Summary
このプロトコルは、植物宿主を使用して、ヨコバイの唾液タンパク質およびヨコバイベクターによって放出される植物ウイルスタンパク質を検出する方法を示しています。
Abstract
昆虫ベクターは、農業上重要な多くの植物ウイルスを水平に感染させます。植物ウイルスの半分以上は、口の部分を刺す半翅目昆虫によって伝染します。ウイルス感染中、唾液ベクターウイルスと昆虫タンパク質が昆虫から植物宿主への植物の免疫応答を誘発または抑制するため、昆虫の唾液はウイルスベクター宿主を橋渡しします。唾液タンパク質の同定と機能解析は、アルボウイルスと宿主の相互作用の研究分野における新たな焦点となりつつあります。このプロトコルは、植物宿主を使用してヨコバイの唾液中のタンパク質を検出するシステムを提供します。ヨコバイベクターネフォ テティックス・シンクティセプス は、イネ矮性ウイルス(RDV)に感染した例として役立つ。ニテロゲニンと、 N. cincticeps の唾液によって媒介されたRDVの主要な外側キャプシドタンパク質P8は、 N. cincticeps が餌とするイネで同時に検出することができます。この方法は、昆虫の餌付け後に植物宿主に一過性に保持される唾液タンパク質の試験に適用できます。この検出システムは、半翅目 - ウイルス - 植物または半翅目 - 植物相互作用の研究に役立つと考えられている。
Introduction
根本的な問題であるアルボウイルスのベクター宿主感染様式は、生物科学の最前線にあります。農業上重要な多くの植物ウイルスは、昆虫媒介動物によって水平に伝染します1。植物ウイルスの半分以上は、アブラムシ、コナジラミ、ヨコバイ、ウンカ、アザミウマなどの半翅目昆虫によって媒介されています。これらの昆虫は、植物ウイルスを効率的に感染させることを可能にする明確な特徴を持っています1。彼らは穿孔吸引口器を持ち、師部と木部からの樹液を食べ、唾液を分泌します1,2,3,4。技術の開発と改善に伴い、唾液成分の同定と機能分析は、集中的な研究の新たな焦点になりつつあります。唾液中の既知の唾液タンパク質には、ペクチネステラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、スクラーゼなどの多数の酵素が含まれます5,6,7,8,9,10,11,12,13 .唾液中のタンパク質には、宿主防御応答を誘発し、それによって昆虫の性能を変化させるエリシター、および昆虫の適応度を高める宿主防御を抑制するエフェクターおよび宿主病理学的応答を誘導する成分も含まれる14,15,16,17。したがって、唾液タンパク質は昆虫と宿主の間のコミュニケーションに不可欠な物質です。ウイルスの伝染中、穿刺吸引ウイルス性の昆虫の唾液腺から分泌される唾液にもウイルスタンパク質が含まれています。ウイルス成分は唾液の流れを利用して昆虫から植物宿主に放出します。したがって、昆虫の唾液は、ウイルス-ベクター-宿主の三栄養相互作用を橋渡しします。ウイルス性昆虫が分泌する唾液タンパク質の生物学的機能を調査することは、ウイルス-ベクター-宿主の関係を理解するのに役立ちます。
動物ウイルスの場合、蚊の唾液がウエストナイルウイルス(WNV)とデングウイルス(DENV)の伝染と病原性を媒介することが報告されています。唾液タンパク質AaSG34はデング熱ウイルスの複製と伝播を促進し、唾液タンパク質AaVA-1はオートファジーを活性化することによりDENVおよびジカウイルス(ZIKV)の伝播を促進します18,19。蚊の唾液タンパク質D7は、DENVビリオンおよび組換えDENVエンベロープタンパク質20との直接相互作用を介して、インビトロおよびインビボでDENV感染を阻害することができる。植物ウイルスでは、ベゴモウイルストマト黄葉カールウイルス(TYLCV)は、植物宿主のWRKY33を介した免疫を抑制するコナジラミ唾液タンパク質Bsp9を誘導して、コナジラミの嗜好と性能を高め、最終的にウイルスの感染を増加させます21。昆虫の唾液タンパク質が植物宿主で果たす役割の研究は動物宿主の研究に遅れをとっており、植物宿主中の唾液タンパク質を検出するための安定した信頼性の高いシステムが緊急に必要とされています。
イネ矮性ウイルス(RDV)として知られる植物ウイルスは、ヨコバイネフォテティクス・シンクティセプス(半翅目:Cicadellidae)によって高効率で持続的に増殖して伝染します22,23。RDVは昆虫媒介動物によって伝染し、アジアでイネの重篤な病気を引き起こすことが最初に報告されました24,25。ビリオンは二十面体で二重層の球状であり、外層はP8外側キャプシドタンパク質22を含む。N. cincticepsにおけるRDVの循環伝達期間は14日26,27,28,29,30である。RDVが唾液腺に到達すると、ビリオンはエキソサイトーシス様機構を介して唾液腺の唾液貯蔵空洞に放出される23。ビテロゲニン(Vg)は、雌昆虫の卵母細胞発生に必須の卵黄タンパク質前駆体です31、32、33。ほとんどの昆虫種は、約220kDaの前駆タンパク質をコードする6〜7kbの少なくとも1つのVg転写産物を有する。