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Biology

एनोफिलीज़ गैम्बिया मच्छरों से लार्वा लार ग्रंथियों का विच्छेदन और इम्युनोस्टेनिंग

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

वयस्क मच्छर लार ग्रंथि (एसजी) वायरस और परजीवी सहित उनके मानव मेजबानों को सभी मच्छर जनित रोगजनकों के संचरण के लिए आवश्यक है। यह वीडियो लार्वा (एल 4) चरण एनोफिलीज़ गाम्बिया मच्छरों से एसजी के कुशल अलगाव और आगे के विश्लेषण के लिए एल 4 एसजी की तैयारी को दर्शाता है।

Abstract

मच्छर लार ग्रंथियां (एसजी) कीट जनित रोगजनकों के संचरण के लिए एक आवश्यक प्रवेश द्वार अंग हैं। वायरस और प्लास्मोडियम परजीवी सहित रोग पैदा करने वाले एजेंट, जो मलेरिया का कारण बनते हैं, एसजी कोशिकाओं के स्रावी गुहाओं में जमा होते हैं। यहां, वे बाद के रक्त भोजन के दौरान अपने कशेरुकी मेजबानों को संचरण के लिए तैयार हैं। जैसा कि वयस्क ग्रंथियां लार्वा एसजी डक्ट बड अवशेषों के विस्तार के रूप में बनती हैं जो शुरुआती प्यूपल एसजी हिस्टोलिसिस से परे बनी रहती हैं, लार्वा एसजी हस्तक्षेप के लिए एक आदर्श लक्ष्य है जो रोग संचरण को सीमित करता है। लार्वा एसजी विकास को समझना इसकी आकृति विज्ञान और कार्यात्मक अनुकूलन की बेहतर समझ विकसित करने में मदद कर सकता है और इस अंग को लक्षित करने वाले नए हस्तक्षेपों के मूल्यांकन में सहायता कर सकता है। यह वीडियो प्रोटोकॉल एनोफिलीज़ गाम्बियाई मच्छरों से लार्वा एसजी को अलग करने, ठीक करने और धुंधला करने के लिए एक कुशल तकनीक को दर्शाता है। 25% इथेनॉल समाधान में लार्वा से विच्छेदित ग्रंथियों को मेथनॉल-ग्लेशियल एसिटिक एसिड मिश्रण में तय किया जाता है, जिसके बाद एक ठंडा एसीटोन वॉश होता है। फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में कुछ कुल्ला करने के बाद, एसजी को एसजी-व्यक्त प्रोटीन के खिलाफ मार्कर रंजक और / या एंटीसेरा की एक विस्तृत सरणी के साथ दाग दिया जा सकता है। लार्वा एसजी अलगाव के लिए इस विधि का उपयोग सीटू संकरण विश्लेषण, अन्य ट्रांसक्रिप्टोमिक अनुप्रयोगों और प्रोटिओमिक अध्ययनों के लिए ऊतक एकत्र करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

मलेरिया एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा है जो 2019 में लगभग 230 मिलियन संक्रमण और अनुमानित 409,000 मौतों का कारण बनताहै। अधिकांश मौतें उप-सहारा अफ्रीका में होती हैं और परजीवी प्लास्मोडियम फाल्सीपेरमके कारण होती हैं, जिसका कीट वेक्टर एनोफिलीज़ गाम्बियाहै, जो इस वीडियो प्रदर्शन का विषय है। यद्यपि संख्याएं सदी के अंत के बाद से वार्षिक मृत्यु दर में एक महत्वपूर्ण गिरावट का संकेत देती हैं (>300,000 कम वार्षिक मौतें), 2000 से 2015 तक देखी गई रोग दर में आशाजनक कमी टेपरिंग हैं, जो रोग संचरण को सीमित करने के लिए नएदृष्टिकोणोंकी आवश्यकता का सुझाव देती हैं। मलेरिया को नियंत्रित करने और संभवतः समाप्त करने के लिए आशाजनक अतिरिक्त रणनीतियों में CRISPR / Cas9-आधारित जीन-संपादनऔर जीन-ड्राइव3,4,5का उपयोग करके मच्छर वेक्टर क्षमता को लक्षित करना है। वास्तव में, यह मच्छर वेक्टर का लक्ष्यीकरण है (लंबे समय तक चलने वाले कीटनाशक-उपचारित बेड नेट के विस्तारित उपयोग के माध्यम से) जिसका रोगसंचरणको कम करने पर सबसे बड़ा प्रभाव पड़ा है।

