Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

Resumen

El siguiente protocolo describe el desarrollo y la optimización de un flujo de trabajo de alto rendimiento para el cultivo de gusanos, imágenes de fluorescencia y procesamiento automatizado de imágenes para cuantificar los agregados de poliglutamina como una evaluación de los cambios en la proteostasis.

Resumen

Un aumento en la prevalencia de enfermedades conformacionales de proteínas neurodegenerativas (PCD) ha fomentado un gran interés en este tema a lo largo de los años. Esta mayor atención ha requerido la diversificación y mejora de modelos animales capaces de reproducir fenotipos de enfermedades observados en humanos con PCD. Aunque los modelos murinos han demostrado ser invaluables, son caros y están asociados con métodos laboriosos y de bajo rendimiento. El uso del modelo de nematodo Caenorhabditis elegans para estudiar PCD se ha justificado por su relativa facilidad de mantenimiento, bajo costo y rápido tiempo de generación, que permiten aplicaciones de alto rendimiento. Además, la alta conservación entre los genomas de C. elegans y humanos hace de este modelo una herramienta de descubrimiento invaluable. Los nematodos que expresan tractos de poliglutamina (polyQ) específicos de tejido marcados fluorescentemente exhiben una agregación dependiente de la edad y la longitud de polyQ caracterizada por focos fluorescentes. Tales reporteros a menudo se emplean como proxies para monitorear los cambios en la proteostasis a través de los tejidos. La cuantificación manual de agregados requiere mucho tiempo, lo que limita el rendimiento experimental. Además, la cuantificación manual de focos puede introducir sesgos, ya que la identificación agregada puede ser altamente subjetiva. Aquí, se estandarizó un protocolo que consiste en el cultivo de gusanos, la adquisición de imágenes y el procesamiento de datos para admitir la cuantificación agregada de alto rendimiento utilizando C. elegans que expresan polyQ específico del intestino. Al implementar una canalización de procesamiento de imágenes basada en C. elegans utilizando CellProfiler, un software de análisis de imágenes, este método se ha optimizado para separar e identificar gusanos individuales y enumerar sus respectivos agregados. Aunque el concepto de automatización no es del todo único, la necesidad de estandarizar tales procedimientos para la reproducibilidad, la eliminación del sesgo del conteo manual y el aumento del rendimiento es alta. Se anticipa que estos métodos pueden simplificar drásticamente el proceso de detección de grandes bibliotecas bacterianas, genómicas o de medicamentos utilizando el modelo de C. elegans .

Introducción

Las enfermedades conformacionales de proteínas neurodegenerativas dependientes de la edad (PCD), como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington, o la esclerosis lateral amiotrófica, se caracterizan por un mal plegamiento de proteínas que conduce a la agregación, la muerte celular y la degeneración tisular¹. Si bien el plegamiento incorrecto de proteínas se reconoce como el culpable, la etiología de estas enfermedades no está clara. Como tal, el desarrollo de terapias efectivas se ha visto obstaculizado por la falta de conocimiento sobre los factores y condiciones que contribuyen a la aparición y progresión de la enfermedad. Estudios recientes sugieren que los cambios en el microbioma influyen en el inicio, la progresión y la gravedad de las PCD ^2,3,4. Sin embargo, la complejidad del microbioma humano, o incluso murino, dificulta la realización de estudios que revelen la influencia exacta de los microbios en su huésped. Por lo tanto, los organismos más simples, como Caenorhabditis elegans, se utilizan a menudo como una herramienta^{de descubrimiento 5,6,7,8}. Estudios recientes han empleado C. elegans para investigar el efecto de las bacterias sobre la proteostasis del huésped y la patogénesis de la enfermedad ^9,10. La colonización bacteriana, la hormesis y los cambios genómicos se encuentran entre las condiciones ejemplares que afectan la agregación de los tractos de poliglutamina (polyQ) ^9,11,12. Además, estos grupos de proteínas mal plegados exhiben una acumulación dependiente de la longitud y la edad de polyQ dentro del huésped y se asocian con una motilidad deteriorada ^9,13. El enfoque relativamente simple de cuantificar los puntos marcados fluorescentemente puede generar datos importantes sobre condiciones, factores o medicamentos que afectan el plegamiento y la agregación de proteínas.

Aunque la cuantificación de la puntería fluorescente ha demostrado ser un procedimiento confiable y relativamente simple, el desafío sigue siendo desarrollar un protocolo que facilite la detección a gran escala de compuestos, bacterias o afecciones que afectan la agregación de proteínas. El concepto de procesamiento automatizado de imágenes de C. elegans y cuantificación de puntos no es del todo novedoso, ya que se han desarrollado una serie de herramientas prácticas de apoyo^14,15. Sin embargo, la integración del cultivo, la adquisición de imágenes y una canalización de procesamiento son esenciales para eliminar la variabilidad en los resultados y permitir pantallas de mayor rendimiento.

Como tal, la intención de este manuscrito es estandarizar el procedimiento utilizado para cuantificar la agregación de polyQ en C. elegans como un proxy para detectar cambios en la proteostasis. Esta tarea se logró mediante el empleo de CellProfiler, un software de análisis de imágenes de código abierto¹⁶ capaz de automatizar la identificación de gusanos y agregados, y está integrado en un protocolo más amplio para cultivar gusanos, adquirir imágenes y procesar datos.

Protocolo

Todos los procedimientos siguieron las pautas de seguridad que fueron revisadas y aprobadas por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Florida. Se tomaron las medidas de bioseguridad adecuadas para mitigar el riesgo de exposición a bacterias de nivel 2 de seguridad biológica.

NOTA: Para todos los experimentos, C. elegans debe propagarse y mantenerse en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con Escherichia coli OP50.

1. Preparación de placas NGM de 10 cm

1. Combine 3 g de NaCl, 2,5 g de trippticasa-peptona y 17 g de agar en un matraz de 2 L, y llene a 1 L con agua destilada doble (ddH₂O). Agregue una barra de agitación magnética antes del autoclave.
2. Autoclave la mezcla durante 45 min a 121 °C y una presión de 21 psi. Deje que la mezcla se enfríe a 50 °C en un baño de agua.
3. Utilizando técnicas asépticas, añadir las siguientes soluciones estériles: 1 mL de 1 M CaCl_2· 2H₂O, 1 mL de 1 M MgSO_4· 7H₂O, 1 mL de 5 mg/ml de colesterol disuelto en etanol al 100% (calentado a temperatura ambiente), y 25 mL de 1 M KH₂PO₄ (pH = 6.0). Mezclar con una placa de agitación magnética. La mezcla se puede realizar durante 1 min a 700 RPM.
4. Vierta hasta que la mezcla llene toda la placa de 10 cm. Alternativamente, use una pipeta serológica graduada para agregar aproximadamente 20 ml de mezcla por placa.
5. Deje que las placas se sequen durante 24 h a temperatura ambiente antes de sembrar con bacterias o guarde las placas planas a 4 ° C después del secado.
   NOTA: Todos los componentes de los medios se manejan mediante técnicas asépticas. Los pasos 1.3-1.4 deben realizarse en una campana de flujo laminar.

