Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .
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Artículo de método
Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales
En este artículo
Resumen
Resumen
Streptomyces spp. son una fuente importante de antibióticos clínicos y productos químicos industriales. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 es una cepa de rápido crecimiento y un productor natural de cloranfenicol, jadomicina y pikromicina, lo que la convierte en un candidato atractivo como chasis de biología sintética de próxima generación. Por lo tanto, las herramientas genéticas que aceleran el desarrollo de S. venezuelae ATCC 10712, así como otros modelos de Streptomyces spp., son altamente deseables para la ingeniería y el descubrimiento de productos naturales. Con este fin, se proporciona un sistema dedicado S . venezuelae ATCC 10712 libre de células en este protocolo para permitir la expresión heteróloga de alto rendimiento de genes de alto G + C (%). Este protocolo es adecuado para reacciones por lotes a pequeña escala (10-100 μL) en formato de placa de 96 o 384 pocillos, mientras que las reacciones son potencialmente escalables. El sistema libre de células es robusto y puede lograr altos rendimientos (~ 5-10 μ M) para una gama de proteínas recombinantes en una configuración mínima. Este trabajo también incorpora un amplio conjunto de herramientas de plásmidos para la medición en tiempo real de la síntesis de ARNm y proteínas, así como la tinción de fluorescencia en gel de proteínas marcadas. Este protocolo también se puede integrar con flujos de trabajo de caracterización de expresión génica de alto rendimiento o el estudio de vías enzimáticas de genes de alto G + C (%) presentes en genomas de Actinomycetes.
Introducción
Los sistemas de transcripción-traducción sin células (TX-TL) proporcionan una plataforma de creación de prototipos ideal para la biología sintética para implementar ciclos rápidos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje, el marco de ingeniería conceptual para la biología sintética1. Además, existe un creciente interés en los sistemas TX-TL para la producción de proteínas recombinantes de alto valor en un entorno de reacción abierta2, por ejemplo, para incorporar aminoácidos no estándar en conjugados anticuerpo-fármaco3. Específicamente, TX-TL requiere un extracto celular, plásmido o ADN lineal, ....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para obtener recetas para el plato medio y agar GYM y los tampones de lavado S30A y S30B.
1. Preparación de soluciones y orientación general
- Mantenga todas las soluciones, células (post-crecimiento) y extractos de células en hielo después de la preparación, a menos que se indique una excepción.
- Almacene existencias para 1 M mg-glutamato, 4 M K-glutamato, 40% (p/v) PEG 6000, 1 g/ml de ácido polivinilsulfónico a temperatura ambiente y todas las demás existencias a -80 °C. Minimice el número de ciclos de congelación-descongelación para evitar la degra....
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Resultados
Este protocolo detallado se proporciona como ejemplo para ayudar al usuario a establecer un sistema Streptomyces TX-TL basado en la cepa modelo S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). El usuario puede tratar de estudiar otras cepas de Streptomyces; sin embargo, las etapas de crecimiento / cosecha de otras cepas con tiempos de duplicación más largos o preferencias de crecimiento distintas deberán optimizarse a medida para lograr resultados máximos. Para el resultado re.......
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Discusión
En este manuscrito, se ha descrito un protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento con pasos detallados que son fáciles de llevar a cabo tanto para usuarios experimentados como nuevos de sistemas TX-TL. Se han eliminado varias características de los protocolos streptomyces45 y E. coli TX-TL41 existentes para establecer un protocolo mínimo, pero de alto rendimiento para S. venezuelae TX-TL5,26.
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el siguiente apoyo a la investigación: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA con PSF; Wellcome Trust patrocinó la beca ISSF para SJM con PSF en el Imperial College de Londres; Beca de investigación de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM en la Universidad de Kent; y la beca de doctorado del Fondo de Investigación de Desafíos Globales (GCRF) para KC en la Universidad de Kent.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matraz UltraYield de 2,5 L | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Pozo Negro/Placa Inferior Transparente | ThermoFisher | 10692202 | |
| Cloruro de amonio (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (solución de 100 mM, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillina (proveedor de contacto para pureza) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucosa (proveedor de contacto para pureza) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (proveedor de contacto para pureza) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (proveedor de contacto para pureza) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucosa-6-fosfato (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (proveedor de contacto para pureza) | Melford | B2001 | |
| Ácido L-glutámico sal de hemimagnesio tetrahidratado (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Cloruro de magnesio (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Extracto de malta | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce Placa de microdiálisis de 96 pocillos, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinilo sulfato) sal de potasio | Sigma | 271969 | |
| Glutamato de potasio (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS Muestreador de aminoácidos 5 | Prime | 2401530 | |
| Cloruro de sodio (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 Columna SPE (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Extracto de levadura | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Referencias
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
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Reimpresiones y permisos
