Este estudio describe la medición directa de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico mediante el uso de un trazador de glucosa isotópico estable a través de la vena de la cola en estados de ayuno y ricos en glucosa en tándem.
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Artículo de método
Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico
En este artículo
Resumen
Resumen
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es una enfermedad común que produce trastornos del metabolismo de la glucosa, como la resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa. El metabolismo desregulado de la glucosa es una manifestación importante de la enfermedad y es la clave de su patogénesis. Por lo tanto, los estudios que involucran la evaluación del metabolismo de la glucosa en el SOP son de suma importancia. Muy pocos estudios han cuantificado la producción hepática de glucosa directamente en modelos de SOP utilizando trazadores de glucosa no radiactivos. En este estudio, discutimos las instrucciones paso a paso para la cuantificación de la tasa de producción de glucosa hepática en un modelo de ratón con SOP midiendo el enriquecimiento M+2 de [6,6-2H2]glucosa, un trazador de glucosa isotópico estable, mediante cromatografía de gases - espectrometría de masas (GCMS). Este procedimiento implica la creación de una solución trazadora de glucosa isotópica estable, el uso de la colocación del catéter de la vena de la cola y la infusión del marcador de glucosa en estados de ayuno y ricos en glucosa en el mismo ratón en tándem. El enriquecimiento de [6,6-2H2]glucosa se mide utilizando el derivado del pentaacetato en GCMS. Esta técnica se puede aplicar a una amplia variedad de estudios que implican la medición directa de la tasa de producción hepática de glucosa.
Introducción
El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es un trastorno frecuente que ocurre en el 12%-20% de las mujeres en edad reproductiva1,2. Es una enfermedad compleja que da lugar a fenotipos variables que involucran ovarios poliquísticos, menstruaciones irregulares y evidencia clínica o de laboratorio de hiperandrogenemia, y generalmente se diagnostica cuando una mujer cumple con dos de los tres criterios3. Un aspecto predominante del SOP, y un factor clave en su patogénesis, son los trastornos metabólicos que se encuentran en las mujeres que tienen la enfermedad. Las mujeres con SOP tienen una mayor incidencia de resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, obesidad y síndrome metabólico3,4,5,6. La resistencia a la insulina no es solo una manifestación de la enfermedad, sino que se cree que contribuye a su patogénesis al potenciar la acción de la hormona luteinizante en el ovario, lo que lleva a un aumento de la producción de andrógenos7,8. Se cree que la resistencia a la insulina tiene varios orígenes posibles, pero los estudios sugieren que puede deberse a patrones anormales de señalización del receptor de insulina9,10. Los estudios han evaluado la resistencia a la insulina en pacientes con SOP utilizando la técnica estándar de oro de la pinza hiperinsulinémica-euglucémica11,12,13,14,15. Las mujeres con SOP, independientemente del IMC, tienen niveles más altos de resistencia a la insulina en comparación con los controles. El control de la insulina sobre la producción de glucosa se ve afectado en los trastornos de resistencia a la insulina que conducen a un exceso de producción de glucosa. Por ejemplo, los pacientes diabéticos tienen mayores tasas de gluconeogénesis y alteración de la supresión de la glucogenólisis16. Además, se ha observado una alteración de la supresión de la producción de glucosa en ratas diabéticas17. Aunque los estudios de pinzas pueden dar una medición de la resistencia a la insulina, pocos estudios en SOP se centran en la medición directa de la producción de glucosa en estados de ayuno y alimentación. Esto requiere el uso de una infusión de trazador de glucosa isotópica no radiactiva y la medición a través de espectrometría de masas.