मादा मच्छर रक्त भोजन के दौरान एक संक्रमित मानव से प्लास्मोडियम गैमेटोसाइट्स प्राप्त करते हैं। निषेचन, परिपक्वता, मिडगट एपिथेलियम ट्रैवर्सल, जनसंख्या विस्तार, और हेमोकोल नेविगेशन के बाद उनके बाध्य मच्छर मेजबानों में, सैकड़ों से दसियों हजारों प्लास्मोडियम स्पोरोजोइट्स मच्छर एसजी पर आक्रमण करते हैं और घटक स्रावी कोशिकाओं की स्रावी गुहाओं को भरते हैं। एक बार स्रावी गुहाओं के अंदर, परजीवी लार नलिका तक सीधी पहुंच रखते हैं और इस प्रकार अगले रक्त भोजन पर एक नए कशेरुक मेजबान को संचरण के लिए तैयार होते हैं। क्योंकि एसजी अपने मानव मेजबानों के लिए मलेरिया पैदा करने वाले स्पोरोज़ोइट्स के संचरण के लिए महत्वपूर्ण हैं, और प्रयोगशाला अध्ययनों से पता चलता है कि एसजी रक्त-आहार, मच्छर के अस्तित्व, या प्रजनन क्षमता7,8,9के लिए आवश्यक नहीं हैं, वे संचरण-अवरुद्ध उपायों के लिए एक आदर्श लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। वयस्क मच्छर एसजी लार्वा एसजी में "डक्ट कली" अवशेषों के विस्तार के रूप में बनते हैं जो शुरुआती पिल्ला एसजी हिस्टोलिसिस10से परे बने रहते हैं, जिससे लार्वा एसजी वयस्क-चरण रोग संचरण को सीमित करने के लिए हस्तक्षेप के लिए एक आदर्श लक्ष्य बन जाता है।

एसजी विकास के लार्वा चरण की विशेषता न केवल इसकी आकृति विज्ञान और कार्यात्मक अनुकूलन की बेहतर समझ विकसित करने में मदद कर सकती है, बल्कि नए हस्तक्षेपों का आकलन करने में भी मदद कर सकती है जो प्रमुख एसजी नियामकों के जीन संपादन के माध्यम से इस अंग को लक्षित करती हैं। चूँकि लार्वा लार ग्रंथि वास्तुकला के पिछले सभी अध्ययनों में इम्यूनोस्टेनिंग और आधुनिक इमेजिंगतकनीकों 10,11को पूर्वनिर्धारित किया गया है,इसलिए हमने लार ग्रंथियों को विभिन्न प्रकार के एंटीबॉडी और सेलमार्करोंके साथ अलग करने और धुंधला करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह वीडियो निष्कर्षण, निर्धारण, और confocal इमेजिंग के लिए Anopheles gambiae L4 लार्वा से लार्वा SGs के धुंधला करने के लिए इस दृष्टिकोण को दर्शाता है।

