Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Summary

Las monocapas lipídicas se han utilizado como base para formar cristales de proteína bidimensionales (2D) para estudios estructurales durante décadas. Son estables en la interfaz aire-agua y pueden servir como un material de soporte delgado para la obtención de imágenes electrónicas. Aquí presentamos los pasos comprobados en la preparación de monocapas lipídicas para estudios biológicos.

Abstract

La cristalografía electrónica es una herramienta poderosa para la determinación de estructuras de alta resolución. Las macromoléculas como las proteínas solubles o de membrana se pueden cultivar en cristales bidimensionales (2D) altamente ordenados en condiciones favorables. La calidad de los cristales 2D cultivados es crucial para la resolución de la reconstrucción final a través del procesamiento de imágenes 2D. A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D de proteínas de membrana integral, pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa. Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua de tal manera que los grupos de cabeza lipídica polar permanecen hidratados en la fase acuosa y las cadenas de acilo no polares, las colas se dividen en el aire, rompiendo la tensión superficial y aplanando la superficie del agua. La naturaleza cargada o las partículas químicas distintivas de los grupos de cabeza proporcionan afinidad por las proteínas en solución, promoviendo la unión para la formación de matrices 2D. Una monocapa recién formada con la matriz 2D se puede transferir fácilmente a un microscopio electrónico (EM) en una rejilla de cobre recubierta de carbono utilizada para levantar y soportar la matriz cristalina. En este trabajo, describimos una metodología monocapa lipídica para imágenes criogénicas microscópicas electrónicas (crio-EM).

Introduction

La difracción de electrones a través de cristales 2D o matrices helicoidales de proteínas puede lograr resoluciones subnanométricas en casos favorables^1,2,3. De particular interés son las matrices reconstituidas de proteínas de membrana 2D o cristales en sus entornos casi nativos¹. Debido a que un cristal actúa como un amplificador de señal que mejora las intensidades de los factores estructurales a frecuencias espaciales específicas, la cristalografía electrónica permite sondear un objetivo con un tamaño más pequeño a altas resoluciones, como moléculas pequeñas, que las de la crio-EM de una sola partícula. El haz de electrones puede ser difractado por una matriz ordenada 2D de proteínas, generando un patrón de difracción o una imagen de red dependiendo de dónde se registre el plano de la imagen en el detector⁴. Las intensidades difractadas se pueden extraer y procesar para reconstruir una estructura de proyección 2D del cristal. Los electrones tienen una sección transversal de dispersión más grande que los rayos X y su dispersión sigue principalmente el modelo de Rutherford basado en la interacción de Coulomb entre los electrones y los átomos cargados en la molécula⁵. Los espesores de los cristales de membrana 2D suelen ser inferiores a 100 nm, adecuados para la transmisión de electrones sin dispersión dinámica que ocurre dentro de la muestra^6. Se ha demostrado que los estudios cristalográficos electrónicos son una herramienta poderosa para sondear información estructural de alta resolución de proteínas de membrana e interacciones lípido-proteína^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.}

Una monocapa lipídica es una sola capa lipídica compuesta de fosfolípidos densamente empaquetados en una interfaz aire-agua⁶, que puede ayudar a la formación de la matriz 2D para proteínas solubles o proteínas de membrana periférica¹⁸. Dependiendo de la densidad de los lípidos y su presión lateral, las moléculas lipídicas pueden formar una matriz 2D ordenada en la interfaz aire-agua con sus cadenas de acilo extendidas al aire y grupos de cabeza hidrofílicos expuestos en la solución acuosa^1,6,19. El grupo de cabeza lipídica puede interactuar con las proteínas a través de la interacción electrostática o puede modificarse para proporcionar una etiqueta de afinidad para unirse a un dominio proteico específico. Por ejemplo, el DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]^2- Ni²⁺) se utiliza a menudo en la formación de una monocapa lipídica para unir las proteínas con una etiqueta de poli-histidina^20,21,22. Además, la toxina B del cólera puede unirse a un pentasacárido particular del gangliósido GM1 en una monocapa lipídica para estudios estructurales^23,24. Al anclar las proteínas en los grupos de cabeza de lípidos, la monocapa lipídica puede ayudar a la formación de las matrices 2D que son delgadas para estudios cristalográficos de electrones de alta resolución. La técnica de monocapa lipídica se ha utilizado en cristalografía electrónica para estudios estructurales de proteínas, como la estreptavidina^2,25,la anexina V^26,la toxina del cólera^27,la subunidad²⁸de la E. coli girasa B, la ARN polimerasa^25,29,30,las proteínas de la cubierta del carboxisoma³¹ y las proteínas de la cápside del VIH-1³² y el virus ^{de la leucemia murina de Moloney 33}. Debido a la estabilidad y propiedad química de la monocapa lipídica, se han explorado diferentes aplicaciones para la preparación de muestras para la obtención de imágenes crio-EM³⁴. Sin embargo, la optimización será necesaria para la formación de matrices de proteínas.

Aquí, proporcionamos detalles extensos de la preparación general de monocapas lipídicas para imágenes crio-EM y algunas consideraciones que podrían afectar la calidad de las monocapas formadas.