2. Preparación de agar NGM con FUDR en placas de 24 pocillos

1. Siga los pasos 1.1-1.3.
2. Suplementar NGM con 5-Fluoro-2′-desoxiuridina (FUDR) y mezclar para lograr una concentración final de 100 μg/mL.
   NOTA: FUDR inhibe la replicación del ADN y, como resultado, bloquea la reproducción de C. elegans al dirigirse a la línea germinal y la embriogénesis, lo que en última instancia afecta la vida útil. Por lo tanto, es importante permitir que los gusanos se desarrollen completamente en adultos jóvenes antes de transferirse a placas que contienen FUDR.
   PRECAUCIÓN: FUDR es tóxico y debe manejarse de acuerdo con la Hoja de datos de seguridad del fabricante.
3. Usando una pistola pipeta, dispense 1 ml de NGM-FUDR en cada pozo.
   NOTA: Este proceso se puede facilitar mediante el uso de un sistema automatizado de vertido de placas.
4. Deje que la placa se seque durante 24 h a temperatura ambiente antes de sembrar con bacterias o almacenar placas simples a 4 ° C.

3. Siembra de placas: OP50 y bacterias de prueba adicionales

1. Para preparar un cultivo nocturno de E. coli OP50, agregue 200 μL de una alícuota bacteriana de un caldo congelado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenga 250 ml de caldo De Luria fresco y estéril (LB).
   NOTA: El volumen del medio depende del número de placas que necesitan ser sembradas. Para preparar otros cultivos bacterianos, inocule un tubo de cultivo de 16 ml que contenga 5 ml de medio de crecimiento con bacterias de material congelado utilizando una punta de micropipeta estéril.
2. Incubar durante la noche en una incubadora de 37 °C, agitando a 220 RPM (rotaciones por minuto).
   NOTA: Use matraces esterilizados con al menos el doble del volumen de trabajo de los medios y selle con papel de aluminio en autoclave. Realizar la etapa de inoculación y dispensación bacteriana mediante técnicas asépticas.
3. Dispensar 1-2 ml del cultivo de E. coli OP50 durante la noche en el centro de cada placa NGM de 10 cm. Este cultivo no necesita ser extendido alrededor de la placa NGM.
4. Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente antes de su uso/almacenamiento.
   NOTA: Las placas sembradas con tapas se pueden colocar en una campana con flujo de aire para facilitar el secado.

4. Cultivo y siembra de placas: placas de 24 pocillos

1. Prepare un cultivo nocturno de las cepas bacterianas deseadas, siguiendo las instrucciones de cultivo que se encuentran en los pasos 3.1-3.2.
2. Transfiera 200 μL de cada cultivo bacteriano a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga agar NGM. Un volumen de 200 μL de bacterias cubrirá toda el área de agar, maximizando la cantidad de alimentos para garantizar que los gusanos no eviten el césped bacteriano.
3. Deje las placas abiertas en un gabinete de seguridad biológica (BSC) para facilitar el secado. Revise las placas periódicamente para evitar una deshidratación excesiva y cambie la orientación de la placa para promover un flujo de aire y secado uniformes. Las placas deben secarse dentro de las 5 h.
   NOTA: Cualquier trabajo con bacterias de Nivel 2 de Seguridad Biológica debe realizarse en BSC certificados y aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad.

5. Sincronización de edad

NOTA: Todos los pasos deben realizarse utilizando técnicas asépticas adecuadas (es decir, trabajar cerca de una llama o dentro de un BSC).

1. Lavar hermafroditas grávidas de placas OP50 de 10 cm con solución M9 esterilizada por filtro (5,8 g de Na₂HPO_4· 7H₂O, 3,0 g de KH₂PO₄, 5 g de NaCl, 0,25 g de MgSO₄·7H₂O, en 1 L de ddH₂O).
   1. Solución de pipeta M9 en la placa varias veces usando una pipeta serológica de vidrio estéril o plástico para levantar gusanos del césped bacteriano.
   2. Recoja la suspensión del gusano y transfiera la solución a un tubo cónico de poliestireno de 15 ml.
2. Centrífuga a 270 x g, temperatura ambiente (RT, ~23 °C), durante 2 min.
3. Aspire con un matraz de trampa de vacío y deseche el sobrenadante, dejando el gránulo de gusano sin molestar.
   1. Vuelva a suspender el pellet en 5-10 ml de M9 para lavar los gusanos y repita los pasos 5.2-5.3 dos veces.
4. Agregue 5 ml de solución blanqueadora al 20% (8,25 ml de ddH₂O, 3,75 ml de 1M NaOH, 3,0 ml de lejía no germicida) al tubo e invierta continuamente para disolver los gusanos. Los gusanos están listos para centrifugar una vez que se han disuelto casi por completo.
   NOTA: Los tiempos de blanqueo y el volumen de la solución blanqueadora dependerán del tamaño de la muestra. El blanqueamiento excesivo y insuficiente son errores comunes. Como tal, este proceso generalmente requiere optimización para determinar cuándo la muestra está lista para la centrifugación.
5. Centrifugar durante 2 min a 423 x g y desechar el sobrenadante.
6. Agregue 10 ml de M9 estéril para resuspendir el pellet de huevo.
   1. Centrifugar el tubo durante 2 min a 423 x g para peletizar los huevos. Retire el sobrenadante con un matraz aspirador.
   2. Repita los pasos 5.6-5.6.1.
7. Vuelva a suspender el pellet de huevo en 5 ml de M9 estéril y colóquelo en un nutator durante la noche a la temperatura deseada.
   NOTA: Las larvas L1 sincronizadas por la edad estarán listas para transferirse a las placas al día siguiente.