Los modelos animales se han utilizado ampliamente en la investigación del SOP. Tanto los modelos murinos de SOP magro como los obesos se han creado mediante la administración de andrógenos prenatal, prepuberal o postpuberal18. Los modelos de SOP en roedores también demuestran diferencias metabólicas en comparación con sus respectivos controles. Datos previos de nuestro laboratorio demostraron pruebas de tolerancia anormal a la glucosa (GTT) en modelos de ratón con SOP (delgados y obesos), consistentes con la literatura humana de SOP19. El uso de un modelo animal delgado y obeso permite una mayor investigación sobre las diferencias metabólicas. Específicamente, este modelo permite evaluar la tasa de producción de glucosa directamente utilizando trazadores de glucosa isotópicos. Uno de los trazadores de glucosa isotópica estable más utilizados es [6,6-2H2]glucosa. El enriquecimiento de [6,6-2H2]glucosa se puede medir utilizando un derivado de pentaacetato como se describió anteriormente20.
En este estudio, nuestro objetivo fue medir la tasa de producción hepática de glucosa en ayunas y en estado rico en glucosa en ratones con SOP utilizando infusión de glucosa isotópica. Estas técnicas se pueden aplicar a una amplia gama de experimentos que involucran la cinética de la glucosa.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. Preparación de [6,6-2H2]glucosa
- Un día antes del procedimiento, prepare el marcador de glucosa de isótopos estables en solución salina normal. Para este experimento, se utilizó [6,6-2H2]glucosa como marcador para medir la tasa de aparición de glucosa en plasma.
NOTA: En este experimento, se midió la producción de glucosa durante el ayuno y las condiciones ricas en glucosa, por lo que el isótopo de glucosa se preparó en dos preparaciones diferentes. Preparar las soluciones de tal manera que la dosis final de infusión sea cercana a 1 mg/(kg·min) y 2 mg/(kg·min), respectivamente. Estas concentraciones fueron optimizadas por varios estudios piloto previos. - Prepare la primera infusión con solo [6,6-2H2]glucosa como marcador para representar la condición de ayuno disolviendo glucosa estéril y libre de pirógenos [6,6-2H2] en solución estéril de cloruro de sodio al 0,9%.
- Prepare la segunda infusión disolviendo tanto el trazador de glucosa [6,6-2H2] junto con la glucosa no isotópica (~ 20 mg / kg · min) en solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% para simular la condición de alimentación.
NOTA: En el presente experimento, se utilizó una infusión de velocidad constante cebada de [6,6-2H2]glucosa a (~) 1.08 mg/ (kg·min) (condición de ayuno) y (~) 1.9 mg/kg·min (condición rica en glucosa). Para imitar la "condición rica en glucosa", la velocidad de infusión de D-glucosa se estableció en (~) 18.8 mg / (kg · min). - Una vez preparadas las soluciones, filtre estérilmente las soluciones con un filtro de 0,22 μm y guárdelas a 4 °C. Calentar las soluciones a temperatura ambiente antes de la perfusión. Cargue las soluciones en jeringas preetiquetadas de 1 ml.
- Configure la bomba para facilitar una infusión de velocidad constante cebada de la primera infusión (para condiciones basales) que contenga solo el trazador, y programe la bomba para una infusión de velocidad constante del isótopo a 150 μL / h durante 3 h.
- Al final de la configuración de ayuno de 3 h, reemplace la primera jeringa de infusión por la segunda jeringa de infusión que contiene el trazador isotópico y la D-glucosa (para el estado de alimentación simulado), y prepare la infusión para los 15 minutos iniciales a 600 μL / h. Ajuste la bomba a una infusión de velocidad constante a 150 μL/h durante las 3 h adicionales.
2. Puesta en marcha de experimentos de infusión
- Retire a los ratones de sus jaulas caseras y colóquelos en sus jaulas de ayuno 3 h antes del inicio del experimento. Para este experimento, se utilizó un ratón hembra de 4 meses de edad de la cepa C57BL / 6J.