Protocol

1. Preparación del bloque de teflón

1. Prepare el bloque de teflón a partir de resina de PTFE (politetrafluoroetileno) resistente a los productos químicos. Haga taladros en el bloque utilizando un taladro general seguido de las dimensiones etiquetadas en la Figura 1.

2. Preparación lipídica monocapa

NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 30- 45 minutos

1. Preparación de stock de lípidos
   1. Preparar una mezcla lipídica de 0,01 mg/ml en cloroformo/metanol 9:1 (v/v) utilizando 8,91 ml de cloroformo, 0,99 ml de metanol y 0,01 ml de lípidos de 10 mg/ml.
2. Preparación de placas de teflón
   1. Sonicar una placa de teflón en un baño de metanol durante 5 minutos.
   2. Lavar con agua caliente durante 15 minutos.
   3. Enjuague con agua destilada.
   4. Seque la placa de teflón en un desecador durante 30 minutos y manténgala al vacío cuando no esté en uso(Figura 1).

3. Formación de monocapa lipídica en reservorio tampón

NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1,5 horas

1. Prepare recién una mezcla lipídica de 0,01 mg/ml en una mezcla 9:1 de cloroformo/metanol el día del experimento.
2. Coloque un papel de filtro Tipo 1 en una placa de Petri y coloque el bloque de teflón sobre el papel de filtro.
3. Llene los pozos de la placa de teflón con 60 μL del tampón.
4. Agregue cuidadosamente la mezcla de lípidos en la parte superior de la superficie tampón gota a gota (idealmente 1 μL por gota) usando una jeringa Hamilton.
5. Humedezca el papel de filtro con agua destilada para mantener la humedad en la placa de Petri.
6. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos. El cloroformo debe evaporarse y se debe formar una monocapa de lípidos en la superficie del tampón.

4. Aplicación de una rejilla EM sobre una monocapa lipídica

NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 1,5 horas

1. Coloque suavemente una rejilla EM recubierta de carbono agujereada sin descarga de resplandor, con el lado de carbono hacia abajo, en la parte superior de cada depósito de amortiguación.
2. Inyecte cuidadosamente proteínas en el pozo de inyección lateral. Utilice las concentraciones finales de proteínas en el pozo alrededor de 1 μM de proteína como punto de partida. Pre-optimizar la concentración de proteínas antes del experimento.
3. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
4. Inyecte suavemente aproximadamente 20-30 μL de tampón en el puerto de inyección lateral. Esto elevará la cuadrícula por encima de la superficie del bloque de teflón.
5. Inmediatamente levante la rejilla con una pinza y levántela verticalmente de la gota.
6. Preparar muestras monocapa para tinción negativa o imágenes crio-TEM (Figura 2). Si las proteínas forman una matriz 2D, el espectro de potencia de la imagen o el periodograma de Fourier mostrarán intensidades de difracción en las frecuencias espaciales basadas en la simetría cristalina. Si no se muestran puntos de difracción en el espectro de potencia, es poco probable que las proteínas formen un cristal 2D.
7. Compruebe la cobertura de la monocapa lipídica en la red EM utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Una imagen de electrones de menor magnificado es útil para identificar la morfología de la monocapa cubierta. Por lo general, el contraste de imagen del área cubierta de monocapa será ligeramente menor que el de las áreas descubiertas. Además, el espectro de potencia de imagen 2D calculado ayudará a identificar la ubicación del cristalino 2D.

Results

Una monocapa lipídica depositada en la rejilla EM se puede visualizar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) sin tinción. La presencia monocapa se puede reconocer por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en la trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste local más bajo que las que no tienen cobertura, ya que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión y muestra una iluminación más brillante(...

Discussion

Una monocapa lipídica es una poderosa herramienta que facilita el crecimiento de grandes cristales 2D para estudios estructurales de macromoléculas biológicas. Para preparar con éxito una monocapa lipídica intacta en la interfaz aire-agua, se recomienda encarecidamente que los lípidos se preparen recién el día del experimento, ya que la oxidación de la cadena de acil lipídico podría provocar la interrupción del empaquetamiento en la monocapa y afectar negativamente la formación de cristales resultante. Los lípidos compra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14:0 PC (DMPC)	Avanti Lípidos	850345	1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL
Bulbo para pipetas pequeñas	Fisher Scientific	03-448-21
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432
Desecador	al vacío Southern Labware	55207
EM	Ciencias de la Microscopía Electrónica	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 y micro; m agujero, 1,3 y micro; m espacio
Papel de filtro	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diámetro 90 mm
Vidrio Pipetas Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20A
Jeringa Hamilton (25 µ L)	Jeringa Hamilton Company	80465
Hamilton (250 y micro; L)	Jeringa Hamilton Company	81165
Hamilton (5 y micro; L)	Jeringa	Company 87930
Hamilton (500 y micro; L)	Hamilton Company	203080
Metanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Placa de Petri	VWR	25384-342	100 mm y veces; 15 mm
Bloque de teflón	Grainger	55UK05	60 y micro; Pocillos L con puertos de inyección laterales, fabricados manualmente
Pinzas	Microscopía electrónica Ciencias	78325	Varios estilos
Agua
Limpiador ultrasónico	VWR	97043-996