6. Preparación del gusano después de la sincronización de la edad

1. Centrifugar los gusanos sincronizados por la edad a 270 x g durante 3 min a RT (~23 °C).
2. Aspire el sobrenadante en un ambiente limpio, como una campana extractora o junto a un quemador Bunsen. Deje aproximadamente 200 μL del sobrenadante y resuspenda los gusanos.
3. Usando una micropipeta, transfiera la suspensión concentrada de gusanos a placas NGM de 10 cm que hayan sido previamente sembradas con OP50.
   NOTA: Cada plato puede soportar 1,500 gusanos sin quedarse sin comida; sin embargo, esta concentración puede requerir ajuste dependiendo de la densidad del césped bacteriano y la temperatura de crecimiento. Se recomienda usar múltiples placas para evitar que los gusanos se mueran de hambre. Es importante tener en cuenta que estas placas no deben contener FUDR.
4. Deje que las placas se sequen; a continuación, invierta y almacene a 25 °C durante 48 h.
   NOTA: Dependiendo de la condición de la pantalla, los gusanos del paso 6.1 se pueden colocar directamente en las placas de prueba (que contienen bacterias, medicamentos o compuestos de prueba). Si la condición de prueba deseada afecta el desarrollo, los gusanos deben cultivarse en NGM que contenga OP50 hasta adultos jóvenes (~ 48 h) antes de exponerlos a las condiciones de prueba.
5. Después de la incubación de 48 h, lave los gusanos de las placas con una solución M9 estéril y colóquelos en tubos cónicos.
   NOTA: Los gusanos adultos se hundirán en el fondo del tubo. El tiempo exacto variará según el número de gusanos recuperados de placas de 10 cm. En estas condiciones, los gusanos se asientan en 10 minutos.
6. Realice una inspección visual para determinar la duración del tiempo de asentamiento de modo que se eliminen los huevos residuales o las larvas eclosionadas.
7. Agregue 10 ml adicionales de M9 para enjuagar las bacterias residuales de los cuerpos de gusanos.
   1. Centrifugar los gusanos durante 2-3 min a 270 x g a 23 °C.
   2. Realice el paso de lavado 3 veces adicionales. Para obtener los mejores resultados, deje aproximadamente 1-1.5 ml de solución M9 en el tubo después del lavado final.
   3. Transfiera 10 μL de la suspensión del gusano a un portaobjetos de vidrio y cuente el número de gusanos.
   4. Ajuste la densidad del gusano a aproximadamente 150 gusanos por 10 μL de M9. La concentración de gusanos en suspensión se puede ajustar eliminando o agregando solución M9 después de la centrifugación.
   5. Confirme que la concentración deseada se ha establecido promediando los recuentos de varias gotas diferentes. Se recomienda promediar los recuentos de al menos tres gotas.
8. Utilizando técnicas asépticas, transfiera 10 μL de la suspensión de gusanos que contiene aproximadamente 150 gusanos a cada pozo de la placa de prueba.
9. Inspeccione los pozos bajo un microscopio para asegurarse de que cada uno tenga un número suficiente de gusanos. Se pueden agregar gusanos adicionales antes de la incubación.
10. Deje que las placas se sequen durante aproximadamente 10 minutos; y luego invertir y transferir a una incubadora de 25 °C durante 72 h.
    NOTA: El período de incubación final se puede ajustar para adaptarse a las necesidades del experimento. El tiempo de incubación de 72 h es suficiente para soportar el crecimiento de 150 animales que se alimentan de bacterias de 200 μL en una placa de 24 pocillos a 25 °C.

7. Preparación de gusanos para la obtención de imágenes

1. Para facilitar un asentamiento más efectivo y minimizar la pérdida de muestras, inmovilice los gusanos antes del lavado para evitar nadar.
   NOTA: Si se trabaja con pocas muestras, esto se puede lograr mediante la exposición al levamisol (100 μM). Sin embargo, si se trabaja con una gran cantidad de muestras, los gusanos pueden inmovilizarse por congelación. Además, la congelación prolongada (18-24 h) evitará el desarrollo adicional de agregados de polyQ durante la preparación.
   1. Coloque las placas de múltiples pocillos a -20 °C durante 15-20 minutos o hasta que los gusanos ya no se muevan.
   2. Retire las muestras del congelador y déjelas reposar durante 5 min.
2. Usando una micropipeta, agregue 1 ml de M9, enfriado a 4 ° C, a un pozo de interés, presione y presione repetidamente el émbolo 4-6 veces para lavar los gusanos en cada pozo.
   NOTA: A veces, los gusanos pueden adherirse a las puntas de las micropipetas. Como tal, se deben usar diferentes puntas entre cada pozo para evitar la mezcla de gusanos.
3. Transfiera la suspensión del gusano a un tubo de microcentrífuga y permita que los gusanos se hundan hasta el fondo.
4. Aspirar y desechar el sobrenadante. Lave la muestra un total de tres veces.
5. Después de que los gusanos se hayan asentado en el fondo durante el lavado final, aspire 500 μL de sobrenadante, dejando 500 μL para resuspend gusanos.
6. Transfiera la suspensión de gusano restante a una nueva placa plana de 24 pocillos y colóquela en un congelador de -20 ° C durante 48 h.
   NOTA: La congelación de gusanos reduce la fluorescencia de fondo y permite una mejor visualización de los agregados.

8. Imágenes

1. Retire las placas del congelador y deje que se descongelen, limpie el exceso de condensación y retire la tapa antes de tomar imágenes.
   NOTA: Los detalles de la captura de imágenes variarán según el equipo y el software utilizado. Los protocolos para esta sección solo deben servir como guía, y es de esperar modificaciones. También es necesario capturar imágenes en el formato de archivo tiff.
2. Durante la captura de imágenes, utilice los siguientes ajustes del microscopio: Tiempo de exposición, 500 ms; Aumento de 40x con adaptador de cámara de 0.63x (25.2x), intensidad GFP establecida en 100%.
   NOTA: Varias configuraciones y sistemas de microscopio podrían adquirir imágenes diferentes de las proporcionadas en la sección de resultados. Para lograr una descripción más universal de las imágenes requeridas, se proporcionan detalles más objetivos con respecto a las imágenes. Los agregados deben tener entre 1.0-10.0 píxeles de diámetro con una intensidad fluorescente de 0.10-1.0 (unidades arbitrarias, escala 0-1) para ser identificados adecuadamente por el CellProfiler. El fondo fluorescente para estas imágenes agregadas generalmente está por debajo del umbral de 0.10. Para las imágenes de campo brillante, la intensidad del gusano varía de 0.7-1.0 con una intensidad de fondo de 0.1-0.2. La longitud promedio de los gusanos en las imágenes de campo brillante varía de 250 píxeles a 350 píxeles de longitud desde la cabeza hasta la cola.
3. Ajuste los controles de luz transmitidos hasta que los gusanos aparezcan brillantemente iluminados en comparación con el fondo oscuro. Evite la sobreexposición; aumentará el tamaño del gusano.
4. Puede ser necesario alterar las posiciones de los gusanos dentro del pozo para evitar la aglomeración excesiva. Disperse los gusanos agrupados con una punta de pipeta.
5. Establezca el canal en GFP para establecer un plano focal para ambas imágenes.
   NOTA: Es esencial que el plano focal se determine en el canal GFP. Cualquier cambio en el enfoque realizado al capturar imágenes de campo brillante dará como resultado la desalineación de agregados y gusanos durante el análisis de imágenes.
6. Capture una imagen de campo brillante e inmediatamente tome su imagen fluorescente correspondiente sin perturbar la placa.
7. Ejecute imágenes de prueba a través de la canalización para determinar los valores de intensidad y tamaño de los objetos de la imagen de acuerdo con la "NOTA" después del paso 8.2.
   NOTA: CellProfiler puede proporcionar toda la información necesaria sobre la intensidad y longitud de los objetos antes del análisis.
8. Para evaluar las imágenes, primero, descargue CellProfiler¹⁷. Abra el software y arrastre y suelte las imágenes de interés en el cuadro Imágenes.
9. Haga clic en las imágenes de la lista de archivos para abrirlas.
10. En la esquina superior izquierda de la pantalla hay varios iconos; utilícelos para medir el tamaño de los objetos o ampliar una región específica. Seleccione la lupa para resaltar una región de interés.
11. Seleccione el icono de flecha para medir la longitud de los gusanos y los agregados.
12. Pase el cursor sobre el objeto deseado para determinar su valor de intensidad que se puede ver en la parte inferior de la pantalla.
    NOTA: Dado que todas las imágenes se toman en escala de grises, todos los valores de píxeles rojos, azules y verdes serán idénticos.