NOTA: Este procedimiento no requiere ninguna analgesia antes o durante el procedimiento dada su naturaleza mínimamente invasiva. - Ensamble el equipo de jaula agrupando a los ratones en un número determinado de ratones por bomba de insulina. Coloque particiones sobre una base plana y estable para hacer puestos individuales para los ratones. Es importante tener acceso al catéter de la vena de la cola para que la infusión funcione, así que asegúrese de que haya una muesca en la parte inferior de la puerta de la jaula.
NOTA: Las jaulas que se muestran en el video se hicieron específicamente para este experimento. Las jaulas son transparentes y están hechas de plexiglás. Hay una base plana y estable (equipo de enjaulamiento estándar) sobre la que se asientan las particiones. Esta configuración consta de varias piezas para permitir la facilidad de configuración en varios entornos diferentes dependiendo de la altura de la mesa y las necesidades del experimentador. La puerta de la jaula se desliza para cerrarse y tiene una muesca en la parte inferior para permitir que la cola quepa. - Ensamble las jeringas de 1 ml que contienen 1 ml de infusión basal y, a continuación, conéctelas al tubo de la bomba de infusión utilizando el tubo de polietileno 0,28 mm ID x 0,61 mm.
- Prepare la bomba de infusión ajustando la velocidad a 150 μL/h, que es la velocidad basal.
- Calentar un baño de agua a 48 °C.
- Prepare la estación de inserción del catéter adyacente al baño de agua que contiene las agujas de 30 G de 0,5 pulgadas, el tubo silástico ID de 0,3 mm x 0,64 mm y la cinta transparente de transporos de 1 pulgada.
- Después de 3 h de ayuno, comience el proceso de inserción del catéter, que se detalla a continuación.
3. Inserción del catéter
- Seleccione un ratón y colóquelo en un soporte seguro con acceso a la cola. Un ejemplo de qué usar es una botella cortada por la mitad con una muesca para la cola. Coloque el soporte sobre una base plana. Coloque una cinta adhesiva sobre la porción proximal de la cola para dejar espacio para la inserción del catéter de manera más distal.
NOTA: El tipo de cinta elegida para esta tarea debe tener una resistencia y adhesividad moderadas. En este experimento se utilizó cinta de etiquetado multipropósito a base de papel, ya que es suave y fácil de despegar. - Prepare el catéter (se esterilizó la aguja de 30 G unida a un tubo silástico de 0,3 mm y se esterilizó con gas PE-10) uniéndolo a una jeringa de 1 ml que contenga solución salina heparinizada estéril. Enjuague el catéter suavemente.
- Lleve el ratón al baño de agua e inserte la cola en el baño de agua durante aproximadamente 30-45 s. Esto ayuda a dilatar la vasculatura de la cola para la colocación del catéter.
- Realizar la inserción del catéter en condiciones estériles. Una vez que la cola se haya calentado, limpie la cola con toallitas de benzalconio y coloque una pequeña pinza de cocodrilo de cobre y sin dientes, que previamente estaba contorneada a la forma de la cola, como un torniquete en el extremo proximal de la cola. Visualice la vena lateral de la cola debajo de una lupa y luego inserte cuidadosamente el catéter en la vena de la cola y retire la aguja. Enjuague la solución suavemente para asegurar la permeabilidad del catéter.
- Envuelva un trozo de cinta de transporos de 1 pulgada alrededor del sitio de inserción para asegurar el catéter. Retire el pequeño torniquete de la cola.
4. Configuración de la infusión y primera infusión
- Coloque el ratón en su jaula individual y cierre la puerta corredera, asegurándose de que la cola sobresalga a través de la muesca y permanezca fuera de la jaula.
- Coloque un trozo adicional de cinta adhesiva sobre todo el catéter y la cola para asegurarlo a la placa base de la jaula. Para este paso se utilizó cinta de etiquetas de color multipropósito.
- Desconecte el enjuague del catéter de la vena de la cola y coloque una pequeña abrazadera en el tubo silástico del catéter para evitar el reflujo mientras conecta la línea de infusión de la bomba.
