Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.
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Artículo de método
Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo óseo y la homeostasis dependen de la diferenciación y la actividad de los osteoblastos formadores de hueso. La diferenciación de osteoblastos se caracteriza secuencialmente por la proliferación seguida de la síntesis de proteínas y, en última instancia, la secreción de la matriz ósea. La proliferación y la síntesis de proteínas requieren un suministro constante de aminoácidos. A pesar de esto, se sabe muy poco sobre el consumo de aminoácidos en los osteoblastos. Aquí describimos un protocolo muy sensible que está diseñado para medir el consumo de aminoácidos utilizando aminoácidos radiomarcados. Este método está optimizado para cuantificar los cambios en la absorción de aminoácidos que están asociados con la proliferación o diferenciación de osteoblastos, tratamientos con medicamentos o factores de crecimiento, o diversas manipulaciones genéticas. Es importante destacar que este método se puede utilizar indistintamente para cuantificar el consumo de aminoácidos en líneas celulares cultivadas o células primarias in vitro o en ejes óseos aislados ex vivo. Finalmente, nuestro método se puede adaptar fácilmente para medir el transporte de cualquiera de los aminoácidos, así como la glucosa y otros nutrientes radiomarcados.
Introducción
Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen un grupo funcional amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) con una cadena lateral variable que es específica para cada aminoácido. En general, los aminoácidos son bien conocidos como el constituyente básico de la proteína. Más recientemente, se han dilucidado nuevos usos y funciones de los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos individuales pueden metabolizarse para generar metabolitos intermedios que contribuyen a la bioenergética, funcionan como cofactores enzimáticos, regulan las especies reactivas de oxígeno o se utilizan para sintetizar otros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muchos estudios demuestran que el metabolismo de los aminoácidos es crítico para la pluripotencia, proliferación y diferenciación celular en diversos contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Los osteoblastos son células secretoras que producen y secretan la matriz ósea extracelular rica en colágeno tipo 1. Para mantener altas tasas de síntesis de proteínas durante la formación ósea, los osteoblastos exigen un suministro constante de aminoácidos. Para satisfacer esta demanda, los osteoblastos deben adquirir activamente aminoácidos. De acuerdo con esto, estudios recientes revelan la importancia de la absorción de aminoácidos y el metabolismo en la actividad de los osteoblastos y la formación ósea 15,16,17,18,19,20.
Los osteoblastos adquieren aminoácidos celulares de tres fuentes principales: medio extracelular, degradación de proteínas intracelulares y biosíntesis de aminoácidos de novo. Este protocolo se centrará en la evaluación de la absorción de aminoácidos del entorno extracelular. Los métodos más comunes para medir la absorción de aminoácidos se basan en aminoácidos radiomarcados (por ejemplo, 3H o 14C) o marcados con isótopos pesados (por ejemplo, 13C). Los ensayos de isotopómeros pesados pueden analizar la absorción y el metabolismo de aminoácidos de manera más exhaustiva y segura, pero requieren más tiempo y tardan varios días en completarse, ya que se tarda un día en preparar y derivar muestras y varios días en analizarlas en el espectrómetro de masas dependiendo del número de muestras21,22. En comparación, los ensayos de captación de aminoácidos radiomarcados no son informativos sobre el metabolismo posterior, pero son baratos y relativamente rápidos, pudiendo completarse dentro de las 2-3 h desde el inicio del experimento23,24. Aquí, describimos un protocolo básico fácilmente modificable diseñado para evaluar la absorción de aminoácidos radiomarcados en células primarias cultivadas o líneas celulares in vitro o ejes óseos individuales ex vivo. La aplicación de estos dos protocolos puede extenderse a otros aminoácidos radiomarcados y otros tipos de células y tejidos asociados al hueso.
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Protocolo
Todos los procedimientos con ratones descritos en este documento fueron aprobados por los Comités de Estudios Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas. El protocolo de radiación fue aprobado por el Comité Asesor de Seguridad Radiológica del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en Dallas.
1. Captación de aminoácidos en las células (Protocolo I)
- Placa 5 x 104 células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos. Células en placa en α-MEM que contienen 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 0,1 μg/ml de estreptomicina (Pen/Strep). Coloque pocillos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones en el paso 1.12. Incubar células en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C con 5% deCO2.
- Cultive las células durante 2-3 días hasta que estén confluentes.