Vgのタンパク質前駆体は、通常、卵巣に入る前に、大きな断片(140〜190 kDa)と小さな断片(<50 kDa)に切断することができます18,19。これまでのプロテオミクス解析では、ヨコバイの分泌唾液中にVg由来のペプチドが存在することが明らかになったが、その機能は不明である(未発表データ)。ウンカから経口分泌されるVgが、植物の防御を損傷するエフェクターとして機能することが新たに報告されている34。N. cincticepsのVgも唾液流で植物宿主に放出され、植物防御を妨害する役割を果たすことができるかどうかは不明です。N. cincticepsがVgなどの唾液タンパク質を利用して植物の防御を阻害または活性化するかどうかに対処するための最初のステップは、摂食中に植物に放出されるタンパク質を特定することです。植物中に存在する唾液タンパク質の同定方法を理解することは、唾液タンパク質の機能や半翅目と植物の相互作用を説明するために不可欠である可能性があります。
ここで提示されたプロトコルでは、 N. cincticeps は、昆虫の摂食によって導入された植物宿主における唾液タンパク質の存在を調べる方法を提供するための例として使用されています。このプロトコルは、主に唾液タンパク質の収集と検出について詳しく説明しており、ほとんどの半翅目のさらなる調査に役立ちます。
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Protocol
非ウイルス性の成体ヨコバイは、中国の福建農林大学にあるベクター媒介ウイルス研究センターで繁殖しました。
1. 非ウイルス性昆虫の飼育
- 成虫を40 cm x 35 cm x 20 cm(長さx幅x高さ)の立方体ケージに入れて稲の苗で飼育します。ケージの片側を換気用の防虫ネットで覆ってください。
- ヨコバイの入ったケージを、湿度コントローラーを内蔵したインキュベーターに保管し、相対湿度26°C、相対湿度60〜75%、光長16時間、暗8時間。
- 吸引器を使用して、すべての成虫をケージから毎週新鮮な米の苗が入った新しいケージにそっと移します。
- 200人以上の大人が交尾し、ご飯に卵を産ませます。
- ニンフが出現するために古いイネの苗を保持します。これらの新しい非ウイルス性のニンフを2齢の段階に引き上げます。
2. ウイルスの獲得とウイルス性昆虫の収集
- 2齢の非ウイルス性ニンフをガラス培養チューブ(直径2.5 cm、高さ15 cm)に1〜2時間注意深く移し、吸引器を使用して飢餓させます。
- 鍋で育てたRDVに感染したイネが入っているケージにニンフを放します。
- ニンフが感染したイネを2日間食べさせます。
注:慎重に稲に水をやり、ニンフを洗い流さないでください。2齢幼虫の長さは約1.6〜2 mmです。
- これらのニンフを、16時間の明暗と8時間の暗闇の日長の下で、相対湿度60〜75%の新鮮なウイルスのないイネの苗を含む新しいケージに慎重に移します。ニンフが感染したイネを12日間食べさせて、RDVの循環伝達期間を完了します。
3. 給餌ケージを用いた唾液タンパク質の採取
- 一端が防虫ネットで覆われている5つの小さなパイプ状の給餌ケージ(直径2.5 cm、高さ4 cm)を準備します。
- 各給餌ケージに15〜20匹のヨコバイを閉じ込めてから、ケージのもう一方の端を薄いフォームマットで覆います。
- ケージの端とテープでフォームマットの間に1本の稲苗(高さ5〜6 cm)を固定します。給餌ケージ内のヨコバイがケージの内部に露出したイネの苗を餌にできることを確認してください。
- 稲が生き続けるように苗の根を水に浸します。ヨコバイが2日間それらを食べられるようにします。
- ヨコバイを餌ケージから取り出し、餌を与えた稲の苗を集めます。ケージの外側の苗の部分を切り取り、苗の餌場を回復します。
注:このサンプルは、検出に即座に使用されない場合、-80°Cで最大3か月間保存できます。
4. 試薬の調製
- 15.1 gのトリス塩基、94 gのグリシン、および5 gのSDSを1 Lの滅菌水に溶解し、5xTris-グリシンバッファーを調製します。200 mLの5xTris-グリシンバッファーを800 mLの滅菌水で希釈して、1xTris-グリシンバッファーを調製します(バッファー組成については 表1 を参照)。
- NaCl80 g、トリス塩基30 g、およびKCl2 gを滅菌水1 Lに溶解し、10xTris緩衝生理食塩水(TBS)バッファーを調製します。溶液を121°Cで15分間オートクレーブします。
- 8 gのSDS、4 mLのβ-メルカプトエタノール、0.02 gのブロモフェノールブルー、および40 mLのグリセロールを40 mLの0.1 M Tris-HCl(pH 6.8)に溶解し、4xタンパク質サンプルバッファーを調製します。
- 800 mL トリスグリシンバッファーと 200 mL メタノールを混合して、トランスファーバッファーを調製します。