9. Análisis de imágenes

1. Para utilizar la canalización de análisis de imágenes de CellProfiler, asigne un nombre correcto a los pares de imágenes. Utilice el siguiente formato: P1_A01_S1_C1, donde P1 se refiere a la placa específica y su respectiva designación numérica; "A", se refiere a la fila y "01" a la columna; "S" se refiere a un par de imágenes específico para un solo pozo; "C" se refiere al canal, donde "1" se usa para denotar imágenes de campo brillante y "2" para imágenes fluorescentes.
2. Descargue CellProfiler (versión 4.1.3 o superior) desde el sitio web oficial¹⁷.
3. Descargue la canalización (Archivo complementario 1). Cargue la canalización (Pipeline) en CellProfiler seleccionando Archivo > Importar > Pipeline desde archivo.
   NOTA: Los módulos 2 y 3 se han desactivado ya que se han considerado innecesarios. Su función puede restablecerse si el análisis de imágenes no produce una separación e identificación satisfactorias de los gusanos; sin embargo, se requiere la modificación de la tubería.
4. Para incorporar estos módulos, seleccione las casillas ubicadas a la izquierda de cada módulo. Cambie el nombre de la imagen binaria de entrada para el módulo "UntangleWorms" a la imagen de salida del módulo "convertobjectstoimage".
5. Puede aparecer un mensaje de error durante el uso inicial relacionado con el Módulo 2. Si esto ocurre, continúe con el análisis.
6. Cargue un conjunto de entrenamiento utilizado para identificar gusanos en el módulo "UntangleWorms". Este conjunto de entrenamiento se puede encontrar en el Archivo Suplementario 2.
   1. Seleccione el módulo UntangleWorms para abrir su configuración.
   2. Identifique el nombre del archivo del conjunto de entrenamiento y seleccione el icono de carga del archivo.
   3. Cargue el archivo complementario 2 (conjunto de entrenamiento).
7. Cargue imágenes seleccionando el módulo Imágenes en la esquina superior izquierda. Arrastre y suelte imágenes con el nombre correcto como se describe en el paso 9.1.
8. Antes de analizar las imágenes, seleccione la carpeta de salida deseada que se utilizará para almacenar los resultados.
   1. Haga clic en el botón Configuración de salida ubicado cerca de la esquina inferior izquierda del programa.
   2. Seleccione el icono de carpeta a la derecha de Salida predeterminada para elegir la ubicación de salida deseada.
9. Seleccione el icono Analizar imágenes para comenzar el análisis de imágenes.
10. Si el análisis tarda demasiado en completarse y está atascado procesando una sola imagen, es probable que se deba a problemas de adquisición de imágenes. Si esto ocurre, cancele la ejecución y proceda a identificar las imágenes sin procesar ordenando la carpeta de salida y anotando qué nombres de imagen no se encuentran.
    NOTA: Las imágenes pueden requerir procesamiento adicional para eliminar artefactos grandes o intensamente iluminados que no pueden ser procesados por la tubería. En algunos casos, es posible que sea necesario excluir dichas imágenes del análisis.
11. Después de un análisis completo, el software organizará los resultados en una hoja de cálculo de Excel que contiene gusanos individuales (columna N) y su respectivo número de agregados (columna K).
    NOTA: Una ejecución exitosa producirá una hoja de cálculo de Excel que contiene el número de agregados por gusano identificado para cada pozo. Estos datos pueden ser manipulados de una manera determinada por el experimentador.
12. Descargue el organizador de metadatos (interfaz gráfica de usuario) desde el archivo suplementario 3 (Windows) o el archivo suplementario 4 (Mac) para organizar convenientemente los datos del archivo CSV de salida de CellProfiler.
    NOTA: Este software no tiene una licencia oficial y no se abrirá automáticamente después de la descarga.
13. Siga los pasos 9.14-9.17 si usa el sistema operativo Windows de 64 bits. El software no funcionará en Windows de 32 bits. Siga los pasos 9.18-9.20 si utiliza Mac OS. Los pasos 9.21-9.22 son los mismos para ambos sistemas operativos.
14. Para el sistema operativo Windows, localice el archivo descargado y extráigalo a la ubicación deseada.
15. Localice y abra la carpeta extraída llamada gui_windowsOS_64x e inicie la aplicación haciendo clic en el icono de la aplicación "gui".
16. Es posible que se abra un mensaje solicitando permiso para ejecutarse. Seleccione Más información y, a continuación, haga clic en Confiar de todos modos.
17. El organizador de metadatos está listo para arrastrar y soltar archivos CSV de salida de CellProfiler. Continúe con el paso 9.21.
18. Para Mac OS, localice el archivo descargado y abra gui_macOS_64x.zip. Este paso debería extraer automáticamente todos los archivos.
19. Abra la carpeta extraída que se encuentra en "Descargas".
20. Haga clic derecho en la aplicación "gui" y seleccione Abrir. Aparecerá un mensaje pidiendo permiso para abrir debido a la falta de una licencia oficial. Seleccione Abrir y continúe con el paso 9.21.
21. Haga clic en Cargar sus archivos aquí o arrastre y suelte los archivos CSV de CellProfiler deseados.
22. Haga clic en el botón Organizar , que llevará al usuario a una nueva pantalla con un botón Descargar archivos . Haga clic en el botón y seleccione la ubicación deseada para guardar el archivo de salida. El archivo de salida aparecerá como el nombre de archivo original con la extensión "_organized" agregada al nombre del archivo.

Resultados

Aquí se describe un flujo de trabajo de C. elegans que incluye protocolos de cultivo, adquisición de imágenes y procesamiento que permiten la evaluación de la agregación de polyQ en presencia de varias bacterias utilizando un formato de placa de 24 pocillos como plataforma de cultivo e imágenes (Figura 1). Este protocolo se puede ajustar para estudiar el efecto de bacterias, condiciones específicas, moléculas pequeñas, medicamentos o manipulaciones genómicas en la proteostasis del huésped. El método descrito se ha optimizado utilizando gusanos que expresan constitutivamente poliQ intestinal fusionado a una proteína fluorescente amarilla (vha6p::p olyQ44::YFP); sin embargo, otros modelos que informan sobre la proteostasis en el músculo o las neuronas también se pueden utilizar con una mayor optimización. Por ejemplo, experimentos preliminares demuestran la aplicación de estos métodos en la cuantificación de agregados proteicos en otros tejidos como el poliQ muscular (Figura suplementaria 1). Sin embargo, se requerirá una modificación de la tubería para ajustar adecuadamente el tamaño y el brillo agregados, como se menciona en la sección 8 NOTA.