- El día del experimento, prepare las siguientes soluciones: 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4 y tampón Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-glucosa). Precalentar a 37 °C.
- Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 1 mL de 1x PBS, pH 7.4.
NOTA: Este protocolo también es apropiado para dividir rápidamente células no confluentes. En este caso, es importante normalizar la radiactividad al número absoluto de células o al contenido de ADN. Además, considere aumentar el tamaño de la placa de cultivo o matraz para aumentar el número total de células y los valores de cpm. Es importante determinar esto empíricamente sobre una base individual. - Aspirar 1x PBS y lavar las células una vez con 1 ml de KRH.
- Producir 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-glutamina diluyendo 4 μL de [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamina por 1 ml de KRH.
NOTA: Antes de usar materiales radiactivos, comuníquese con la Oficina de Seguridad Radiológica de su institución de origen para obtener aprobaciones. Todos los procedimientos relacionados con la radiación deben realizarse detrás del escudo de plexiglás. - Incubar células con 0,5 mL de KRH que contengan 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamina durante 5 min.
- Recoger el medio radiactivo y dispensar en el contenedor de residuos líquidos. Lave las células tres veces brevemente con KRH helado para terminar la reacción. Recoja y deseche todos los lavados en el contenedor de residuos líquidos radiactivos.
- Agregue 1 ml de SDS al 1% a cada pocillo y triture 10 veces para lisar y homogeneizar las células. Transfiera los lisados celulares a tubos de 1,5 ml. Deseche las placas de cultivo celular, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en el contenedor de residuos radiactivos sólidos.
- Centrifugar a >10.000 x g durante 10 min. Transfiera los sobrenadantes a viales de centelleo que contengan 8 ml de la solución de centelleo. Mezclar agitando vigorosamente los viales de centelleo. Desechar los tubos y las puntas de pipeta en un contenedor de residuos radiactivos sólidos.
- Lea la radiactividad en recuentos por minuto (cpm) usando un contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo en el contenedor de residuos del vial de centelleo.
- Tripsinizar, resuspender y contar las células de las placas no radiactivas restantes de las células (ver paso 1.1) para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemocitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental. Normalizar el cpm desde el paso 1.11 hasta el número de células estimado de las placas no radiactivas.
- Después de completar el experimento, descontamine la campana de cultivo celular, el banco y todos los instrumentos con un aerosol descontaminante de radiactividad. Finalmente, realice pruebas de limpieza para asegurarse de que el área de trabajo esté libre de radiación.
2. Captación de aminoácidos en tejidos óseos recién aislados (Protocolo II)
- Precalentar KRH a 37 °C.
- Eutanasia a un ratón de 3 días de edad y quitar la piel de los brazos. Desarticule el húmero del hombro con unas tijeras y diseccione ambos húmeros. Retire todos los tejidos extemporáneos con un bisturí y fórceps. Retire las epífisis del hueso.
NOTA: Además de los humerios, este protocolo se puede adaptar a fémures, tibias y calvarios neonatales, así como a humerios, fémures y tibias aislados de ratones de 2 y 4 meses de edad (datos no publicados). - Enjuague la médula del hueso y pese los ejes óseos para normalizarlos en el paso 2.14.
- Hervir un húmero en 1x PBS a 100 °C durante 10 min para descelularizar el hueso. El hueso hervido descelularizado se utiliza como control negativo.
NOTA: Como control de calidad, la parafina incrusta los huesos hervidos y no hervidos para las tinciones histológicas para confirmar visualmente que la ebullición fue eficaz en la descelularización del hueso. - Equilibrar ambos húmeros en 1 mL de KRH durante 30 min en la incubadora de cultivo celular a 37 °C.
- Hacer una solución de trabajo de 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginina en KRH diluyendo 4 μL de 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginina por 1 mL KRH.
NOTA: Este protocolo es apropiado para evaluar la absorción de cualquier nutriente radiomarcado que se elija. L-[2,3,4-3 H]-glutamina, L-[14CU]-alanina y L-[2,3-3 H]-prolina han sido probados con resultados similares. Se muestran datos de arginina para resaltar la utilidad de este protocolo.
PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos con radiación deben realizarse detrás del escudo de plexiglás mientras se usa el equipo de protección personal (EPP) adecuado. - Incubar el hueso control experimental y hervido por separado en KRH que contenga 4 μCi/ml de L-[2,3,4-3 H]-arginina durante un máximo de 90 min a 37 °C.