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Protocol

1. समाधान और उपकरणों की तैयारी

  1. विच्छेदन समाधान की तैयारी
    1. विच्छेदन समाधान तैयार करने के लिए, 15 प्लास्टिक ट्यूब में आसुत एच 2 ओ के 7.5 मिलीलीटर में 100% इथेनॉल के2.5मिलीलीटर जोड़ें। मिश्रण करने के लिए ट्यूब को 3 बार उलटें।
      नोट: इस समाधान को कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. 10x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) स्टॉक की तैयारी
    1. 10x PBS स्टॉक तैयार करने के लिए, 17.8 g Na2HPO4• 2H2O, 2.4 g KH2PO4, 80g NaCl, और 2 g KCl को 800 mL विआयनीकृत पानी में जोड़ें। एक हलचल प्लेट पर एक हलचल पट्टी के साथ मिश्रण जब तक ठोस पूरी तरह से भंग हो गया है. शुद्ध पानी के साथ अंतिम मात्रा को 1 एल में समायोजित करें।
      नोट: इस समाधान को कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. 1x PBS की तैयारी
    1. एक बाँझ कांच की बोतल में H2O के 90 mL करने के लिए 10x PBS के 10 mL जोड़ें। ढक्कन को कसकर बंद करें और मिश्रण करने के लिए 3x उलटें।
      नोट: समाधान कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. फिक्सेटिव की तैयारी।
    1. ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 200 μL करने के लिए मेथनॉल के 600 μL जोड़ें। समाधान को हर बार ताजा करें।
  5. पुट्टी प्लेट का निर्माण (सिलिकॉन रबर से भरा एक ऊतक संस्कृति पकवान)
    1. Epoxy (1 g) और पानी (50 mL) के घटकों (1:50) को मिलाएं और मिश्रण को पेट्री डिश में डालें। उपयोग करने से पहले घटकों के सूखने की प्रतीक्षा करें।
      नोट: एक बार निर्माण के बाद, पुट्टी प्लेट का उपयोग वर्षों तक किया जा सकता है।

2. ग्रंथि विच्छेदन (चित्रा1A)

  1. देर से चरण L4 लार्वा ले लीजिए (~ 10 दिन के बाद हैच; चित्र 2) एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर ट्रे खिलाने से.
    नोट: मानक मच्छर पालन और लार्वा संस्कृति13के लिए इस उपयोगी ऑनलाइन मैनुअल देखें |
    1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर एक पुट्टी प्लेट रखें और पुट्टी प्लेट पर लार्वा स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रारंभिक विच्छेदन के लिए लार्वा को एलीकोट करते समय, प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके एक समय में स्लाइड पर ~ 10 लार्वा स्थानांतरित करना सहायक होता है।
  2. 10 लार्वा से अलग, पुट्टी प्लेट पर विच्छेदन समाधान (1: 3 EtOH: H2O) की एक बूंद रखें।
  3. 25% EtOH ड्रॉप में एक L4 लार्वा रखने के लिए एक प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट या डिस्पोजेबल ग्लास पिपेट का उपयोग करें।
  4. संदंश (# 5) लें, प्रत्येक हाथ में एक, और गैर-प्रमुख हाथ के साथ, लार्वा के सिर को पकड़ें। प्रमुख हाथ का उपयोग करके, सिर के ठीक नीचे संदंश के साथ लार्वा को समझें और धीरे से न्यूनतम निरंतर बल के साथ खींचें, जैसे कि सिर शरीर के बाकी हिस्सों से अलग हो जाता है और ग्रंथियां सिर से जुड़ी रहती हैं। लार्वा शव के शरीर के हिस्से को छोड़ दें।
    नोट: विच्छेदन करते समय, लार्वा शवों को इकट्ठा करने के लिए पास में एक पेपर तौलिया सेट करें।
  5. एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1x PBS के 1 mL में सिर / ग्रंथियों को इकट्ठा करें। उनके संलग्न सिर के साथ ~ 40 विच्छेदित ग्रंथियों के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। बफर के नीचे तक डूबने के लिए सिर / एसजी की प्रतीक्षा करें।

3. एंटीबॉडी धुंधला के लिए निर्धारण (चित्रा1B)

  1. एक ग्लास ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के शीर्ष से शुरू होने वाले पीबीएस को निकालें, चिपचिपा मच्छर ऊतकों से बचें और ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना पीबीएस समाधान को जितना संभव हो उतना हटा दें। ग्लेशियल एसिटिक एसिड के लिए मेथनॉल के 3: 1 मिश्रण के 800 μL के साथ समाधान को बदलें। रात भर में ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (12-24 घंटे की सिफारिश की गई; 19 घंटे पसंद किया गया)।
  2. अगले दिन, समाधान को नाली और इसे 1 मिलीलीटर ठंडे 100% एसीटोन के साथ बदलें। 90 सेकंड के लिए छोड़ दें।
  3. एसीटोन को हटा दें और धीरे से ऊतकों को हर बार 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला करें।
    नोट: नमूनों को प्रवाह के साथ धीरे-धीरे तैरना चाहिए, फिर प्रत्येक पीबीएस अतिरिक्त पूरा होने तक ट्यूब के नीचे वापस आ जाना चाहिए।