Figura 1: Representación visual del flujo de trabajo. Los pasos principales del protocolo incluyen cinco etapas distintas: preparación del gusano y sincronización de la edad (pasos 1-5), colonización intestinal / tratamiento del gusano (paso 6), preparación de muestras para imágenes (paso 7), adquisición de imágenes (paso 8) y procesamiento de imágenes (paso 9). Las "Secciones" del protocolo se denominan "Pasos" en la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los experimentos iniciales de optimización revelaron varias dificultades asociadas con el hacinamiento debido a un gran número de progenies, lo que resultó en un agotamiento más rápido de los alimentos. La suplementación de FUDR en placas NGM descrita en la sección 2 resolvió este problema (Figura 2). Además, en presencia de FUDR, los gusanos que fueron alimentados con varias bacterias tenían un tamaño corporal más consistente, lo que permitió una detección de gusanos más uniforme y precisa.

Figura 2: El uso de FUDR mejora la calidad de la imagen al reducir la progenie. Las placas suplementadas con FUDR eliminan la progenie de C. elegans en comparación con los gusanos cultivados en placas NGM de control no FUDR sembradas con E. coli OP50. Las imágenes se adquirieron con un aumento de 25,2x (aumento de 40x con un adaptador de cámara de 0,63x). Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La fluorescencia de fondo contribuyó a la detección de falsos positivos de agregados poliQ. Para reducir dicha señal de fluorescencia en el tracto intestinal y mejorar la detección automatizada de agregados, fue necesario congelar los gusanos antes de la obtención de imágenes. La congelación de gusanos a -20 °C durante 18-48 h mejoró significativamente la detección de agregados poliQ al eliminar la fluorescencia de fondo (Figura 3A). El ojo humano es capaz de diferenciar entre agregados y fluorescencia de fondo; por lo tanto, el conteo manual antes y después de la congelación es el mismo (Figura 3B). Sin embargo, el conteo automatizado no es tan preciso, pero la congelación mejoró significativamente los recuentos automatizados con una precisión comparable al conteo manual (Figura 3B).

Figura 3: La congelación mejora la detección agregada. (A) Imágenes fluorescentes de C. elegans que expresan poliQ44 intestinal::YFP antes y después de la congelación. Las inserciones representan imágenes de primer plano del área seleccionada. Barras de escala = 500 μm. (B) Número medio de agregados por intestino en gusanos colonizados con P. aeruginosa MPAO1 antes y después de la congelación mediante cuantificación de agregados manual o automatizada (tubería). Los datos representan dos réplicas biológicas (n = 60-109). La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student (**** p < 0,0001). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se utilizó iluminación de campo brillante invertido para detectar todo el canal C. elegans (Figura 4A) y GFP para obtener imágenes de agregados polyQ44::YFP (Figura 4B). La detección de gusanos, el desenredo y la cuantificación agregada para cada gusano se realizaron mediante la aplicación de una canalización de procesamiento de imágenes CellProfiler optimizada (Archivo suplementario 1), que permite obtener el número de agregados por gusano individual (Figura 4C-D). Para probar la viabilidad de este enfoque y la precisión de la detección y cuantificación automatizada de agregados, se cultivaron gusanos que expresan poliQ44::YFP específico del intestino y se prepararon para la obtención de imágenes de acuerdo con los protocolos establecidos (secciones 1-7). El número de agregados por gusano se evaluó utilizando la tubería automatizada (secciones 8-9) o el conteo manual. Cada experimento se realizó en tres ensayos independientes utilizando 90-571 gusanos por condición. Si bien el número promedio de agregados por intestino obtenidos con dos ensayos no tuvo diferencias significativas, los gusanos en el tercer ensayo tuvieron significativamente menos agregados cuando se cuantificaron mediante el enfoque automatizado (Figura 5A). El número promedio de agregados de los tres ensayos dio lugar a agregados ligeramente, pero significativamente menores, cuando la cuantificación se realizó utilizando la tubería CellProfiler (secciones 8-9) (Figura 5B). No obstante, la diferencia entre los dos enfoques fue mínima, lo que indica que el método automatizado se puede aplicar a pantallas a gran escala.

Figura 4: Detección de agregados mediante CellProfiler. (A) Imagen de campo brillante utilizada para identificar cuerpos de gusanos. (B) Imagen fluorescente original adquirida utilizando el canal GFP y utilizada para identificar y cuantificar un número total de agregados intestinales poliQ44::YFP. (C) Agregados identificados usando CellProfiler. (D) Un número total de agregados identificados superpuestos sobre la imagen fluorescente original con contornos de gusanos y agregados. La captura y el procesamiento de imágenes se realizaron utilizando los ajustes descritos en las secciones 8-9. Los paneles E-H representan imágenes en primer plano de las regiones delineadas correspondientes en las imágenes A-D. Las imágenes se adquirieron con un aumento de 25,2x (aumento de 40x con un adaptador de cámara de 0,63x). Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Eficacia de la cuantificación agregada automatizada. (A) Número agregado promedio por intestino en gusanos colonizados con control E. coli OP50 utilizando conteo manual (Manual) y cuantificación automatizada basada en CellProfiler (Pipeline). Los resultados representan los datos analizados en tres ensayos separados (T1-T3) (n = 90-571). (B) El número promedio de agregados por intestino se obtuvo utilizando la cuantificación manual o automatizada (Pipeline) de agregados. La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student (* p < 0,05, ** p < 0,01). Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para evaluar la reproducibilidad de los resultados entre diferentes experimentadores, las imágenes de una placa que contenía seis pocillos de gusanos que fueron alimentados con Pseudomonas aeruginosa MPAO1 o Escherichia coli OP50, fueron adquiridas por tres individuos, dos de los cuales no tenían experiencia previa en la obtención de imágenes de gusanos utilizando estos protocolos. Las imágenes recolectadas de cada pozo contenían entre 30 y 115 gusanos detectados. Se detectó una diferencia no significativa en la agregación en gusanos de los mismos pozos que fueron fotografiados por los tres experimentadores. Si bien el número promedio de agregados por intestino se mantuvo muy consistente entre los tres experimentadores de gusanos alimentados con MPAO1 y OP50, hubo algunas diferencias estadísticamente significativas en el número promedio de agregados, pero solo en gusanos colonizados por MPAO1 (Figura suplementaria 2). Estos resultados resaltan la reproducibilidad de los resultados incluso entre experimentadores inexpertos.

Para garantizar que la reproducibilidad de la cuantificación agregada no esté influenciada significativamente por la posición del gusano, se seleccionó un conjunto de 15 gusanos y se tomaron imágenes 15 veces separadas después de la agitación entre cada captura de imagen utilizando una punta de pipeta. Las imágenes de agregados en gusanos alimentados con E. coli OP50 y P. aeruginosa MPAO1 se recolectaron y analizaron utilizando CellProfiler. El número promedio de agregados de cada uno de estos diferentes conjuntos de imágenes fue ligeramente pero no significativamente diferente, lo que respalda aún más la reproducibilidad de este enfoque (Figura suplementaria 3).

