Digital Droplet PCR-metod för kvantifiering av AAV-transduktionseffektivitet i Murine Retina
Summary
Detta protokoll presenterar hur man kvantifieraR AAV-transduktion effektivitet i mus näthinnan med hjälp av digital dropp PCR (dd-PCR) tillsammans med småskaligA AAV produktion, intravitreal injektion, retinal imaging och retinal genomisk DNA isolering.
Abstract
Många retinal cellbiologiska laboratorier använder nu rutinmässigt Adeno-associerade virus (AAV) för genredigering och regulatoriska applikationer. Effektiviteten av AAV-transduktion är vanligtvis kritisk, vilket påverkar de övergripande experimentella resultaten. En av de viktigaste bestämningsfaktorerna för transduktionseffektivitet är serotypen eller varianten av AAV-vektorn. För närvarande finns olika konstgjorda AAV-serotyper och varianter med olika affiniteter för att vara värd för cellytans receptorer. För retinal genterapi resulterar detta i varierande grad av transduktion effektivitet för olika retinal celltyper. Dessutom kan injektionsvägen och kvaliteten på AAV-produktionen också påverka retinal AAV-transduktionseffektiviteten. Därför är det viktigt att jämföra effektiviteten hos olika varianter, partier och metoder. Metoden digital dropp PCR (dd-PCR) kvantifierar nukleinsyrorna med hög precision och gör det möjligt att utföra absolut kvantifiering av ett givet mål utan någon standard eller referens. Med hjälp av dd-PCR är det också möjligt att bedöma flyttningseffektiviteten hos AAV genom absolut kvantifiering av AAV-genomkopieringsnummer i en injicerad näthinna. Här tillhandahåller vi en enkel metod för att kvantifiera flyttningshastigheten för AAV i retinala celler med dd-PCR. Med mindre modifieringar kan denna metod också ligga till grund för kvantifiering av mitokondriellt DNA och bedöma effektiviteten av basredigering, kritisk för flera näthinnesjukdomar och genterapiapplikationer.
Introduction
Adeno associerade virus (AAV) används nu ofta för en mängd olika retinal genterapi studier. AAV ger ett säkert och effektivt sätt att leverera gener med mindre immunogenicitet och färre genomintegrationer. AAV-inträde i målcellen sker genom endocytos, vilket kräver bindning av receptorer och co-receptorer på cellytan1,2. Därför beror flyttningseffektiviteten hos AAV för olika celltyper främst på kapsiden och dess interaktioner med värdcellreceptorerna. AAV har serotyper och varje serotyp kan ha distinkta cellulära/vävnad tropismer och transduktion effektivitet. Det finns också konstgjorda AAV serotyper och varianter som genereras av kemisk modifiering av viruskapsiden, produktion av hybridkapslar, peptidinsättning, capsidblandning, riktad evolution och rationell mutagenes3. Även mindre förändringar i aminosyrasekvensen eller kapsidstrukturen kan påverka interaktioner med värdcellsfaktorer och resultera i olika trombismer4. Förutom kapsidvarianter kan andra faktorer som injektionsväg och variation från parti till parti av AAV-produktion påverka flyttningseffektiviteten hos AAV i den neuronala näthinnan. Därför är det nödvändigt med tillförlitliga metoder för jämförelse av transduktionshastigheter för olika varianter.
Majoriteten av metoderna för att bestämma AAV-transduktion effektivitet förlitar sig på reporter gen uttryck. Dessa inkluderar fluorescerande avbildning, immunohistokemi, western blot eller histokemisk analys av reportergenprodukten5,6,7. På grund av storleksbegränsningen för AAV är det dock inte alltid möjligt att inkludera reportergener för att övervaka flyttningseffektiviteten. Att använda starka promotorer som hybrid CMV-förstärkare / kyckling beta-aktin eller Woodchuck hepatit post-transcriptional regulatoriska element (WPRE) som en mRNA stabilisatorsekvens komplicerar ytterligare storleksproblemet8. Därför kommer det också att vara fördelaktigt att definiera flyttningsfrekvensen för injicerade AAV med en mer direkt metod.
Digital droplet PCR (dd-PCR) är en kraftfull teknik för att kvantifiera mål-DNA från minimala mängder prover. dd-PCR-tekniken är beroende av inkapsling av mål-DNA- och PCR-reaktionsblandningen med oljedroppar. Varje dd-PCR-reaktion innehåller tusentals droppar. Varje droppe bearbetas och analyseras som en oberoende PCR-reaktion9. Analys av droppar gör det möjligt att beräkna det absoluta kopieringsnumret av mål-DNA-molekyler i något prov genom att helt enkelt använda Poisson-algoritmen. Eftersom flyttningseffektiviteten hos AAV är korrelerad med kopieringsnumret av AAV-genom i den neuronala näthinnan, använde vi dd-PCR-metoden för att kvantifiera AAV-genom.
Här beskriver vi en dd-PCR-metodik för att beräkna flyttningseffektiviteten hos AAV-vektorer från retinal genomiskt DNA6,10. Först genererades AAV som uttrycker tdTomato reporter med hjälp av det småskaliga protokollet och titered av dd-PCR-metoden11. För det andra injicerades AAV intravitreally i den neuronala näthinnan. För att demonstrera transduktionseffektiviteten kvantifierade vi först tdTomato-uttrycket med hjälp av fluorescerande mikroskopi och ImageJ-programvara. Detta följdes av isolering av genomiskt DNA för kvantifiering av AAV genom i injicerade näthinnor med dd-PCR. Jämförelse av tdTomato uttrycksnivåer med de transduced AAV genom kvantifieras av dd-PCR visade att dd-PCR metoden exakt kvantifierade givaren effektivitet av AAV vektorer. Våra protokoll visade en detaljerad beskrivning av en dd-PCR-baserad metodik för att kvantifiera AAV-transduktionseffektivitet. I detta protokoll visar vi också det absoluta antalet AAV-genom som transduced efter intravitreal injektioner genom att helt enkelt använda utspädningsfaktorn efter genomisk DNA-isolering och dd-PCR resultat. Sammantaget ger detta protokoll en kraftfull metod, vilket skulle vara ett alternativ till reporteruttryck för att kvantifiera transduktionseffektiviteten hos AAV-vektorer i näthinnan.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll genererade vi två AAV-vektorer som har olika kapsidproteiner och sedan titered dem i enlighet därmed. Ett av de viktigaste stegen i detta protokoll är att producera tillräckliga mängder AAV som ger detekterbart reporteruttryck efter12,13.
Titering av AAV är också en viktig faktor för att justera doser av AAV för intravitreala injektioner. När dessa viktiga kriterier har uppnåtts är det möjligt att kvan…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Oezkan Keles, Josephine Jüttner och prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform för deras hjälp och stöd för AAV-produktion. Vi vill också tacka prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania för AAV8 / BP2-stammen. Djurarbete utförs på Gebze Technical University djuranläggning. För detta tackar vi Leyla Dikmetas och prof. Uygar Halis Tazebay för tekniskt stöd och stöd till djurhållning. Vi vill också tacka Dr. Fatma Ozdemir för hennes kommentarer om manuskriptet. Detta arbete stöds av TUBITAK, bidragsnummer 118C226 och 121N275 och Sabanci University Integration grant.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referencias
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