- Una vez bien conectado, retire la abrazadera y enjuague con la solución de cebado, que consiste en la infusión. Asegúrese de que la solución sea transparente en el tubo y no esté manchada de sangre.
- Tome nota de la hora de inicio de la infusión para asegurarse de que se ejecuta durante el tiempo total de aproximadamente 3 h. Si se usan varias jaulas simultáneamente, deben escalonarse para administrar los tiempos de infusión de manera efectiva.
- Una vez que se observe que las líneas de infusión funcionan correctamente, retire la cubierta del mouse. Coloque la ropa de cama estándar alrededor del mouse.
- Comience la infusión con la primera infusión que contiene el marcador y ejecútela durante 3 h continuamente. Durante la duración de la infusión, continúe verificando el bienestar de los ratones, así como las líneas de infusión. Asegúrese de que el tubo de infusión esté correctamente asegurado y que no haya fugas de los puntos de conexión de la línea.
5. Muestreo de sangre
- Después de que se haya completado la primera infusión, detenga la infusión, coloque una pinza en el tubo silástico en el catéter para evitar el flujo de regreso. Retire suavemente los ratones de sus recintos sin perturbar el catéter para recolectar sangre. Colóquelos en un lugar cerca de las jaulas para la extracción de sangre. Para este experimento, los ratones se sometieron a una venopunción de la mejilla utilizando una lanceta de 4 mm.
- Recolecte ~ 75 μL de sangre en el vial deseado. Para desproteinizar muestras en preparación para la espectrometría de masas, agregue aproximadamente 15 μL de sangre a 500 μL de acetona. La sangre restante se puede utilizar para comprobar el nivel de glucosa en sangre a través del glucómetro y / o centrifugado para separar el plasma para futuros ensayos hormonales.
6. Segunda infusión
- Retire las infusas de las bombas de jeringa desconectando el tubo de las jeringas y reemplácelo con la segunda infusión que contenga el marcador junto con la glucosa. Repita los pasos 4.2 a 4.7 usando la infusión de glucosa isotópica rica en glucosa.
- Para alcanzar un estado estacionario, ejecute un bolo del segundo infusión a 600 μL / h durante 15 min. Tenga en cuenta la hora de inicio para cada grupo de jaulas. Disminuya la velocidad de perfusión a 150 μL/h para completar las 3 h del tiempo total de perfusión.
- Repita los pasos 5.1 y 5.2.
- Detenga la bomba de infusión y retire el catéter de la vena de la cola suavemente, aplique presión en los sitios del catéter hasta que se detenga el sangrado y devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas.
- Santize y desinfecte bien la configuración de la jaula con agua y jabón estándar.
NOTA: Este es un procedimiento de supervivencia. Los ratones pueden ser devueltos a jaulas y mantenidos para más experiencias si es necesario. Se recomienda que no se realice ninguna experiencia adicional durante al menos una semana después de este procedimiento para garantizar un bienestar animal adecuado.
7. Espectrometría de masas
- Enviar las muestras para espectrometría de masas.
- Análisis
- Medir el enriquecimiento isotópico de [6,6-2H2]glucosa mediante cromatografía de gases - espectrometría de masas (GCMS) utilizando el derivado pentaacetato21,22. Brevemente, este método implica la preparación del derivado pentaacetato de la glucosa, seguido de un análisis de muestra utilizando GCMS 20,22.
- Cálculos
- Realice todas las mediciones cinéticas en condiciones de estado estacionario. La tasa de aparición total de glucosa plasmática (glucosa Ra) se calculó a partir del enriquecimiento M+2 de [6,6-2H2]glucosa en plasma utilizando ecuaciones de dilución de isótopos establecidas21. En condiciones de estado estacionario, se supone que la tasa de aparición de glucosa es igual a la tasa de desaparición de glucosa. Tasa de producción endógena de glucosa (mg/(kg·min)) (GPR) = glucosaRa - glucosa exógena.