Se ha demostrado que la colonización del intestino de C. elegans con patógenos entéricos gramnegativos altera la proteostasis en los tejidos, siendo P. aeruginosa uno de los inductores más potentes de la agregación poliQ⁹. Para determinar si estos protocolos optimizados detectarán y cuantificarán con éxito la mejora de la agregación mediada por P. aeruginosa, se colonizaron gusanos que expresan polyQ intestinal con E. coli OP50 (bacteria de control) y P. aeruginosa MPAO1, secciones 1-8. Las imágenes adquiridas se analizaron utilizando CellProfiler (sección 9, Archivo suplementario 1). Los resultados de la cuantificación automatizada muestran un aumento significativo en el número de agregados inducidos por P. aeruginosa MPAO1, lo que resulta consistentemente en una mejora doble en comparación con los gusanos alimentados con E. coli OP50 de control (Figura 6).

Figura 6: Número medio de agregados por intestino en gusanos colonizados con E. coli control OP50 y P. aeruginosa MPAO1. El número de agregados por intestino se evaluó mediante CellProfiler (secciones 8-9). Los datos se representan como el número promedio de agregados por intestino en gusanos colonizados con OP50 (n = 1068) y MPAO1 (n = 1557). La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student (**** p < 0,0001). Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La tubería optimizada fue diseñada para soportar pantallas a gran escala para condiciones que afectan la proteostasis. Para probar la viabilidad de este enfoque en el cribado de grandes bibliotecas de bacterias por su efecto sobre la proteostasis del huésped, se empleó la tubería descrita en este documento (secciones 1-9) para probar el efecto de 90 cepas mutantes no esenciales de 90 P. aeruginosa en la agregación de polyQ¹⁸. Esta pantalla piloto es parte de un proyecto más grande diseñado para examinar todas las cepas mutantes no esenciales de P. aeruginosa por su capacidad para influir en la proteostasis del huésped. De las 90 cepas bacterianas analizadas, la colonización del intestino de C. elegans con un candidato mostró una disminución significativa en el número de agregados (Figura 7). Los experimentos de seguimiento para evaluar la sensibilidad de este ensayo se realizaron a través de recuentos agregados manuales a partir de una selección aleatoria de seis mutantes de P. aeruginosa que diferían de manera no significativa del control MPAO1. Estos experimentos se realizaron utilizando las placas NGM de 6 cm más tradicionales, transfiriendo gusanos a cepas de prueba como L1 para recapitular métodos previamente establecidos⁹. Los experimentos de confirmación mediante conteo manual revelaron que ninguno de los mutantes, incluido el que disminuyó significativamente el número de agregados (Figura 7), afectó la agregación polyQ (Figura suplementaria 4). Además, los cambios sutiles en la agregación observados en el cribado de las 90 cepas mutantes no se detectaron entre los recuentos manuales de candidatos seleccionados, lo que indica que tales cambios podrían surgir debido a la variabilidad biológica y experimental, como el bajo valor de n. En conjunto, los resultados indican que, si bien nuestro método puede detectar de manera confiable cambios significativos, es probable que se pierdan los sutiles y todos los candidatos potenciales deberán confirmarse individualmente.

Figura 7: El número de agregados por intestino en un conjunto de muestras representativas de gusanos colonizados por 92 cepas bacterianas. Los datos se representan como el número promedio de agregados por intestino normalizado al de los gusanos colonizados con MPAO1. Las líneas punteadas representan el número promedio de agregados en gusanos colonizados con control MPAO1 (arriba, círculo abierto) y OP50 (abajo, cuadrado abierto). Los símbolos sólidos representan 90 cepas mutantes knock-out distintas de P. aeruginosa MPAO1. El número promedio de agregados por gusano entre gusanos colonizados con MPAO1 y un solo mutante fue estadísticamente significativo. Los círculos grises representan muestras que se confirmaron manualmente (Figura suplementaria 4). La significación estadística se calculó mediante el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido de la comparación múltiple de la prueba post-hoc de Dunnett (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para gestionar la gran cantidad de datos generados por CellProfiler, se desarrolló una interfaz gráfica de usuario (GUI) para automatizar el procesamiento y la organización de los datos (Figura 8). La GUI se desarrolló utilizando Tkinter, un kit de herramientas de widgets multiplataforma de Python de código abierto. De los metadatos dados, la aplicación extrae el número de agregados (columna K) de cada pozo (columna J) presente en una placa. Se utilizó una biblioteca de manejo de datos de Python llamada "Pandas" para llevar a cabo el proceso antes mencionado. La aplicación GUI proporciona soporte de arrastrar y soltar para que los usuarios carguen archivos de datos. Los datos en cada archivo se almacenan en forma de una estructura tabular bidimensional llamada marco de datos. Se inicializa un par de diccionarios vacíos para cada pozo único que se encuentra dentro del marco de datos. A continuación, los distintos agregados encontrados en cada pozo se cuentan y se agregan a sus respectivos pares de diccionarios. La columna con menos datos se rellena con cadenas de valores vacías para garantizar que cada columna tenga un tamaño uniforme. Finalmente, la estructura se convierte en un marco de datos que se exporta en forma de hoja de cálculo al directorio especificado por el usuario.

