Un método simple modificado para la inducción de infarto de miocardio en ratones

Summary

Bajo la anestesia adecuada, el corazón del ratón se exteriorizó a través del espacio intercostal, y el infarto de miocardio se indujo con éxito mediante la ligadura de la arteria descendente anterior (DA) izquierda utilizando materiales fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios.

Abstract

El infarto de miocardio (IM) representa una de las principales causas de muerte. Los modelos de infarto de miocardio se utilizan ampliamente para investigar los mecanismos patológicos de la remodelación posterior al infarto de miocardio y la evaluación de nuevas terapias. Se han utilizado diferentes métodos (p. ej., tratamiento con isoproterenol, criolesión, ligadura de las arterias coronarias, etc.) para inducir el infarto de miocardio. En comparación con el tratamiento con isoproterenol y la criolesión, la ligadura de las arterias coronarias puede reflejar mejor la respuesta isquémica y la remodelación crónica después del infarto de miocardio. Sin embargo, los métodos tradicionales para la ligadura coronaria en ratones son técnicamente desafiantes. El presente estudio describe un proceso simple y eficiente para la inducción de IM en ratones con materiales fácilmente disponibles. La piel del tórax del ratón se abrió bajo anestesia estable. El corazón se exteriorizó inmediatamente a través del espacio intercostal después de la separación roma del pectoral mayor y el pectoral menor. La rama descendente anterior izquierda (DA) se ligó con una sutura 6-0 a 3 mm de su origen. Después de la ligadura de LAD, la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) indicó una inducción exitosa del infarto de miocardio y cambios temporales del tamaño de la cicatriz posterior al infarto de miocardio. Mientras tanto, los resultados del análisis de supervivencia mostraron una mortalidad manifiesta dentro de los 7 días posteriores al infarto de miocardio, principalmente debido a la rotura cardíaca. Además, la evaluación ecocardiográfica posterior al infarto de miocardio demostró la inducción exitosa de la disfunción contráctil y el remodelado ventricular. Una vez dominado, se puede establecer un modelo de IM en ratones en 2-3 minutos con materiales fácilmente disponibles.

Introduction

El infarto de miocardio (IM) representa una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo 1,2,3,4,5. A pesar de la reperfusión oportuna, actualmente hay una falta de terapias efectivas para tratar el remodelado cardíaco posterior al infarto de miocardio. En consecuencia, se han realizado esfuerzos considerables para la exploración mecanicista y la explotación terapéutica del IM ^6,7,8. Cabe destacar que el establecimiento de modelos de IM es un requisito previo para cumplir con estos fines.

Se han propuesto varios métodos (p. ej., tratamiento con isoproterenol, criolesión, ligadura de arterias coronarias, etc.) para inducir modelos de infarto de miocardio en animales pequeños. El tratamiento con isoproterenol es un método sencillo para la inducción del infarto de miocardio, pero no puede inducir el infarto de la zona objetivo⁹. La criolesión conduce a la necrosis miocárdica a través de la generación de cristales de hielo y la ruptura de la membrana celular en lugar de la isquemia directa¹⁰. Por el contrario, la ligadura de las arterias coronarias permite un control preciso del sitio de oclusión y de la extensión del área del infarto y recapitula fielmente la respuesta de remodelación después del infarto^11,12. La ligadura de las arterias coronarias generalmente se realiza después de la intubación, la ventilación mecánica y la toracotomía, lo que es técnicamente desafiante^13,14. Se reportaron varios protocolos modificados para la ligadura de arterias coronarias (por ejemplo, sin ventilación) que potenciaron la inducción del infarto de miocardio, pero faltan demostraciones visuales detalladas^15,16,17. Estos problemas plantean una barrera financiera y técnica significativa para los grupos que desean participar en la investigación utilizando modelos de IM. Este informe presenta un enfoque para la inducción de IM en ratones. El método actual es fácil, ahorra tiempo y utiliza herramientas y equipos quirúrgicos que se encuentran fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

Protocol

Los experimentos que involucran trabajo con animales se realizan con todas las aprobaciones necesarias del Comité de Ética de Bienestar de Animales de Laboratorio del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (R52021-0506). En el estudio se utilizaron ratones hembra y macho C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas.

