Artículo de método

Aislamiento rápido de células individuales de dientes de ratón y humanos

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DOI:

10.3791/63043

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28 de octubre de 2021

 ,  ,  , 
1Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Masaryk University, 2Department of Molecular Neuroimmunology, Centre for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute

En este artículo

Resumen

El protocolo actual presenta un método rápido, eficiente y suave para aislar células individuales adecuadas para el análisis de ARN-seq de una sola célula a partir de un incisivo de ratón en crecimiento continuo, molar de ratón y dientes humanos.

Resumen

Los dientes de ratón y humanos representan órganos desafiantes para el aislamiento celular rápido y eficiente para aplicaciones transcriptómicas u otras aplicaciones unicelulares. El tejido pulpar dental, rico en la matriz extracelular, requiere un largo y tedioso proceso de disociación que generalmente está más allá del tiempo razonable para la transcriptómica de una sola célula. Para evitar cambios artificiales en la expresión génica, el tiempo transcurrido desde la eutanasia de un animal hasta el análisis de células individuales debe minimizarse. Este trabajo presenta un protocolo rápido que permite obtener suspensión unicelular de dientes de ratón y humanos en una excelente calidad adecuada para scRNA-seq (secuenciación de ARN unicelular). Este protocolo se basa en pasos acelerados de aislamiento tisular, digestión enzimática y posterior preparación de la suspensión final unicelular. Esto permite un procesamiento rápido y suave de los tejidos y permite utilizar más muestras animales o humanas para obtener suspensiones celulares con alta viabilidad y cambios transcripcionales mínimos. Se anticipa que este protocolo podría guiar a los investigadores interesados en realizar el scRNA-seq no solo en los dientes de ratón o humanos, sino también en otros tejidos ricos en matriz extracelular, incluido el cartílago, el tejido conectivo denso y la dermis.

Introducción

La secuenciación de ARN unicelular es una poderosa herramienta para descifrar la estructura, jerarquía, interacciones y homeostasis de la población celular in vivo1,2. Sin embargo, sus resultados dependen en gran medida del primer paso de este análisis avanzado: la preparación de una suspensión unicelular de calidad perfecta a partir del tejido complejo y bien organizado. Esto abarca mantener las células vivas y prevenir cambios artificiales no deseados en los perfiles de expresión génica de las células3,4. Tales cambios podrían conducir a una caracterización inexacta de la estructura de la población y a una interpretación errónea de los datos recopilados.

Se han desarrollado protocolos específicos para el aislamiento de una amplia gama de tejidos5,6,7,8. Por lo general, emplean la disociación mecánica en combinación con una incubación adicional con varias enzimas proteolíticas. Estos típicamente incluyen tripsina, colagenasas, dispasas, papaína6,7,8,9, o mezclas de enzimas disponibles comercialmente como Accutase, Tryple, etc.5. La parte más crítica que afecta la calidad del transcriptoma es la digestión enzimática. Se demostró que la incubación prolongada con enzimas a 37 °C influye en la expresión génica y provoca la regulación al alza de muchos genes relacionados con el estrés10,11,12,13. El otro parámetro crítico del proceso de aislamiento es su longitud total, ya que se ha demostrado que los transcriptomas celulares cambian después de la isquemia tisular14. Este protocolo presenta un protocolo eficiente para el aislamiento suave de células individuales de dientes de ratón y humanos, más rápido que otros protocolos utilizados anteriormente para el aislamiento de células de tejidos complejos5,6,9,11,13,15,16.

Este protocolo presenta cómo diseccionar rápidamente el tejido blando del diente duro y preparar una suspensión unicelular adecuada para scRNA-seq. Este método emplea solo un paso de centrifugación y minimiza el efecto de los cambios transcripcionales no deseados al reducir el manejo del tejido y el tiempo de digestión y mantener el tejido y las células a 4 ° C la mayor parte del tiempo. El procedimiento muestra el aislamiento de células de incisivos de ratón, molares y muelas del juicio humanas como ejemplo, pero principalmente debería funcionar para otros dientes en varios organismos. El protocolo completo se visualiza esquemáticamente en la Figura 1. Este protocolo se ha utilizado recientemente para generar un atlas de tipo celular dental obtenido de dientes de ratón y humanos1.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones internacionales y locales y fueron aprobados por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Este protocolo se probó con ratones machos y hembras de tipo salvaje C57BL/6 y CD-1 y con ratones Sox10::iCreERT2 modificados genéticamente17 (combinados con varios sistemas de reporteros) sobre un fondo C57BL/6. Los experimentos con muestras humanas se realizaron con la aprobación de los Comités de Ética de la Facultad de Medicina, la Universidad Masaryk de Brno y el Hospital de la Facultad de Santa Ana en Brno, República Checa.