- 100 mL 10xTBS溶液と3 mLトゥイーン20〜900 mL滅菌水を加えて、トゥイーン20(TBST)溶液でTBSバッファーを調製します。
5. 唾液およびウイルスタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング
- 組織が粉末になるまで、0.1 gの米サンプルを液体窒素で粉砕します。200 μLの4xタンパク質サンプルバッファーをサンプルに加え、10分間煮沸します。サンプルを12,000 x g で室温で10分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、新しいバイアルに入れます。10 μLのサンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、トリスグリシンバッファー中で150 Vで45〜60分間実行します。
注:遠心分離後の残留物は廃棄できます。
- 上清を取り除き、新しいバイアルに入れます。10 μLのサンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、トリスグリシンバッファー中で150 Vで45〜60分間実行します。
- 0.45 μmのニトロセルロースメンブレンとその他のサンドイッチサプライをトランスファーバッファーに30分間入れます。
注:この手順は、ゲルの実行が完了する前に実行できます。 - ゲルをサンドイッチし、転送バッファーに100 Vで90〜120分間転送します。
- メンブレンを取り、TBST溶液中の7%脱脂粉乳ブロッキング溶液に20分間入れます。RDV P8またはVgに対する特異的抗体をTBST中の脱脂粉乳の7%溶液に加えます。メンブレンを染色するための抗体と2時間または一晩インキュベートします。
- 膜をTBST溶液で3回洗浄し、毎回5分間洗浄します。
- 二次抗体としてヤギ抗ウサギIgGをTBSTを含む7%脱脂粉乳に加えます。抗体とともに室温で60〜90分間インキュベートします。
- 膜をTBST溶液で毎回5分間3回洗浄します。
- 化学発光法にはECLウエスタンキットを使用してください。キット内の検出試薬1と2をチューブ内で1:1の比率で混合します。混合試薬をメンブレン上に置き、ブロットを5分間インキュベートします。
- 余分な試薬を排出し、化学発光画像の比色写真を撮ります。それらを組み合わせて、タンパク質バンドとはしごを見てください。
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Representative Results
図1は、昆虫の飼育、ウイルスの獲得、稲の給餌による唾液タンパク質の収集、およびウェスタンブロットなど、このプロトコルのすべてのステップを示しています。ウェスタンブロットの結果は、Vgに対する抗体をインキュベートした膜上の昆虫の摂食イネと唾液腺のサンプルで約220 kDaの特異的および予想されるバンドが観察されることを示しました。対照的に、無給餌イネサンプルではバンドは観察されなかった。図2の結果は、Vgが唾液タンパク質として植物宿主に放出されたことを示している。RDV P8に対する抗体をインキュベートしたメンブレンでは、摂食を受けたイネのサンプルとウイルス性昆虫体の体からも、約46 kDaの特異的で予想されるバンドが観察されました。対照的に、図3に示すように、非摂食イネサンプルと非ウイルス性ヨコバイ体ではバンドは観察されませんでした。この結果は、ウイルスタンパク質が摂食植物でも検出できることを証明しました。
図1:唾液タンパク質の検出手順の概要。 ステップには、昆虫の飼育、ウイルスの獲得、植物の摂食 による 唾液タンパク質の収集、およびウェスタンブロッティングが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:植物および昆虫サンプル中のVgのウェスタンブロットアッセイ。 レーン1、非給餌植物。レーン2、ウイルス性のヨコバイ給餌植物。レーン3、ウイルス性のヨコバイ唾液腺;レーンM、マーカー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:植物および昆虫サンプル中のP8のウェスタンブロットアッセイ。 レーン1、非給餌植物。レーン2、ウイルス性のヨコバイ給餌植物。レーン3、ウイルス性のヨコバイの体。レーン4、非ウイルス性のヨコバイの体。M、マーカー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファ | 組成 | コメント/説明 |
| 5xトリスグリシンバッファー | 15.1 g トリスベース グリシン94 g 1 Lの滅菌水中の5 g SDS |
ストックソリューション |
| 1xトリスグリシンバッファー | 200 mL の 5x トリスグリシンバッファー 800 mLの滅菌水 |
作業ソリューション, SDS-PAGE用 |
| 10x トリス緩衝生理食塩水(TBS)バッファー | 80 g 塩化ナトリウム トリスベース30g 2 g KCl 1 L滅菌水中 |