NOTA: Es importante determinar empíricamente los tiempos de incubación para diferentes condiciones, incluida la edad de los ratones, los diferentes elementos esqueléticos y los tipos de aminoácidos radiomarcados mediante la realización de un curso de tiempo. La saturación ocurre principalmente después de aproximadamente 3-4 h. La captación debe evaluarse en un punto temporal en la rabia lineal de la absorción. - Retirar el medio radiactivo y desecharlo en el contenedor de residuos radiactivos líquidos. Lave el húmero tres veces usando 1 ml de KRH para terminar la reacción. Deseche todos los lavados en el contenedor de residuos radiactivos líquidos.
- Transfiera cada hueso a un tubo de 1,5 ml. Añadir 500 μL de tampón RIPA [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (p/v); 0,1% SDS (p/v)]. Deseche las placas de cultivo, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en un recipiente de residuos sólidos radiactivos.
- Homogeneiza el húmero picando 100 veces con tijeras en un tampón RIPA.
- Sonicar (Amplitud: 35%, Pulso 1 s) el hueso homogeneizado resultante durante 10 s.
NOTA: También se sabe que la sonicación produce aerosoles. Los pasos de sonicación se pueden realizar en un gabinete de seguridad biológica. Para reducir la formación de aerosoles, es importante no llenar demasiado los tubos. La sonicación de pequeños volúmenes de muestra puede resultar en una sonicación incompleta o pérdida de muestras debido a la formación de espuma. Si se produce formación de espuma, centrifugar la muestra durante 5 minutos para que se asiente. - Aclarar el lisado por centrifugación durante 10 min a >10.000 x g a temperatura ambiente. Transfiera 200 μL del sobrenadante a viales de centelleo que contengan 8 ml de la solución de centelleo. Mezclar agitando vigorosamente los viales de centelleo. Deseche todos los desechos radiactivos sólidos (por ejemplo, tubos usados, puntas de pipetas, placas, etc.) en el contenedor de desechos radiactivos sólidos.
- Lea la radiactividad (cpm) con el contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo usados en el contenedor de residuos radiactivos designado para viales de centelleo.
- Resta el cpm del hueso hervido (valor basal) del cpm del hueso experimental. Normalizar la radiactividad con el peso óseo a partir del paso 2.3.
- Rocíe la campana de cultivo celular, los instrumentos y el banco con descontaminante de radiactividad. Realice pruebas de limpieza para confirmar que el área de trabajo está libre de radiación.
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Resultados
El transporte de aminoácidos está regulado por muchos transportadores de aminoácidos unidos a la membrana que han sido categorizados en distintos sistemas de transporte basados en numerosas características, incluyendo la especificidad del sustrato, la cinética, así como la dependencia de iones y pH25. Por ejemplo, la absorción de glutamina puede estar mediada por los sistemas de transporte dependientes de Na+ A, ASC, γ+L y N o el Sistema L independiente de Na+. Los sistemas d...
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Discusión
El protocolo descrito en este documento proporciona un enfoque rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos en respuesta a diversas permutaciones experimentales, ya sea in vitro o ex vivo. En comparación con los kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de determinación de glutamina y glutamato), este método es mucho más sensible, más rápido y menos laborioso16,17,25. En nuestro protoco...
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Divulgaciones
Los autores no tienen revelaciones.
Agradecimientos
El laboratorio Karner cuenta con el apoyo de subvenciones R01 del Instituto Nacional de Salud (AR076325 y AR071967) a C.M.K.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina | Gibco | 25200 | |
| Placa de 12 pocillos | Corning | 3513 | |
| 1 mL Jeringa | BD precisión | 309628 | |
| 30G Aguja | BD precisión | 305106 | |
| Arginina Monoclorhidrato L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 contador de centelleo | |||
| Cloruro de calcio | Sigma | C1016 | |
| Cloruro de colina | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Solución de glucosa | Sigma | G8769 | |
| Herramienta | Pinzas, tijeras, cajillas | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamina | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Solución de cloruro de litio, 8M | Sigma | L7026 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma | M8266 | |
| Gibco | 12561 | ||
| Tubo de microcentrífuga, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P3911 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S6014 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | S9888 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma | D6750 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& Materiales | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma 648311 | ||
| Ultima Gold (Solución de centelleo) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Metilamino)ácido isobutírico | Sigma | M2383 |
Referencias
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