1. Configuración experimental y preparación de soluciones

  1. Configuración del instrumento
    1. Enfríe la centrífuga a 4 °C.
    2. Calentar la cámara de incubación a 37 °C.
    3. Arranque la máquina de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y ajuste todas las temperaturas del clasificador (incluido el soporte del tubo de recolección) a 4 °C. Realice el control de calidad del instrumento, configure el retardo de caída.
    4. Establezca la estrategia preliminar de cierre y realice la clasificación de pruebas.
      NOTA: Cuando utilice FACS, utilice la boquilla de 100 μm.
  2. Prepare las soluciones (pasos 1.2.1-1.2.3).
    1. Solución de lavado: Prepare FBS fresco al 2% (Fetal Bovine Serum) en HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution).
    2. Mezcla de digestión: Preparar colagenasa P fresca (3 U/mL) totalmente disuelta en HBSS.
    3. Opcional: Preparar HBSS + BSA fresco (0,04%) y enfriar metanol de grado analítico en un congelador de -20 °C para almacenar suspensión unicelular a -80 °C.
      NOTA: El paso 1 debe realizarse antes del inicio del experimento. La composición de las soluciones utilizadas se resume en la Tabla Suplementaria 1.

2. Preparación de animales de experimentación y dientes humanos

  1. Preparar los animales de experimentación (ratón).
    1. Sacrificar al ratón de acuerdo con las regulaciones locales; por ejemplo, por sobredosis de anestésicos como se describió anteriormente1.
      PRECAUCIÓN: Las regulaciones para la eutanasia humanitaria de animales de experimentación varían localmente. Siempre siga las regulaciones locales válidas.
    2. Proceda inmediatamente a la etapa de disección de tejidos (paso 3).
      NOTA: Si el tejido de los animales de experimentación no se puede diseccionar inmediatamente (por ejemplo, debido a la transferencia desde la instalación de alojamiento de animales), coloque a los animales de experimentación en hielo y realice la disección de tejidos lo antes posible. Para obtener más células de las pulpas molares de ratón, use animales más jóvenes (6 semanas y menos). Con el aumento de la edad, el tamaño de la pulpa dental disminuye. Los incisivos de ratón en su mayoría mantienen su estructura con el aumento de la edad, por lo que los animales de varias edades se pueden utilizar para la disección de tejidos.
  2. Preparar el diente humano
    NOTA: Los dientes humanos fueron extraídos por una razón clínicamente relevante. Cada diagnóstico fue tratado individualmente, y un cirujano dental experimentado siempre realizó la extracción del diente.
    1. Coloque el diente recién extraído inmediatamente en un tubo de 50 ml con HBSS helado y mantenga el tubo en hielo hasta su posterior procesamiento.
      NOTA: Se recomienda el uso de muelas del juicio retenidas de pacientes hasta los 25-30 años para obtener el mayor rendimiento celular.