ストックソリューション |
| TBS with Tween 20 (TBST) ソリューション | 100 mL 10x TBS溶液 3 mL トゥイーン20 900 mLの滅菌水 |
作業ソリューション |
| 4xタンパク質サンプルバッファー | 8 g SDS 4 mL β-メルカプトエタノール 0.02 g ブロモフェノールブルー 40 mLグリセロール 40 mL 0.1 M トリス塩酸塩 (pH 6.8) |
タンパク質抽出用 |
| 転送バッファ | 800 mL トリスグリシンバッファー 200 mL メタノール |
タンパク質転写用 |
表1:研究に使用されたバッファー、溶液、および試薬。 バッファーとソリューションの構成、およびそれらの使用法が一覧表示されます。
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Discussion
刺し吸う昆虫の唾液腺から直接分泌される唾液は、宿主組織とベクターのクロスキングダム生物学的因子を宿主に事前に消化して解毒するため、極めて重要な役割を果たします1,3,4。エリシター、エフェクター、低分子RNAなどの異性界の生物学的因子は、昆虫と宿主のコミュニケーションにとって重要です14,15,16。したがって、唾液成分のより多くの種類と機能を明らかにすることは、昆虫と宿主の関係を理解することを促進します。ここでは、植物宿主中の唾液タンパク質の検出システムが提供され、植物宿主における唾液タンパク質の機能に関するさらなる調査が可能になります。
このプロトコルは、摂食植物を採取することにより、口の部分を穿刺吸引するヨコバイの唾液タンパク質を検出する技術を提供します。最良かつ信頼性の高い結果を得るには、いくつかの注目すべき点に注意する必要があります。(1)感染したイネのウイルス負荷は重要です。イネのウイルス力価は昆虫の獲得に直接影響します。昆虫のコロニーが非常にウイルス性である場合、 in vitro で唾液中のウイルスタンパク質を収集する確率が高まります。したがって、唾液から植物宿主に放出されるウイルスタンパク質は、検出がはるかに容易になります。重大な症状を示す感染した植物を選択することは、ウイルスの発生源として役立つことをお勧めします。(2)検出タイミング。唾液タンパク質の一部は、植物宿主による分解を受けるか、植物内で希釈されるため、植物宿主では一過性であると考えられています。2日間の給餌後の給餌植物の即時検出が推奨されます。また、植物中の特定の唾液タンパク質については、保持時間が長いほど良いという仮説も立てられています。したがって、いくつかの唾液タンパク質の検出タイミングは、さらなる研究で決定される可能性があります。(3) 十分な反復があることを確認します。給餌ケージに閉じ込められた昆虫は活動と摂食能力が制限されているため、生き残る昆虫の数は減少します。十分な反復を使用すると、唾液タンパク質を濃縮するのに役立ちます。通常は 3 回から 5 回の反復で十分です。複製が1つしかない場合は、15〜20匹のヨコバイを閉じ込めて1本のイネの苗を食べることをお勧めします。
これらの代表的な結果は、ウイルス性ヨコバイの給餌植物におけるウイルスタンパク質P8の存在を示した。唾液の流れと混ざったウイルスが唾液腺から放出されることが明らかになりました。その後、昆虫から植物の宿主に放出され、最終的にウイルスの水平伝播が完了しました。しかし、Vgが昆虫の摂食過程においてエリシターまたはエフェクターの役割を果たすかどうか、そしてそれが植物宿主の免疫応答を引き起こすか抑制するかはまだ不明です。これまで、10,000個以上の R. dorsalis の唾液を膜栄養 で 採取し、LC-MS/MS(未発表データ)を用いて分析していました。唾液中のVgの存在が確認されたが、その機能は不明である。ここでは、Vgが N. cincticeps の唾液にも存在し、植物に放出されることさえ証明されています。ウンカ16の研究と組み合わせると、半翅目唾液中のVgの存在は普遍的であると推定されます。新しい知見は、ウンカ唾液のVgが植物防御系34を損傷するエフェクターであることを報告している。ほとんどの半翅目唾液中のVgがエフェクターとして機能するかどうかに対処するには、さらに研究が必要です。.このプロトコルは、植物のヨコバイによって分泌される唾液タンパク質の存在を調べるための安定した信頼性の高い方法論を提供すると考えられています。このプロトコルは、ほとんどの半翅目の唾液タンパク質の検出に適用できることが期待されます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(31772124および31972239)および福建農林大学(Grant KSYLX014)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
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