmonare....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Estrategia de cierre
El primer paso de nuestra estrategia de cierre es la exclusión de los escombros y dobletes (Figura 1A). La exclusión cuidadosa de los dobletes es fundamental para evitar poblaciones falsamente positivas (Figura suplementaria S2). Luego, las células inmunes se identifican utilizando CD45+, un marcador para las células hematopoyéticas (Figura 1B). La mancha de muerto vivo se puede agregar para ex.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La identificación de las células inmunes pulmonares puede ser un desafío debido a los múltiples tipos de células inmunes que residen en el pulmón y sus características inmunofenotípicas únicas en comparación con sus contrapartes que residen en otros tejidos. En varias condiciones patológicas, las células con características fenotípicas distintas aparecen en los pulmones. Por ejemplo, la lesión pulmonar inducida por bleomicina resulta en el reclutamiento de macrófagos circulantes derivados de monocitos en el espacio alveo.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
V.A.B. tiene patentes sobre la vía PD-1 licenciadas por Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis y Dako. Los autores no declaran otros intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA238263 y R01CA229784 (VAB).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Émbolo de jeringa de 10 mL | EXELINT | 26265 | |
| Agujas de 18 G | Aguja BD Precision Glide | 305165 | |
| Agujas de 21 g | Aguja BD Precision Glide | 305195 | |
| Tubos cónicos de 50 mL | Falcon | 3520 | |
| 70 μ Filtro de células | ThermoFisher 22363548 | ||
| placas de 96 pocillos | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK tampón de lisado | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-ratón CD11b | Biolegend | 101215 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| anti-ratón CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| anti-ratón CD45 | Biolegend | 103115 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| anti-ratón CD64 | Biolegend | 139319 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| anti-ratón CD68 | Biolegend | 137009 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| anti-ratón GR-1 | Biolegend | 108433 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| Siglec F | Biolegend | 155503 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | Para más detalles, véase la Tabla 2 |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | Para más detalles, véase la Tabla 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | Para más detalles, véase la Tabla 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| Centrífuga | |||
| Colagenasa Tipo 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | Para obtener más detalles, consulte la Tabla 2 |
| DNasa I | Millipore Sigma 10104159001 | ||
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | Para más detalles, véase la Tabla 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | Para más detalles, véase la Tabla 2 |
| Suero fetal bovino | R& D Systems | ||
| Pinzas dentadas finas | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Juego de tampones de tinción con factor de transcripción | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel Merit | Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | Para obtener más detalles, consulte la Tabla 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | Para obtener más información, consulte la Tabla 2 |
| Agitador orbital | VWR | Modelo 200 | |
| Placa de Petri | Falcon | 351029 | |
| Centrífuga de sobremesa refrigerada | SORVAL ST 16R | ||
| tijera curva pequeña | Roboz Surgical Instrument Co |
Referencias
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