3. Disección tisular

  1. Sostenga al animal experimental detrás de su cabeza, mirando el aspecto ventral de su cabeza para que la cola apunte hacia otro lado.
  2. Usando tijeras pequeñas y afiladas, retire rápidamente la piel de la mandíbula para exponer el arco mandibular, el tejido blando entre cada mitad de las mandíbulas y los músculos faciales adyacentes.
    1. Haga un corte profundo de cada lado de la mandíbula; en primer lugar, a través de m. masseter a lo largo del lado bucal de la mandíbula hasta la articulación temporomandibular, y luego a lo largo de la parte interna de cada mitad de la mandíbula a través de la base de la cavidad oral (ver Figura suplementaria 1).
  3. Corte todos los músculos y ligamentos a lo largo de la mandíbula hasta la articulación temporomandibular tanto desde el exterior como desde el interior de la cavidad oral.
    NOTA: Evite cortar huesos. Esto podría dañar la parte más apical del incisivo.
  4. Agarre la mandíbula con pinzas de punta doblada y retírela. Luego, divida la mandíbula diseccionada en dos mitades con tijeras cortando la sínfisis mandibular (ver Figura suplementaria 1).
  5. Use una toallita industrial de baja pelusa para irritar el tejido blando restante de cada mitad de la mandíbula. Después de limpiar ambas partes de la mandíbula, colóquelas en una placa de Petri preparada previamente con HBSS helado.
    NOTA: A partir de este momento, trabaje en hielo. La disección adicional de incisivos y molares de ratón se realiza bajo un estereomicroscopio con un fondo negro.
  6. Incisivos mandibulares de ratón
    1. Para la disección de incisivos mandibulares, retirar la cresta alveolar con los tres molares y agrietar transversalmente el arco mandibular en el lugar correspondiente a la posición entre el primer y segundo molar.
      NOTA: Se utiliza una hoja de bisturí afilada nº 11 y pinzas para realizar este paso (ver Tabla de Materiales).
    2. Extraiga con cuidado el incisivo del resto del alvéolo dental.
      NOTA: Si tiene éxito, el incisivo extraído contendrá partes apicales intactas, incluido el tejido epitelial con asas cervicales completas.
    3. Si es necesario, retire los fragmentos restantes de hueso aún unidos al incisivo con pinzas y un bisturí.
    4. Coloque los incisivos disecados en HBSS fresco y helado y diseccione el tejido de interés: asa cervical, pulpa dental u otras partes del diente.
    5. Coloque el tejido blando diseccionado en una gota de HBSS fresco y helado en medio de una placa de Petri de 10 cm. Manténgase en hielo.
  7. Molares mandibulares de ratón
    1. Para diseccionar molares mandibulares, retire completamente la cresta alveolar del resto de la mandíbula con una cuchilla de bisturí.
    2. Mueva la cresta alveolar diseccionada en HBSS fresco y helado en una placa de Petri y retire cuidadosamente todos los fragmentos restantes de huesos alveolares unidos a las raíces.
    3. Coloque los molares disecados sin hueso alveolar en HBSS fresco y helado. Para exponer la pulpa, comience a eliminar partes de la dentina del lado apical usando pinzas finas y afiladas hasta que llegue a la cavidad pulpar.
    4. Una vez que se alcanza la cavidad pulpar, diseccione cuidadosamente la pulpa dental con un par de pinzas de punta afilada y coloque el tejido blando de la pulpa dental en una gota de HBSS fresco y helado en medio de una placa de Petri de 10 cm mantenida en hielo.
      NOTA: Dado que las pulpas molares de ratón son extremadamente pequeñas, adapte el aumento en el estereomicroscopio en consecuencia.
  8. Diente humano
    1. Lave el diente humano una vez más en HBSS helado para eliminar la sangre restante.
    2. Coloque el diente en tres bolsas de plástico estéril de paredes gruesas y use la vise de un ingeniero de sobremesa de hierro fundido para romper el diente. Use mandíbulas con una superficie plana para evitar penetrar en las bolsas.
    3. Apriete lentamente la visera hasta que escuche que el diente se agrieta; retírelo de las bolsas y colóquelo en HBSS fresco y helado en una placa de Petri.
    4. Con dos pinzas, saque la pulpa dental, límpiela de todos los restos de tejido duro y colóquela en una gota de HBSS helado en medio de una placa de Petri de 10 cm mantenida en hielo.
      PRECAUCIÓN: El tejido humano podría ser potencialmente infeccioso. Cuando trabaje con tejido humano, use equipo de protección para evitar el contacto directo con el tejido.