1. Preparación del equipo de anestesia simplificado (OPCIONAL)

NOTA: Esta es una configuración preoperatoria opcional y se puede reemplazar con anestesia titulable como se menciona en la sección 2. El comité institucional de ética animal y el veterinario o veterinarios deben ser consultados antes de adaptar esta configuración en los procedimientos con animales.

1. Tome un tubo de centrífuga de 15 ml y haga un corte perpendicular al eje largo del tubo a unos 3 cm de la abertura.
   NOTA: Asegúrese de que el corte sea mayor que la mitad de la circunferencia circular del lumen del tubo para que la válvula pueda insertarse con éxito.
2. Taladre orificios (diámetro, 2 mm) en la pared del tubo de centrífuga entre el corte y la abertura del tubo.
3. Corte un trozo de válvula de tamaño adecuado de una lámina de plástico e inserte la válvula en el corte de la pared del tubo.
   NOTA: La válvula se puede utilizar para controlar la tasa de liberación de isoflurano cambiando la profundidad de la inserción.
4. Dentro de una campana extractora, corte la parte inferior del tubo y conéctelo al suministro de oxígeno. Coloque una bola de algodón cerca del extremo inferior del tubo, agregue una carga de 0,5 ml de isoflurano (como se obtuvo, consulte la Tabla de materiales) sobre la bola de algodón y cierre la válvula.
5. Pruebe la eficacia de la anestesia enmascarando a los ratones con tubos preparados como se describió anteriormente. Controle la frecuencia respiratoria y la profundidad de la anestesia mediante la respuesta de pellizco de los dedos de los pies.
   NOTA: Una frecuencia respiratoria inferior a 10 veces/10 s sugiere una anestesia excesiva y se debe ajustar la profundidad de inserción de la válvula. Para todos los procedimientos que involucran anestesia, se debe usar un filtro de gas lleno de láminas de carbón activado (Figura 1A-i) y la cirugía debe realizarse dentro de una campana.

2. Preparación quirúrgica y anestesia

1. Prepare y esterilice todos los instrumentos necesarios el día de la cirugía, incluyendo un par de fórceps, un hemostático para micromosquitos, un par de tijeras quirúrgicas, dos pares de portaagujas, sutura quirúrgica de seda 4-0, sutura quirúrgica de seda 6-0, un filtro de gas y una fuente de luz (ver Tabla de materiales) (Figura 1A).
2. Colóquese una mascarilla quirúrgica y guantes estériles.
3. Aplicar la crema depilatoria en el pecho del ratón y esperar 1 min. Limpie suavemente la crema depilatoria y el cabello con una gasa húmeda.
4. Sostenga el mouse con la mano dominante después de la depilación. Inducir la anestesia por inhalación de isoflurano vaporizado (4%) con aporte de oxígeno (1L/min) y mantener al 2-3% el isoflurano.
5. Confirme la anestesia adecuada por la falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.
6. Aplique crema estéril para los ojos en ambos ojos para prevenir la sequedad de la córnea.
7. Asegure a los ratones en una plataforma quirúrgica en posición supina. Aplique hisopos de povidona yodada (ver Tabla de materiales) en el tórax tres veces y cubra el tórax desinfectado con un paño estéril.

3. Inducción de infarto de miocardio

1. Cambie los guantes contaminados para garantizar la esterilidad.
2. Haga un corte de piel de 0,5 cm a lo largo de la línea que conecta el xifoides y la axila después del bloqueo local con lidocaína.
3. Separe sin rodeos los músculos pectorales mayores y pectorales menores con fórceps y un micromosquito hemostático para exponer el cuarto espacio intercostal.
4. Abra el cuarto espacio intercostal con un micromosquito hemostático.
5. Exteriorizar el corazón empujando el corazón hacia el cuarto espacio intercostal con el dedo índice de la mano izquierda.
6. Asegurar el corazón con la mano izquierda, y ligar la rama descendente anterior izquierda con una sutura 6-0 a 3 mm de su origen.
7. Vuelva a colocar el corazón en la cavidad torácica rápidamente.
   NOTA: Es seguro externalizar el corazón durante menos de 30 s.
8. Evacúe el aire fuera de la cavidad torácica presionando suavemente la cavidad torácica manualmente.
9. Cierra la capa muscular sobre las costillas con una sutura de seda 6-0.
10. Cerrar la piel con una sutura de seda 4-0.
11. Coloque los ratones sobre una almohadilla (37 °C) inmediatamente después de la operación.
12. Inyectar buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por vía subcutánea cada 4-6 horas para reducir el dolor postoperatorio durante un máximo de 72 horas.
13. Regrese los ratones operados a las jaulas cuando estén completamente recuperados.
    NOTA: Los ratones se recuperarán por completo dentro de los 3-5 minutos posteriores a la cirugía.
14. Vigile cuidadosamente a los ratones y proporciónele comida húmeda durante un máximo de 7 días.