4. Immunostaining (चित्रा1B)

  1. 1x PBS की कुल मात्रा के 200 μL में उपयुक्त कमजोर पड़ने (1:100) पर प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, Rab11) जोड़ें। एक पिपेट टिप के साथ ट्यूब सामग्री को धीरे से घुमाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और 1x PBS के 1 mL के साथ तीन बार धोएं (धीरे से पिपेट के अंदर और बाहर समाधान को पाइपेट करना)।
  3. कुल मात्रा के 200 μL में उपयुक्त कमजोर पड़ने (1:200) पर द्वितीयक एंटीबॉडी (एलेक्स फ्लोर 488 बकरी विरोधी खरगोश) जोड़ें। एक पिपेट टिप के साथ ट्यूब सामग्री को धीरे से घुमाएं। 90 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. इस स्तर पर पीबीएस के 200 μL में नील लाल (लिपिड, 1 μg / μL के 5 μL) और / या Hoechst (डीएनए, 1 μg / μL के 3 μL) जैसे रंगों को जोड़ें। एक अतिरिक्त 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। 1x PBS के साथ धीरे से तीन बार धोएं।

5. माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते दाग ग्रंथियों (चित्रा1C)

  1. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 100% ग्लिसरॉल के पिपेट 200 μL.
    नोट: जैसा कि ग्लिसरॉल चिपचिपा है, तब तक तरल में पिपेट टिप को छोड़ दें जब तक कि यह उचित मात्रा तक न पहुंच जाए। 100% ग्लिसरॉल में सीधे जाने पर कोई ऊतक सिकुड़ता नहीं देखा गया था। हालांकि, शोधकर्ता नमूनों को 100% ग्लिसरॉल में स्थानांतरित करने से पहले ट्यूबों में 30% और 50% ग्लिसरॉल वॉश के माध्यम से जा सकते हैं।
  2. एक नरम ब्रश(चित्रा 3 ए)का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर संलग्न ग्रंथियों (अन्य आंतरिक संरचनाओं के साथ) के साथ दाग वाले सिर (प्रति स्लाइड 20 तक) स्थानांतरित करें। नमूनों को फैलाएं ताकि वे ग्लास स्लाइड के साथ समान रूप से वितरित किए जा सकें।
    नोट: ब्रश के साथ कवर स्लाइड पर ग्रंथियों को जमा करते समय, संदंश का उपयोग एसजी को धीरे-धीरे उन्मुख करने के लिए किया जा सकता है ताकि वे सभी एक ही दिशा में उन्मुख हों।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत देखने से, संदंश के दो जोड़े का उपयोग करके ग्रंथियों से लार्वा सिर को अलग करें और ध्यान से दो ऊतकों को विपरीत दिशाओं में खींचें।
    नोट: जैसा कि एसजी को पूरी तरह से अलग करना चुनौतीपूर्ण है, बस सिर को हटा दें, एसजी और संबंधित आंतरिक संरचनाओं को छोड़ दें। यहां तक कि अगर एसजी अन्य ऊतकों के साथ जुड़े रहते हैं, तो वे आसानी से पहचाने जाते हैं जब होचस्ट और अन्य मार्करों(चित्रा 3 बी,सी) के साथ दाग दिया जाताहै।
  4. निकालें और सिर को छोड़ दें और प्रत्येक एसजी के लिए पृथक्करण प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट:: सिर निकालते समय, उन्हें इकट्ठा करने के लिए पास में एक पेपर तौलिया सेट करें।
  5. धीरे से शीर्ष पर एक 1.5 मिमी मोटी coverslip जगह (हवा के बुलबुले से बचने) और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील.
  6. एक प्रकाश सबूत कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: दाग ग्रंथियों की तैयार स्लाइड को गुणवत्ता में किसी भी उल्लेखनीय परिवर्तन के बिना छह महीने से एक वर्ष तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। यदि ग्लिसरॉल महीनों के रूप में रिसाव करना शुरू कर देता है, तो छेद को भरने के लिए धीरे-धीरे कवरस्लिप और पिपेट को अधिक ग्लिसरॉल में उठाएं।