Figura 8: Interfaz gráfica de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Detección de agregados poliQ específicos del músculo. Los gusanos que expresan poliQ35::YFP específico del músculo fueron chapados como L1 y cultivados en OP50 durante 48 h. Una vez que los gusanos se convirtieron en adultos jóvenes, se transfirieron a placas NGM de 24 pocillos, se complementaron con 100 μg / ml de FUDR y se sembraron con MPAO1 durante 72 h adicionales antes de la toma de imágenes. (A) Imagen de campo brillante utilizada para identificar cuerpos de gusanos. (B) Imagen fluorescente original adquirida mediante el canal GFP. (C) Agregados identificados usando CellProfiler. (D) Un número total de agregados identificados superpuestos sobre la imagen fluorescente original con contornos de gusanos y agregados. La captura y el procesamiento de imágenes se realizaron utilizando los ajustes descritos en las secciones 8-9. Los paneles E-H representan imágenes en primer plano de las regiones delineadas correspondientes en las imágenes A-D. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Reproducibilidad de la cuantificación agregada entre diferentes experimentadores. Número medio de agregados cuantificados utilizando CellProfiler para seis pocillos de gusanos colonizados con P. aeruginosa MPAO1 (barras negras) y seis pocillos de gusanos colonizados con control E. coli OP50 (barras grises). Cada pozo fue fotografiado por tres experimentadores (AVS, DMC, RDH). Los datos se representan como el número promedio de agregados por intestino (n = 30-115). La significación estadística se calculó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (* p < 0,05, ** p < 0,01). Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: El efecto de la posición del gusano en la reproducibilidad de la cuantificación agregada. Número agregado promedio por intestino en gusanos colonizados con control E. coli OP50 (barras grises) y P. aeruginosa MPAO1 (barras negras). Los resultados representan el número promedio de agregados por intestino (15≥n≥12) cuantificados utilizando CellProfiler. La posición de los gusanos dentro de los pozos fue cambiada por agitación entre cada adquisición. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en ninguno de los grupos. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Confirmación de la pantalla piloto con conteo manual. El número promedio de agregados por intestino se cuantificó manualmente. Los datos representan perfiles de agregación de gusanos colonizados con seis mutantes knock-out MPAO1 (círculos grises Figura 7) comparados con controles MPAO1 y OP50 de tipo salvaje (n = 30). La significación estadística se calculó mediante ANOVA unidireccional seguido de la comparación múltiple de la prueba post-hoc de Dunnett (**** p < 0,0001). Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 5: El efecto de FUDR en la agregación intestinal de polyQ. Los datos se representan como el número promedio de agregados de polyQ44::YFP por intestino (n = 20). Los gusanos se transfirieron a placas de control (sin FUDR) o que contenían FUDR (100 μg/ml) después de 48 h de crecimiento a 25 °C en E. coli OP50. Los recuentos manuales se recogieron después de 48 h adicionales. La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student (ns = no significativa). Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 1: Tubería de proteostasis. Canalización de análisis de imágenes descargable para su uso en CellProfiler. Las instrucciones para la solicitud se pueden encontrar en la sección 9. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Conjunto de entrenamiento desenredando gusano. Archivo que se cargará en el módulo "UntangleWorms". Este conjunto de entrenamiento en particular es específico para los gusanos utilizados en el enfoque inicial. Las alteraciones en el tamaño y la forma del gusano cambiarán la precisión y la calidad de la identificación. Puede ser necesario crear un archivo de entrenamiento más personalizado. Las instrucciones para crear un nuevo conjunto de entrenamiento se pueden encontrar en el sitio web oficial de CellProfiler¹⁷. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Interfaz gráfica de usuario para el sistema operativo Windows. gui_windowsOS_64x.zip. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Interfaz gráfica de usuario para el sistema operativo Mac. gui_MacOS_64x.zip. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo descrito describe los procedimientos para el cultivo, la obtención de imágenes y el procesamiento de imágenes de C. elegans que incorpora CellProfiler, un software de análisis de imágenes de código abierto. Los resultados representativos demuestran reproducibilidad, reducción del sesgo y escalabilidad. Este procedimiento estandarizado mejorará las estrategias de detección empleadas con grandes bibliotecas bacterianas, genómicas o de medicamentos. Si bien existen otros métodos automatizados de detección de objetos de C. elegans , la técnica descrita ofrece una canalización estandarizada y de mayor rendimiento que integra el cultivo, la adquisición de imágenes y el análisis.

Varias variaciones del cultivo de gusanos tuvieron que ser probadas para optimizar el protocolo descrito en este documento. Inicialmente, los gusanos se transfirieron a las bacterias de muestra inmediatamente después de la sincronización de la edad (etapa L1). Sin embargo, tal enfoque resultó en una población de gusanos con tamaños variables, incluso entre gusanos dentro del mismo pozo. C. elegans es conocida por evitar patógenos¹⁹, lo que podría haber contribuido a la variabilidad observada en el tamaño y, en última instancia, afectar la detección de gusanos de imágenes aguas abajo, en particular. Para eliminar tal variabilidad, toda el área de NGM en cada pozo se cubrió con bacterias de prueba. Además, los gusanos fueron alimentados con E. coli OP50 y se les permitió desarrollarse completamente en adultos jóvenes durante 48 h a 25 ° C. Permitir que los gusanos alcancen la edad adulta en E. coli OP50 antes de transferirlos a las bacterias de prueba resultó en un tamaño corporal más consistente. Además, el hacinamiento y el rápido agotamiento de los alimentos por la progenie se eliminaron complementando el agar NGM con FUDR. La implementación de FUDR eliminó la progenie y mejoró la identificación automatizada de gusanos, que se vio oscurecida por la mezcla de la progenie con la población parental. Sin embargo, es importante ser cauteloso y utilizar los controles apropiados al utilizar FUDR, ya que se sabe que el compuesto afecta la proteostasis y la vida útil de C. elegans ^20,21. En las condiciones descritas en este protocolo, el FUDR no afectó la agregación intestinal de polyQ (Figura suplementaria 5); por lo tanto, su utilización fue adecuada y beneficiosa para el método descrito.

La congelación de muestras antes de la toma de imágenes resultó ser un paso crítico en el empleo exitoso de la tubería. Los recuentos agregados antes de la congelación fueron significativamente más altos que los recuentos manuales (Figura 3B). Mantener los gusanos a -20 °C durante 18-48 h antes de la toma de imágenes redujo la fluorescencia de fondo y, en última instancia, mejoró la detección de agregados (Figura 3A). Los efectos de la congelación en la detección de agregados solo se han investigado para polyQ y no deben generalizarse a otros modelos sin una mayor investigación de dichos efectos.

A pesar de que todas las condiciones se mantuvieron iguales, se observó que el número promedio de agregados por gusano podría variar entre diferentes tiradas, mientras que la relación entre el número de agregados en animales colonizados con OP50 versus MPAO1 se mantuvo consistente (Figura 6, Figura suplementaria 2, Figura suplementaria 5). Por lo tanto, es esencial incluir siempre el control E. coli OP50, o cualquier control de referencia adicional adecuado, en cada ejecución. Tal variabilidad en los recuentos agregados entre experimentos podría estar influenciada por las condiciones ambientales (temperatura, humedad)^22,23 o los antecedentes genéticos⁸. De hecho, se observó que después de un cultivo prolongado, la fluorescencia intestinal disminuyó drásticamente o se perdió por completo, lo que requirió la descongelación de una nueva cepa de stock congelado. La disminución observada en la fluorescencia podría ser el resultado de cambios genéticos que suprimen los transgenes tóxicos, como los que expresan poliQ. No obstante, la excepcional reproducibilidad de los resultados observados entre diferentes experimentadores (Figura suplementaria 2), entre réplicas biológicas (Figura 5) y dentro de la misma muestra (Figura suplementaria 3) enfatiza la fuerza de este enfoque.

Numerosos informes han empleado polyQ intestinal para estudiar la proteostasis 9,11,12,13,24,25. Sin embargo, no se puede hacer una comparación directa entre los resultados debido a la variabilidad entre los enfoques experimentales y los métodos de lectura. No obstante, algunos resultados de datos publicados anteriormente son recapitulados por la cuantificación automatizada descrita en este documento, incluida la inducción bacteriana de la agregación ^9,13 y un número comparable de agregados¹¹. Colectivamente, la tubería descrita ofrece una herramienta valiosa para estudiar la proteostasis.