4. Preparación de la suspensión unicelular

  1. Preparar un tubo de 15 mL con 2,5 mL de mezcla de digestión compuesta de Colagenasa P (3 U/mL) totalmente disuelta en HBSS. Mantenga la solución en hielo hasta su uso.
    NOTA: Siempre use colagenasa P recién preparada; no congelar las alícuotas. La actividad de la colagenasa P varía de un lote a otro. Compruebe la actividad de su lote antes de diluir. La colagenasa P es activada por el calcio, cuya cantidad ya es suficiente en el polvo liofilizado. Por lo tanto, no es necesario enriquecer la mezcla de enzimas con calcio. La colagenasa P no es inactivada por FBS, pero puede ser inactivada por agentes quelantes (por ejemplo, etilendiaminatetraacético - EDTA). La detención del proceso de disociación se garantiza diluyendo la colagenasa P en solución de lavado (2% FBS en HBSS). Se ha demostrado que la adición de FBS aumenta la viabilidad celular y el número final de células después de la clasificación18.
  2. Usando una hoja de bisturí de forma redonda no. 10, corte el tejido en todas las direcciones en las piezas más pequeñas posibles. Vuelva agregar las piezas de tejido en el medio de la gota y corte repetidamente los agregados de tejido con una hoja de bisturí de forma redonda (No. 10). Repita este proceso varias veces hasta que el material esté lo suficientemente picado.
  3. Transfiera las piezas de tejido trituradas con una punta de pipeta de 1 ml a la mezcla de digestión preparada.
    NOTA: En el caso de un mayor número de animales que se procesan a la vez, divida el tejido en varios tubos con colagenasa P. La cantidad máxima por tubo son pulpas obtenidas de aproximadamente 10 incisivos de ratón. En el caso de los molares, donde las pulpas son mucho más pequeñas, el número de pulpas procesadas se puede aumentar adecuadamente. Cuando use dientes humanos, use un máximo de 2-3 pulpas por tubo, dependiendo del tamaño de la pulpa.
  4. Coloque el tubo en una incubadora precalentada a 37 °C con un agitador. Incline el tubo dentro del agitador a un ángulo de 60 ° y ajuste la velocidad a 150-200 rpm para garantizar movimientos de suspensión constantes dentro del tubo.
  5. Tritura vigorosamente la suspensión cada 3-4 min con una punta de pipeta de 1 ml para desintegrar todos los grupos.
    NOTA: Con el tiempo, los grupos se volverán más pequeños y suaves hasta que casi desaparezcan.
  6. En total, incubar durante 15-20 min. Al final de la incubación, triture por última vez y luego agregue lentamente la solución de lavado helada a un volumen final de 12 ml.
  7. Retire los grupos o trozos restantes de tejido calcificado filtrando la suspensión con un colador de células de 50 μm.
  8. Tome 10-20 μL de la suspensión celular filtrada y cuente las células durante la centrifugación utilizando una cámara de conteo celular (hemocitómetro). Centrifugadora durante 5 min a 300 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 ml.
    NOTA: Si el número de células es limitado que no se pueden contar en suspensión diluida, omita el recuento de células y use todas las células para su posterior procesamiento.
  9. Opcional: Proceda a la fijación y el almacenamiento21.
    1. Vuelva a suspender los gránulos (hasta 107 células) en 100 uL de HBSS + BSA (0,04%).
    2. Añadir 400 μL de metanol refrigerado y mezclar lentamente.
    3. Incubar la suspensión celular durante 15 min sobre hielo.
    4. Conservar a -80 °C hasta que se procese (no más de 1 mes).
  10. Vuelva a suspender el pellet en la solución de lavado. Apunte a 700-1200 células/μL de la solución de lavado.
  11. Mantenga el tubo en hielo hasta su posterior procesamiento.
    NOTA: Si es necesario, realice la fijación y el almacenamiento a -80 °C. Sin embargo, se recomienda el procesamiento inmediato de la suspensión celular para scRNA-seq. Los pasos adicionales dependerán del protocolo seq de ARN unicelular. Cuando el protocolo scRNA-seq utiliza un sistema microfluídico (algunas compañías de sc-RNA-seq lo hacen), cargue las células según las pautas del fabricante, ya sea directamente o después de la clasificación celular.
  12. Para FACS, continúe con el paso 5.

5. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

  1. Antes de ordenar, prepare el instrumento de clasificación de celdas.
    1. Enfríe todo el sistema a 4 ° C, realice el control de calidad del instrumento, ajuste el retardo de caída y el voltaje de las placas de deflexión. Coloque los tubos de recolección en el soporte del tubo de recolección.
      NOTA: Para evitar pasos de centrifugación adicionales que resulten en una pérdida celular inevitable, clasifique las células en un microtubo (1,5 ml) con una pequeña cantidad (25-50 μL) de la solución de lavado.
  2. Opcional: realizar tinción de viabilidad antes de FACS.
    1. Añadir yoduro de propidio en suspensión celular antes de FACS a una concentración final de 0,5 μg/ml e incubar durante 15 min a 4 °C.
  3. Cargue la muestra en el clasificador de celdas. Establezca una estrategia estricta de cierre para eliminar los desechos celulares, los dobletes y las células muertas. Clasifique las células en un tubo preparado o placas de múltiples pocillos. Un ejemplo de una estrategia de cierre se muestra en la Figura 2.
    NOTA: Para minimizar los pasos de manipulación y acelerar el protocolo, se recomienda aplicar una estrategia estricta de cierre (sugerida en la Figura 2) en lugar de usar una tinción de viabilidad. Para separar las células inmunes de la población aislada, se puede realizar la tinción de anticuerpos CD45. Para realizar esto, resuspenda la suspensión celular en 100 μL de solución de tinción (PBS + 2% FBS + anticuerpo conjugado anti-CD45-APC 1/100 dilución). Incubar durante 15 min sobre hielo protegido de la luz y realizar FACS directamente.

Resultados

Se realizó un aislamiento ejemplar de células individuales de dos incisivos mandibulares de un macho de ratón C57BL/6 de 6 semanas de edad. Siguiendo este protocolo, se preparó una suspensión unicelular y, posteriormente, se realizó la secuenciación unicelular. La suspensión monocelular preparada fue analizada y clasificada mediante FACS (Figura 2). En primer lugar, se aplicó el trazado FSC-A (forward scatter, area) y SSC-A (side scatter, area), y se utilizó una estrategia de gating adecuada para seleccionar una población con el tamaño y la granularidad esperados para filtrar nuestros desechos celulares y dobletes celulares o agregados (Figura 2A). Esta población seleccionada (P1), que cuenta con el 38% de todos los eventos, se utilizó además, y se aplicaron los parámetros FSC-A y FSC-H (dispersión hacia adelante, altura) para eliminar los dobletes celulares restantes (Figura 2B). La población sin dobletes celulares (P2) que cuenta el 95% de P1 se puede utilizar posteriormente para scRNA-seq. Alternativamente, se puede utilizar una compuerta adicional para seleccionar la población de interés (por ejemplo, expresión de proteínas fluorescentes o tinción viva / muerta). Para comprobar el número de células vivas/muertas en la suspensión final, se realizó la tinción PI (yoduro de propidio) (Figura 2C). La población P3 que contenía células PI( vivas) fue del 98,4% de la población P2 madre y del 35,5% del total de eventos. El número total de células filtradas y muertas (PI+) fue de 1887.

El número final de células obtenidas sin tinción de viabilidad adecuada para RNA-seq (P2) contó 118.199 células de dos pulpas incisivas de ratón. Esto significa el número de casi 60.000 células vivas de un incisivo mandibular.

Para aclarar el número de células inmunes en la suspensión final de una sola célula, se utilizaron dos enfoques. En primer lugar, se utilizó la tinción de anticuerpos CD45 y el posterior análisis FACS. Como método complementario, se analizó el número total de células inmunes (CD45+) en los datos de scRNA-seq. El análisis FACS mostró un 14,44% de células CD45+ (13,20% vivas y 1,24% muertas) (Figura 3A). El análisis de los datos de scRNA-seq mostró un 10,90% de células que expresan CD45 (Figura 3B). La disminución de las células CD45 + en los datos de scRNA-seq puede ser causada por un umbral adicional durante el análisis de scRNA-seq.

Estos datos representativos sobre el ejemplo del incisivo de ratón muestran que el protocolo dado en combinación con una estricta estrategia de cierre es eficiente para obtener un alto número de células de un solo diente de ratón sin la necesidad de un uso adicional de tinción de viabilidad. La proporción de células inmunes (CD45+) fue menor (13,2%). Además, se demostró previamente que las células inmunes son esenciales para mantener la homeostasis dental, por lo que eliminarlas del análisis scRNA-seq durante el FACS sería contraproducente en algunas aplicaciones.