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Representative Results

लार ग्रंथियों को सभी चरण 4 लार्वा से विच्छेदन करना अपेक्षाकृत आसान है। नर और मादा लार्वा को देर से एल 4 लार्वा चरण में मादाओं के पृष्ठीय वक्ष के साथ एक लाल पट्टी द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है, लेकिन पुरुषों को नहीं(चित्र2)। हम यह भी देखते हैं कि एंटीनेल आकृति विज्ञान मादा एल 4 लार्वा(चित्रा 2)की तुलना में नर में बहुत अधिक विस्तृत है, जो वयस्क मच्छरों में इस संरचना में देखे गए अंतर के समान है। L4 चरण के दौरान काफी समग्र वृद्धि के साथ- साथ, लार ग्रंथियां L412के दौरान एक लुमेन भी बनाती हैं। लार ग्रंथियों Hoechst के साथ दाग प्रारंभिक L4 चरण लार्वा से अलग एक संकीर्ण कसना(चित्रा 3B,C)द्वारा अलग समीपस्थ और डिस्टल लोब प्रकट करते हैं. बनाने वाला लुमेन डिस्टल लोब के माध्यम से समीपस्थ-सबसे अंत (नहीं दिखाया गया) पर लार वाहिनी से सभी तरह से विस्तारित होगा। बनाने वाले लुमेन को मध्य-से-देर से एल 4 लार्वा(चित्रा 4)के इम्यूनोस्टेन्ड डिस्टल लार ग्रंथि में देखा जा सकता है। लुमेन बनाने के आसपास के स्रावी कोशिकाओं के एपिकल डोमेन में तीव्र नील लाल धुंधला(चित्रा 4 बी,सी)माइक्रोविल्ली जैसी संरचनाओं का विचारोत्तेजक होता है। इसके अलावा एपिकल सतह के करीब मनाया Rab11 धुंधला(चित्रा 4C,डी,तीर) है. Rab11 एपिकल रीसाइक्लिंग एंडोसोम के लिए स्थानीयकरण करता है। Rab11 धुंधला जो ग्रंथि की बेसल सतह के साथ भी जमा होता है, बेसल झिल्ली की चिपचिपाहट के कारण एक कलाकृति है। इसी तरह की पृष्ठभूमि धुंधला लार्वा और वयस्क लार ग्रंथियों दोनों के immunostaining के साथ आम है और बोनाफाइड संकेत के लिए गलत किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1:स्लाइड तैयारी के माध्यम से ग्रंथि विच्छेदन से immunostaining प्रक्रिया के कार्टून विज़ुअलाइज़ेशन. संक्षेप: एसजी = लार ग्रंथियों; PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा; MeOH = मेथनॉल; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; Abs = एंटीबॉडी; LH = बायाँ हाथ; आरएच = दाहिने हाथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2:नर और मादा L4 चरण एनोफिलीज़ गैम्बी लार्वा( A, B)प्रारंभिक L4 लार्वा। (C, D) देर से L4 लार्वा. L4 चरण के दौरान काफी वृद्धि हुई है। मादाओं(ए, सी)को पृष्ठीय वक्ष(सी;काला तीर) के नीचे एक विशिष्ट लाल पट्टी के रूप में वर्णित किया गया है जो पुरुषों(बी, डी)में मौजूद नहीं है, लेकिन उनके एंटीना भी शुरुआती और देर से एल 4 (बढ़ी हुई छवियों में सफेद तीर) दोनों से पुरुष लार्वा की तुलना में बहुत कम विस्तृत (फ्रिली) हैं। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:प्रारंभिक L4 लार ग्रंथियां ( A)लार ग्रंथियों और अन्य आंतरिक अंगों के साथ प्रारंभिक L4 मादा लार्वा सिर अभी भी जुड़ा हुआ है। लार ग्रंथि को रेखांकित किया गया है। स्केल बार = 50 μm.(B, C)पृथक लार्वा ग्रंथियों Hoechst के साथ सना हुआ. (बी)फ्लोरोसेंट और नोमार्स्की छवियों का विलय जो समीपस्थ और डिस्टल लोब के आकार और नाभिक में नीले होचस्ट धुंधला के आकार को दर्शाता है। (सी)Hoechst फ्लोरोसेंट छवि केवल नाभिक पर प्रकाश डाला गया है। नीचे के पैनलों में स्केल बार = 20 μm। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4:इम्युनोस्टेन्ड डिस्टल एल 4 लार ग्रंथि को होचस्ट (परमाणु डीएनए, नीला) और(बी)नील लाल (झिल्ली मार्कर, लाल) के साथ दाग दिया गया है; Rab11 (एपिकल रीसाइक्लिंग पुटिकाओं, हरे)(सी)के लिए immunostained. (डी)मर्ज की गई छवि। ध्यान दें कि दिखाए गए चरण(बी-डी)पर एक लुमेन मौजूद है। सी और डी में तीर एपिकल सतह के पास पुटिकाओं के अपेक्षित Rab11 धुंधला करने की ओर इशारा करते हैं जो विलय (सफेद तीर) में नील लाल-सकारात्मक वेसिकुलर स्टेनिंग को ओवरलैप करता है। बेसल सतह (तारांकन) के चारों ओर गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला भी मनाया जाता है, लार्वा और वयस्क लार ग्रंथियों में देखी जाने वाली पृष्ठभूमि का एक सामान्य प्रकार। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को ड्रोसोफिला एसजी विच्छेदन प्रोटोकॉल और एक वयस्क मच्छर विच्छेदन प्रोटोकॉल14 , 15,16से अनुकूलित किया गया था । हालांकि, वयस्क विच्छेदन और एसजी धुंधला विधियों का उपयोग करते समय अधिकांश मार्करों ने तहखाने की झिल्ली (डेटा नहीं दिखाया गया) में प्रवेश नहीं किया। वयस्क प्रोटोकॉल के अनुकूलन में 25% ईटीओएच समाधान में ग्रंथियों को विच्छेदन करना, MeOH और ग्लेशियल एसिटिक एसिड के संयोजन के साथ ग्रंथियों को धोना, और 90 s एसीटोन वॉश होना शामिल था। मूल वयस्क प्रोटोकॉल में, वयस्क एसजी को 1x पीबीएस 14,15,16में विच्छेदित किया गया था। एक 25% EtOH समाधान में विच्छेदन ने एसजी को संरक्षित करने में मदद की और धुंधला अवधि के दौरान क्षति को रोका। प्रारंभिक विच्छेदन करते समय, लार्वा एसजी को गैर-प्रमुख हाथ का सामना करने वाले सिर के साथ उन्मुख करना सबसे आसान था और प्रमुख हाथ धीरे से बाहर की ओर खींचता है (क्योंकि लार्वा बहुत सक्रिय रूप से आगे बढ़ रहे हैं)। एक MeOH के साथ ग्रंथियों को धोने से प्राप्त बेहतर ऊतक प्रवेश: ग्लेशियल एसिटिक एसिड समाधान से पता चलता है कि लार्वा एसजी तहखाने झिल्ली और / या सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली में लिपिड सामग्री वयस्क एसजी से अलग है। 90 एस एसीटोन धोने ने इमेजिंग के लिए ग्रंथियों की स्पष्टता में सुधार किया। यद्यपि निर्धारण अवधि को कम से कम 19 घंटे (रातभर) होने की सिफारिश की गई थी, लेकिन लंबी अवधि ने प्रभावी ढंग से काम किया।