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Resultados
Utilizando ecuaciones de dilución de isótopos previamente descritas, la tasa total de glucosa plasmática (glucoseRa) se calculó a partir del enriquecimiento M+2 de [6,6-2H2]glucosa en condiciones de ayuno y ricas en glucosa utilizando el derivado pentaacetato21. En condiciones de estado estacionario, se supone que la tasa de aparición de glucosa es igual a la tasa de desaparición de glucosa. En el grupo control, la glucosaRa total fue de 19,98 ± 2,53 mg/...
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Discusión
La hiperglucemia y el metabolismo/homeostasis anormal de la glucosa son características del SOP. El nivel de glucosa en sangre se mantiene mediante una combinación de glucosa de la dieta y la producción de glucosa a través de la glucogenólisis y la gluconeogénesis y la glucogénesis, bajo el control de la hormona y las enzimas. La producción hepática de glucosa se suprime por la presencia de un aumento de los niveles de glucosa circulante. En los trastornos del metabolismo anormal de la glucosa, la regulación de ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de capacitación del Departamento de Obstetricia y Ginecología, Baylor College of Medicine (ALG) y la subvención de investigación R-01 (Subvención # DK114689) para CSB, SC y JM de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de cloruro de sodio al 0,9 % | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD Jeringa con punta Luer-Lok | VWR | 75846-756 | Dos jeringas por animal (una para solución isotópica de glucosa y otra para solución isotópica rica en glucosa) |
| Cinta transpora transparente de 1 pulgada | 3M | 70200400169 | |
| Cinta de etiquetado de 1 pulgada | La marca Fisher | GS07F161BA | es un ejemplo |
| Jeringa de 5 mL que contiene solución salina heparanizada | McKesson | 191-MIH-2235 | También se puede preparar una solución de lavado de heparina (10 unidades/mL de heparina en cloruro de sodio al 0,9%) |
| 5 mm Lancetas para animales Medipoint Goldenrod | Fisher Scientific | NC9891620 5 mm si el animal tiene entre 2 y 6 meses | |
| Acetona | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| Agitador de placa calefactora avanzado | VWR | 97042-602 | La marca es ejemplo |
| Agujas BD calibre 27 de 0,5 pulgadas Health | Warehouse | A283952 | |
| Agujas BD 30 calibre 0,5 pulgadas | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic Tubo de polietileno (PE) 0,28 mm ID x 0,61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic Tubo de polietileno (PE) 0,28 mm ID x 0,61 mm | VWR | 63019-004 | |
| Vaso de precipitados, 1000 mL | Cualquier marca | ||
| Pellets | |||
| Viales de vidrio transparente VOA con tapa cerrada | Fisher Scientific | 05-719-120 | Para el almacenamiento de acetona y muestras de extracción de sangre |
| Abrazadera de cocodrilo sin dientes de cobre para torniquete | Amazon | Any Brand; pinzas de cocodrilo lisas y desdentadas hechas de cobre sólido | |
| D-(+)-glucosa >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-glucosa (6,6-D2, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| Tubo silástico Dow Corning de 0,3 mm de diámetro interno x 0,64 mm de diámetro exterior | VWR | 62999-042 | |
| Luna | Amazon | de cualquier marca; similar a LANCOSC Lupa con luz y soporte | |
| Microbalanza | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | Se puede utilizar cualquier modelo similar con una precisión de 0,0001 g |
| Frasco Nalgene, 500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | O cualquier marca similar; sierra por la mitad (incluida la tapa) y corte una muesca del tamaño de una cola en la parte inferior |
| Bomba de jeringa múltiple PHD Ultra | Aparato Harvard | 70-3024A | |
| plexiglás | Cualquier marca; para estabilizar al ratón durante la inserción del catéter | ||
| Láminas y divisores | Cualquier marca; se utiliza para enjaular ratones durante la infusión |
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