Digital Droplet PCR-metode for kvantifisering av AAV-transduksjonseffektivitet i Murine Retina
Summary
Denne protokollen presenterer hvordan du kvantifiserer AAV-transduksjonseffektivitet i musenett ved hjelp av digital dråpe PCR (dd-PCR) sammen med liten AAV-produksjon, intravitreal injeksjon, retinal avbildning og retinal genomisk DNA-isolasjon.
Abstract
Mange retinal cellebiologiske laboratorier bruker nå rutinemessig Adeno-tilknyttede virus (AAVs) for genredigering og regulatoriske applikasjoner. Effektiviteten til AAV-transduksjon er vanligvis kritisk, noe som påvirker de generelle eksperimentelle resultatene. En av de viktigste determinantene for transduksjonseffektivitet er serotypen eller varianten av AAV-vektoren. For tiden er ulike kunstige AAV-serotyper og varianter tilgjengelige med forskjellige affiniteter for å være vert for celleoverflatereseptorer. For retinal genterapi resulterer dette i varierende grad av transduksjonseffektivitet for forskjellige netthinnecelletyper. I tillegg kan injeksjonsruten og kvaliteten på AAV-produksjonen også påvirke retinal AAV-transduksjonseffektiviteten. Derfor er det viktig å sammenligne effektiviteten til forskjellige varianter, partier og metoder. Den digitale dråpe-PCR-metoden (dd-PCR) kvantifiserer nukleinsyrene med høy presisjon og gjør det mulig å utføre absolutt kvantifisering av et gitt mål uten standard eller referanse. Ved hjelp av dd-PCR er det også mulig å vurdere transduksjonseffektiviteten til AAVer ved absolutt kvantifisering av AAV-genomkopinumre i en injisert netthinne. Her tilbyr vi en enkel metode for å kvantifisere transduksjonshastigheten til AAVer i retinalceller ved hjelp av dd-PCR. Med mindre modifikasjoner kan denne metodikken også være grunnlaget for kopieringsnummer kvantifisering av mitokondrie-DNA samt vurdere effektiviteten av baseredigering, kritisk for flere netthinnesykdommer og genterapiapplikasjoner.
Introduction
Adeno assosierte virus (AAVs) brukes nå ofte til en rekke retinal genterapistudier. AAVer gir en sikker og effektiv måte å levere gen på med mindre immunogenisitet og færre genomintegrasjoner. AAV-oppføring i målcellen skjer gjennom endokytose, som krever binding av reseptorer og koreseptorer på celleoverflaten1,2. Derfor avhenger transduksjonseffektiviteten til AAVer for forskjellige celletyper hovedsakelig av capsid og dens interaksjoner med vertscellereseptorene. AAVer har serotyper og hver serotype kan ha distinkte cellulære / vevtropismer og transduksjonseffektivitet. Det er også kunstige AAV-serotyper og varianter generert av kjemisk modifikasjon av viruskapsiden, produksjon av hybridkapsider, peptidinnsetting, kapsidstokking, rettet evolusjon og rasjonell mutagenese3. Selv mindre endringer i aminosyresekvens eller kapsidstruktur kan ha innflytelse på interaksjoner med vertscellefaktorer og resultere i forskjellige tropismer4. I tillegg til capsid-varianter kan andre faktorer som injeksjonsrute og batch-til-batch-variasjon av AAV-produksjon påvirke transduksjonseffektiviteten til AAVer i nevronal netthinnen. Derfor er pålitelige metoder for sammenligning av transduksjonshastigheter for forskjellige varianter nødvendig.
De fleste metodene for å bestemme AAV-transduksjonseffektivitet er avhengige av reportergenuttrykk. Disse inkluderer fluorescerende avbildning, immunhiistokjemi, vestlig blot eller histokjemisk analyse av reportergenproduktet5,6,7. På grunn av størrelsesbegrensningen til AAVer er det imidlertid ikke alltid mulig å inkludere reportergener for å overvåke transduksjonseffektiviteten. Bruk av sterke promotorer som hybrid CMV enhancer / kylling beta-actin eller Woodchuck hepatitt posttranskripsjonelt regulatorisk element (WPRE) som en mRNA-stabilisatorsekvens kompliserer ytterligere størrelsesproblemet8. Derfor vil det også være gunstig å definere transduksjonshastigheten til injiserte AAVer med en mer direkte metodikk.
Digital droplet PCR (dd-PCR) er en kraftig teknikk for å kvantifisere mål-DNA fra små mengder prøver. dd-PCR-teknologi avhenger av innkapsling av målet DNA og PCR reaksjon blanding av oljedråper. Hver dd-PCR-reaksjon inneholder tusenvis av dråper. Hver dråpe behandles og analyseres som en uavhengig PCR-reaksjon9. Analyse av dråper gjør det mulig å beregne absolutt kopi antall mål-DNA-molekyler i en hvilken som helst prøve ved å bruke Poisson-algoritmen. Siden transduksjonseffektiviteten til AAVene er korrelert med kopinummeret til AAV-genomer i nevronal netthinnen, brukte vi dd-PCR-metoden for å kvantifisere AAV-genomer.
Her beskriver vi en dd-PCR-metodikk for å beregne transduksjonseffektiviteten til AAV-vektorer fra retinal genomisk DNA6,10. Først ble AAVer som uttrykker tdTomato reporter generert ved hjelp av den lille skalaprotokollen, og titered av dd-PCR-metoden11. For det andre ble AAVs intravitrealt injisert i nevronal netthinnen. For å demonstrere transduksjonseffektiviteten kvantifiserte vi først tdTomato-uttrykket ved hjelp av fluorescerende mikroskopi og ImageJ-programvare. Dette ble etterfulgt av isolering av genomisk DNA for kvantifisering av AAV-genomer injisert netthinner ved hjelp av dd-PCR. Sammenligning av tdTomato-uttrykksnivåer med de transinduserte AAV-genomene kvantifisert av dd-PCR viste at dd-PCR-metoden nøyaktig kvantifiserte transduksjonseffektiviteten til AAV-vektorer. Våre protokoller viste en detaljert beskrivelse av en dd-PCR-basert metodikk for å kvantifisere AAV-transduksjonseffektivitet. I denne protokollen viser vi også det absolutte antallet AAV-genomer som transduseres etter intravitreale injeksjoner ved ganske enkelt å bruke fortynningsfaktoren etter genomisk DNA-isolasjon og dd-PCR-resultatene. Totalt sett gir denne protokollen en kraftig metode, som ville være et alternativ til reporteruttrykk for å kvantifisere transduksjonseffektivitet av AAV-vektorer i netthinnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen genererte vi to AAV-vektorer som har forskjellige kapsidproteiner og deretter titered dem deretter. Et av de viktigste trinnene i denne protokollen er å produsere tilstrekkelige mengder AAVer som vil gi detekterbart reporteruttrykk etter transduksjonen12,13.
Titering av AAVs er også en viktig faktor for å justere doser av AAV for intravitreale injeksjoner. Når disse viktige kriteriene er oppnådd, er det muli…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Oezkan Keles, Josephine Jüttner og prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform for deres hjelp og støtte til AAV-produksjon. Vi vil også takke professor Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania for AAV8/BP2-stammen. Dyrearbeid utføres ved Gebze Technical University dyreanlegg. For det takker vi Leyla Dikmetas og prof. Uygar Halis Tazebay for teknisk assistanse og støtte til husdyrhold. Vi vil også takke Dr. Fatma Ozdemir for hennes kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet støttes av TUBITAK, tilskuddsnummer 118C226 og 121N275, og Sabanci University Integration grant.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referencias
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