El método descrito en este documento tiene algunos desafíos inherentes. Por ejemplo, requiere tiempo suficiente para dominar todos los componentes de este protocolo, lo que es especialmente cierto para la sección 8 del protocolo, que requiere familiaridad con el ensayo para determinar si las imágenes adquiridas son apropiadas para el análisis de tuberías. Las desviaciones de la configuración de adquisición de imágenes utilizada en este protocolo son posibles; sin embargo, es probable que se requiera la modificación de la configuración y el conjunto de entrenamiento de gusanos. Esta tubería puede distinguir agregados de varios tamaños y aquellos que se tocan, lo que limita la "mezcla" de agregados y, en última instancia, aumenta la sensibilidad de detección. Sin embargo, pueden surgir problemas al intentar identificar agregados grandes que exceden el rango de tamaño aceptado, ya que la expansión del umbral de tamaño superior puede provocar errores causados por una identificación deficiente, como la incapacidad de diferenciar los agregados que se tocan. Se debe encontrar un equilibrio entre precisión, tamaño e intensidad antes del análisis de imágenes. La eficiencia de la identificación de agregados podría mejorarse aún más mediante la incorporación del aprendizaje automático para crear una red neuronal capaz de mejorar la detección de agregados. Tales mejoras se están explorando actualmente y ayudarán en gran medida a abordar los problemas actuales, como la detección de agregados que se encuentran en diferentes planos focales o que tienen formas anormales.

Una debilidad notable del método descrito es la variabilidad en los recuentos de agregados automatizados, ya que no siempre se recapitulan mediante recuentos manuales en gusanos alimentados con diferentes cepas bacterianas. Por ejemplo, según los recuentos automatizados, los gusanos alimentados con P. aeruginosa mutante 53 (M53) tenían significativamente menos agregados en comparación con la cepa de tipo salvaje (MPAO1) (Figura 7); sin embargo, la confirmación del acierto no mostró diferencias significativas (Figura suplementaria 4). En general, las pruebas de detección de drogas de alto rendimiento tienen una alta tasa de detección de golpes falsos positivos, y el método descrito no es una excepción²⁶. Por lo tanto, es una parte crítica del protocolo para confirmar todos los posibles éxitos.

Si bien este protocolo se optimizó para adaptarse a una estrategia de detección para identificar las bacterias que afectan la proteostasis del huésped, cada paso se puede modificar aún más para probar el efecto de las bibliotecas de ARNi genómico, moléculas pequeñas u otras afecciones. Se pueden realizar modificaciones adicionales en cada paso para adaptarse a los requisitos de una estrategia de detección específica. Además, esta técnica proporciona un nivel de flexibilidad que permite la optimización de cada paso para adaptarse a un modelo específico. Por ejemplo, este enfoque puede extenderse a la agregación poliQ en otros tejidos o a la extracción de otras características detectadas en imágenes, como el monitoreo de la expresión génica utilizando reporteros fluorescentes inducibles (por ejemplo, genes de choque térmico), la evaluación de la localización subcelular de proteínas (por ejemplo, la localización nuclear de DAF-16), el estudio de la agregación en otros modelos de enfermedad (Aβ_1-42, α-sinucleína, TDP-43, etc.) o la evaluación de fenotipos fisiológicos, como el tamaño del gusano.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubos de 1,7 mL Olympus	Plastics	Cat#24-282 Tubos de	microcentrífuga
10 mL Pipetas serológicas	GenClone	Cat#12-104	Pipetas de plástico
Tubos de centrífuga de 15 mL, con bastidores	Olympus Plastics	Cat#28-101	Tubos cónicos
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Fisher Scientific	D2235100MG	FUDR
Accu-jet Pro Pipeta Controller	Genesee Scientific	91-600RB Pistola de	pipetas
Agar	Fisher Scientific	Cat#BP1423-2	Agar granulado
BioRender BioRender			Generador de figuras gráficas
Lejía (Regular)	Clorox	Bar# 044600324111, Lejía sin salpicaduras 4,5	% de hipoclorito
de sodioC. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]	Morimoto Lab (Northwestern University)	AM140, Q35::YFP	Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]	Morimoto Lab (Northwestern University)	AM738, Q44::YFP	Intestinal polyQ
CaCl2· 2H2O	Fisher Scientific	Cat#C79-500	Cloruro de calcio dihidratado
CellProfiler Broad	Institute		Software de análisis de imágenes
Colesterol	Fisher	Scientific Cat#ICN10138201
Colesterol Circulante Baño de agua	Cabezal Lauda	26LE	Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 montura dir STEREO	CoolLED	8114931	Control y emisor de luz fluorescente
16 mL Tubos de cultivo	Olympus Plastics	21-129 Tubos de	cultivo, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	E. coli cepa de control
Etanol, 200 pruebas	Decon Labs, Inc.	2701
Ocular 10x/23B, ajustable, 3d gen	Leica Microsystems	10450910	Juego de oculares
Juego de filtros ET GFP - MZ10F	Leica Microsystems	10450588	Cubo de filtro
GraphPad Prism v9.2.0	GraphPad Software, Inc.		Herramienta de análisis estadístico
Heratherm Incubadora IMP180	Thermo	51031562	Incubadora refrigerada
Innova 4000	New Brunswick Scientific	M1192-0000	Incubadora agitadora
K5 Cámara	Leica Microsystems	11547112	Cámara de microscopio estereoscópico
KH2P04	Fisher Scientific Cat	#P285-3	Fosfato de potasio monobásico
LAS X Software de imagen	Leica Microsystems		Software de imagen para microscopio
Leica MZ10 F Portador óptico	Leica Microsystems	10450103	Microscopio estereoscópico
Levamisole	Fisher Scientific	Cat#0215522805	Clorhidrato de levamisol
Caldo Luria (Lennox)	Productos de Apex Bioresearch	Cat#11-125	LB
Placa de agitación magnética	Fisher Scientific	11-100-49S	Placa de agitación
MgSO4· 7H2O	Alfa Aesar	A14491	Sulfato de magnesio heptahidratado
Portaobjetos de microscopio	Premiere	8205	Portaobjetos de microscopio esmerilados simples
Na2HPO4· 7H2O	Fisher Scientific	Cat#S373-500	Fosfato de sodio dibásico heptahidratado
NaCl	Fisher Scientific	Cat#S671-500	Cloruro de sodio
NaOH	Fisher Scientific	Cat#S318-3	Pellets de hidróxido de sodio
Objetivo Acromático, f = 100 mm	Leica Microsystems	10411597	Lente
Placas de Petri	Genesee Scientific	Cat#32-107G	100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Biblioteca de Mutantes	Manoil Lab (Universidad de Washington)		P. aeruginosa Biblioteca de mutantes
Placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos, fondo plano	Olympus Plastics	25-102	Se utiliza para el crecimiento de gusanos y la obtención de imágenes
Tubo trinocular 100% serie M Leica	Microsistemas	10450043
Tripticasa Peptona	ThermoFisher, Difco	Cat#211921
Rotor TX-400	Thermo Scientific	Cat#75003181	Rotor de cubeta oscilante
Sistema de filtro accionado por vacío	GenClone	Cat#25-227	500 mL, MEMBRANA PES, .22 µ m
Objetivo de vídeo con montura C Leica	Microsystems	10447367	tubo adaptador de cámara de 0,63x