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Figura 1: Representación esquemática del protocolo. Se representan diferentes pasos, incluidas las condiciones de temperatura y el tiempo esperado, para preparar la suspensión unicelular de dientes de ratón y humanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ejemplo de la estrategia de cierre. Se utilizó la compuerta FSC-A y SSC-A para producir la compuerta P1, reflejando la población celular con el tamaño y la granularidad esperados y filtrando los restos de la matriz celular y extracelular y la mayoría de los eventos grandes (A). Posteriormente, la población P1 se trazó en la gráfica FSC-H y FCS-A, que filtraron los dobletes celulares (B). Esta población P2 fue analizada para detectar la presencia de células muertas por yoduro de propidio (C). El número de eventos/celdas por puerta se representan en (D). (FSC-A - dispersión hacia adelante, área; SSC-A - dispersión lateral, área; FSC-H - dispersión hacia adelante, altura; PI - yoduro de propidio). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cuantificación de las células inmunes. La cuantificación de las células inmunes se realizó mediante el análisis FACS de células teñidas con anticuerpos anti-CD45 y el análisis vivo/muerto mediante tinción de yoduro de propidio (A). Se realizó una cuantificación adicional de las células inmunes durante el análisis scRNA-seq (B). (CD45-APC - anticuerpo conjugado de aloficocianina anti-CD45; PI - yoduro de propidio; t-SNE - incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Visión general del proceso de disección de la mandíbula. Las líneas discontinuas ilustran los cortes sugeridos. ATM - articulación temporomandibular, m. masetero - musculus masseter. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Las composiciones de las soluciones utilizadas en el estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El estudio de dientes y huesos a nivel celular o molecular es generalmente un desafío, ya que las células que forman estos tejidos están rodeadas por diferentes tipos de matrices duras19. Uno de los principales objetivos para realizar RNA-seq unicelular en el tejido dental es la necesidad de obtener células de interés rápidamente y sin ningún cambio artificial en sus transcriptomas. Para lograr esto, se desarrolló un protocolo altamente eficiente adecuado para aislar células de pulpas dentales de ratón y humanos, lo que permite la generación rápida de suspensiones unicelulares para todas las aplicaciones transcriptómicas. Esto se aseguró mediante el aislamiento rápido de tejidos, minimizando los pasos de las manipulaciones de tejidos y células, y racionalizando la digestión mecánica y enzimática.

Los pasos más críticos de este protocolo son el procesamiento rápido de tejidos y la preparación adecuada de la suspensión unicelular8,9. Se utiliza un enfoque manual para obtener pulpas dentales sin utilizar un taladro dental u otros dispositivos generadores de calor. El sobrecalentamiento puede causar una expresión artificial de proteínas de choque térmico y otros genes, lo que en última instancia lleva a que los patrones de expresión génica analizados no sean representativos del tejido original20. La recolección manual de tejidos puede ser un paso desafiante que probablemente necesitará algo de entrenamiento de antemano. La pulpa se corta en trozos pequeños y se digiere enzimáticamente a 37 °C. A excepción de los 15-20 min de digestión enzimática, todo el protocolo se realiza a 4 °C. El procesamiento tisular y especialmente la digestión enzimática se minimizaron al menor tiempo posible, ya que una incubación más prolongada a 37 °C puede provocar cambios en los patrones de expresión génica10. Se recomienda la eliminación mecánica de la dentina antes de la digestión enzimática. La dentina y la predentina unida a la pulpa contienen una gran cantidad de colágeno, y su presencia excesiva podría disminuir la efectividad de la solución de digestión. Después de ser eliminadas del cuerpo (o la muerte de los organismos), se demostró que las células comienzan a modificar sus patrones de expresión génica rápidamente12. Por lo tanto, el aislamiento y procesamiento celular debe llevarse a cabo lo más rápido posible. El protocolo actual reduce el tiempo de procesamiento a 35-45 minutos desde el aislamiento del tejido (eutanasia animal) hasta la preparación de la suspensión unicelular.

Una modificación alternativa de esta técnica es la preservación celular para su uso posterior. Esto se logra mediante la fijación de metanol. La suspensión de célula fija de metanol puede almacenarse hasta 1 mes a -80 °C, como se describe en el protocolo21. Sin embargo, siempre que sea posible, realizar scRNA-seq directamente, ya que se demostró que los datos unicelulares de suspensiones unicelulares fijadas con metanol podrían sufrir una mayor expresión de genes relacionados con el estrés y contaminación con ARN ambiental22. Este paso puede necesitar modificaciones adicionales de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Antes de la primera aplicación de este protocolo, se recomienda realizar varios pasos de validación para probar la técnica. Desde nuestra experiencia, sugerimos probar los pasos críticos antes mencionados del protocolo. Además, sugerimos probar la efectividad de la solución de colagenasa P y probar el manejo de la etapa de disociación tisular. Específicamente, alrededor de los primeros 5 minutos después del inicio de la incubación de la colagenasa P, los trozos de tejido deben agregarse. Esta es una situación común. Los agregados se desintegran cada 3-4 minutos utilizando una pipeta de 1 ml, y con el aumento del tiempo, deben hacerse más pequeños hasta apenas visibles.