एसजी की आकृति विज्ञान व्यापक रूप से भिन्न हो सकती है जब लार्वा को 2-दिवसीय लंबे एल 4 चरण में विच्छेदित किया जाता है। प्रारंभिक L4 विच्छेदन (दिन 1) में, लुमेन बहुत छोटा दिखाई देता है12। देर से एल 4 विच्छेदन (दिन 2 की दूसरी छमाही) में, लुमेन बड़ा होता है, और कोशिकाएं लम्बी होती हैं। हमने पाया कि लार्वा के साथ काम करने के लिए इष्टतम अवधि एल 4 थी; L1-L3 SGs बस मैनुअल विच्छेदन के लिए बहुत छोटे हैं। इमेजिंग परिणामों में, मध्य-से-देर से एल 4 पर विच्छेदित ग्रंथियों ने छोटी कोशिकाओं को बड़े, पार्श्व रूप से लम्बी कोशिकाओं के साथ मिश्रित दिखाया, विशेष रूप से डिस्टल थैली में।

एनोफिल्स एसजी विकास पर पिछली रिपोर्टों ने वर्तमान अध्ययनों के लिए बहुत मार्गदर्शन प्रदान किया है। इन रिपोर्टों में विच्छेदित भ्रूण और लार्वा एसजी17 , 18,विच्छेदित ग्रंथियों19, 20 का विस्तृत सूक्ष्म विश्लेषण और ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन20,21,22के चित्र शामिल हैं . एनोफिलीज स्टीफेंसी एसजी की विशेषताओं को 1950 के दशक के दौरान दो अलग - अलग समूहों द्वारा सूचित किया गया था10,11. लार्वा ग्रंथियों की कई रूपात्मक विशेषताओं का वर्णन किया गया था, जिसमें एसजी का समग्र संगठन, अंग के भीतर अलग-अलग सेल प्रकारों की सापेक्ष स्थिति (वाहिनी, वयस्क एसजी अग्रदूत, और लार्वा समीपस्थ और डिस्टल स्रावी थैलियां)10,11। दोनों समूहों ने अतिरिक्त मॉर्फोमेट्रिक डेटा की भी सूचना दी, जिसमें प्रत्येक थैली के भीतर स्रावी कोशिकाओं की संख्या और वितरण और उनके परमाणु आकार10,11शामिल हैं। ऋषिकेश से पता चला है कि, ड्रोसोफिला लार्वा एसजी की तरह, एनोफिलिस स्टीफेंसी से लार्वा एसजी गुणसूत्रों को पॉलीटेनाइज्ड10किया जाता है। इन महत्वपूर्ण मूलभूत अवलोकनों ने लार्वा एनोफिलीज़ एसजी के व्यापक जैविक पहलुओं का वर्णन किया।

यहां वर्णित विधि न केवल ए. गाम्बिया के लार्वा एसजी का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होनी चाहिए, बल्कि मच्छरों की अन्य प्रजातियों का अध्ययन करने वालों पर भी लागू हो सकती है। दरअसल, एक ही प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है (अप्रकाशित) ए स्टीफेंसीके साथ, एक प्रजाति जो अक्सर प्रयोगशाला में अध्ययन की जाती है। प्रोटोकॉल की एक सीमा एंटीबॉडी की सीमित संख्या है जो विशेष रूप से मच्छर प्रोटीन के खिलाफ उत्पन्न हुई है। यद्यपि अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन के लिए ड्रोसोफिला एंटीबॉडी का उपयोग करने से इस सीमा12का चक्कर लगाया गया है, क्षेत्र को अधिक मच्छर प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी से लाभ हो सकता है। लार्वा एसजी सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान को समझना नए नियंत्रण या लक्ष्य रणनीतियों में योगदान कर सकता है और एसजी व्यवधान के लिए नए उम्मीदवार लक्ष्य जीन की खोज की अनुमति दे सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट को एन गाम्बिया लार्वा तक पहुंच और पालन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

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References

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जीव विज्ञान अंक 175
<em>एनोफिलीज़ गैम्बिया</em> मच्छरों से लार्वा लार ग्रंथियों का विच्छेदन और इम्युनोस्टेनिंग
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Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti,… More

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti, M., Wells, M. B., Andrew, D. J. Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (175), e62989, doi:10.3791/62989 (2021).

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