4. Recolección de los tejidos

1. Sacrificar a los ratones en diferentes momentos después del establecimiento del infarto de miocardio por luxación cervical.
2. Asegure los ratones sacrificados en la plataforma de cirugía en posición supina.
3. Haga una incisión ventral (~3-4 cm) en la parte superior del abdomen. Corta las costillas de ambos lados de la cavidad torácica y retira el diafragma.
4. Perfundir el corazón con 10 ml de solución salina fría tamponada con fosfato (1x PBS, 4 °C) mediante inyección intraventricular.
5. Recoja el corazón cortando la raíz aórtica y guárdelo inmediatamente a -80 °C.
   NOTA: De acuerdo con la experiencia de los autores, es factible realizar la tinción TTC dentro de las dos semanas posteriores al almacenamiento.
6. Tiñe el corazón con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC).
   1. Corta el corazón congelado en secciones de 1 mm de grosor sobre hielo con cuchillas de afeitar.
   2. Incubar las rodajas de corazón preparadas en una solución de TTC al 1% (disuelta en 1x PBS) a 37 °C durante 10-15 min.
      NOTA: Después de 15 minutos de incubación, deseche la solución de TTC y sumerja las rodajas de corazón teñidas en 1x PBS.
7. Fotografía las rebanadas con una cámara digital.

Results

El protocolo experimental y algunos de los pasos críticos se muestran en la Figura 1. El equipo de anestesia simplificado indujo la anestesia. Como se muestra en la Figura 2A, la anestesia inducida fue estable, como se refleja en la frecuencia respiratoria regular (varió de 90 a 107 respiraciones/min en los ratones analizados). Después de la ligadura de las arterias coronarias, el análisis de tinción TTC indicó una inducción exitosa del infarto de miocardio y ca...

Discussion

El presente informe demostró un protocolo fácil para la inducción de IM en ratones con materiales fácilmente disponibles, que fue modificado a partir de un método reportado por Gao¹⁶. Los modelos murinos de IM son indispensables para la exploración mecanicista y el cribado farmacológico de la disfunción y remodelación post-IM¹². Entre las técnicas existentes para la inducción del infarto de miocardio, la ligadura de las arterias coronarias es la más practicada. La ligadura ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio	SIGMA	T8877-25G	Tinción TTC
4-0 sutura de seda	YUANKANG	4-0	Instrumental quirúrgico
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50	Esterilización para el sólido
Buprenorfina	Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.	H10940181	reducir el dolor postoperatorio
Tubo de centrifugación	Biological Hope	1850-K	15ML
Crema depilatoria	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Agente de depilación para animales de laboratorio
Pinza	RWD	F12028	Instrumental quirúrgico
Filtro de gas	ZHAOXIN	SA-493	Protección del operador
Isoflurano	RWD	20071302	Se utiliza para la anestesia
Fuente de luz	Beijing PDV	LG-150B	Lámpara
de operación Micro-mosquito hemostático	FST	13011-12	Aguja para instrumental quirúrgico
	BINXIONG	42180104	Instrumento quirúrgico
La aguja y la sutura de seda 6-0	JIAHE	SC086	Instrumental quirúrgico
Portaagujas	ShangHaiJZ	J32030	Instrumento quirúrgico
Portaagujas	ShangHaiJZ	J32010	Instrumento quirúrgico
Hisopos de povidona yodada	SingleLady	GB26368-2010	Tijeras de desinfección de la piel
	CNSTRONG		JYJ1030 Instrumento quirúrgico
Crema estéril para los ojos	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.	H10940177	prevenir la sequedad de la córnea
Sistema de imágenes de ultrasonido de ultra alta resolución para animales pequeños	VisualSonics	Vevo 2100	Análisis ecocardiográfico