Además, se recomienda realizar el conteo celular en una cámara de conteo celular antes de la centrifugación y antes y después del filtrado para detectar posibles pérdidas celulares debido a la eliminación subóptima del sobrenadante. Si la suspensión final de una sola célula necesita ser purificada, se puede utilizar FACS. La clasificación celular no solo permite eliminar escombros o células muertas, sino que también permite enriquecer la suspensión final con células marcadas fluorescentemente13,19. Para evitar la tensión cortante o la obstrucción del clasificador celular, se utiliza una boquilla ancha (85 μm o 100 μm). Esto mejorará aún más la viabilidad de las células clasificadas.

Esta técnica fue diseñada y probada tanto en dientes de ratón como humanos. El principal factor limitante es el pequeño número de células en las pulpas dentales reducidas de los dientes de ratones más viejos (molares) y humanos. Supongamos que se necesita obtener un mayor número de células o que se van a adquirir células de los dientes de pacientes mayores. Una posible solución es procesar un mayor número de dientes y fusionarlos en un solo lote, posteriormente procesados como una muestra.

Las células vivas de la pulpa dental humana se aislaron por primera vez hace más de veinte años utilizando una mezcla enzimática de colagenasa I y dispasa23. Desde entonces, los aislamientos de las células de la pulpa dental se utilizaron ampliamente, y se han utilizado varias técnicas5,6,7,8. La importancia crítica del método presentado aquí es la adaptación de todos los pasos de aislamiento para hacer que el aislamiento sea rápido y suave para garantizar la alta calidad de la suspensión celular final para scRNA-seq. Se puede obtener un mayor rendimiento celular mediante una incubación más prolongada con enzimas. Este protocolo proporciona una solución eficiente para obtener rápidamente células individuales de dientes de ratón y humanos de calidad adecuada para la secuenciación de ARN unicelular. Se espera que esta técnica sea ampliamente utilizada para otros tejidos u organismos con solo ligeras modificaciones técnicas.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

J.K. fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la Universidad de Masaryk (MUNI/H/1615/2018) y por fondos de la Facultad de Medicina MU a investigador junior. J.L. fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la Universidad de Masaryk, (MUNI/IGA/1532/2020) y es becario de Brno Ph.D. Talent Scholarship- Financiado por el Municipio de la Ciudad de Brno. T.B. fue apoyado por el Fondo Austriaco para la Ciencia (beca Lise Meitner: M2688-B28). Agradecemos a Lydie Izakovicova Holla y Veronika Kovar Matejova por su ayuda con la obtención de dientes humanos. Finalmente, agradecemos a Radek Fedr y Karel Soucek por su amable asistencia con la clasificación de FACS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo anti-ratón CD45 de APCBioLegend103112
Albúmina sérica bovina Fracción VRoche10735078001
CellTrics 50 µ m, estérilSysmex04-004-2327
Colagenasa P (COLLP-PRO)Roche11213857001
CUTFIX Hojas de bisturí, Fig. 10AESCULAP16600495
CUTFIX, Fig. 11AESCULAP16600509
Suero Fetal Bovino (América del Sur), Endotoxina ultra bajaBioseraFB-1101/500
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin Ca2+ y Mg2+SIGMAH6648
Toallitas industriales bajas en pelusa, MAX60DirteezeMAX60B176
Pinzas fuertes industriales, estilo 660, puntas puntiagudas dentadas dobladas, 150mmValue-Tec50-014366
Alcohol metílico A.G.Penta21210-11000
Solución de yoduro de propidioBioLegend421301
Mango de bisturíCM InstrumenteAG-013-10
Pipetas serológicas 10mL, envueltas individualmente, 200 uds.CAPPSP-10-C
Microscopio estereoscópicoLeicaEZ4
Tijeras quirúrgicas (9cm)CM InstrumenteAI-430-09Y
Plato de cultivo de tejidos Ø 100 mmTPP93100
Hojas de bisturí

Referencias

  1. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816(2020).
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