Artículo de método

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

DOI:

10.3791/63045

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24 de septiembre de 2021

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1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

En este artículo

Resumen

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El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bajo estado estacionario, las células madre hematopoyéticas (HSC) permanecen en gran medida inactivas y se cree que dependen predominantemente de la glucólisis para satisfacer sus necesidades energéticas. Sin embargo, en condiciones de estrés como la infección o la pérdida de sangre, las HSC se vuelven proliferativas y producen rápidamente células progenitoras aguas abajo, que a su vez se diferencian aún más, produciendo en última instancia células sanguíneas maduras. Durante este proceso de transición y diferenciación, las HSC salen de la inactividad y se someten rápidamente a un cambio metabólico de la glucólisis a la fosforilación oxidativa (OxPHOS). Varias condiciones de estrés, como el envejecimiento, el cáncer, la diabetes y la obesidad, pueden afectar negativamente la función mitocondrial y, por lo tanto, pueden alterar la reprogramación metabólica y la diferenciación de las HSC y los progenitores durante la hematopoyesis. Se pueden obtener información valiosa sobre las funciones glucolíticas y mitocondriales de las HSC y los progenitores en condiciones normales y de estrés a través de la evaluación de su tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), que son indicadores de la glucólisis celular y la respiración mitocondrial, respectivamente.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado para medir ECAR y OCR en poblaciones de células negativas de linaje derivadas de la médula ósea de ratón, que incluyen células madre hematopoyéticas y células progenitoras primitivas (HSPC), utilizando el analizador de flujo extracelular. Este protocolo describe enfoques para aislar células de linaje negativo de la médula ósea de ratón, explica la optimización de la densidad de siembra celular y las concentraciones de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG, un análogo de glucosa que inhibe la glucólisis) y varios medicamentos dirigidos a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A) utilizados en estos ensayos, y describe las estrategias de tratamiento farmacológico. Los parámetros clave del flujo glicolítico, como la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva glucolítica, y los parámetros de OxPHOS, como la respiración basal, la respiración máxima, la fuga de protones, la producción de ATP, la capacidad respiratoria excedente y la eficiencia de acoplamiento, se pueden medir en estos ensayos. Este protocolo permite mediciones de ECAR y OCR en HSPC no adherentes y se puede generalizar para optimizar las condiciones de análisis para cualquier tipo de células de suspensión.

Introducción

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La hematopoyesis es el proceso por el cual se forman varios tipos de células sanguíneas maduras con funciones altamente especializadas a partir de HSCs1. Las HSC son capaces de autorrenovarse y diferenciarse en varias poblaciones progenitoras multipotentes y específicas del linaje. Estos progenitores finalmente producen células de linajes linfoides, mieloides, eritroides y megacariocitarios. Para mantener su capacidad de autorrenovación, las HSC permanecen en gran medida inactivas y, al igual que otras células madre tisulares, se cree que dependen de la glucólisis en lugar de OxPHOS mitocondrial para la producción de ATP 2,3. La entrada en el ciclo celular conduce a una mejor respiración y OxPHOS, lo que resulta en niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son perjudiciales para el mantenimiento y la función de HSC3. Por lo tanto, la división celular repetida puede conducir a una reducción de la capacidad de autorrenovación de las HSC y, en última instancia, a su agotamiento.

En la hematopoyesis adulta, las HSC se someten principalmente a una división celular asimétrica, durante la cual una de las células hijas conserva el potencial de HSC y continúa dependiendo del metabolismo glicolítico. La otra célula hija se convierte en una célula progenitora primitiva que pierde capacidad de autorrenovación pero prolifera y eventualmente da lugar a células hematopoyéticas funcionales diferenciadas4. Cuando las HSC se diferencian para producir progenitores aguas abajo, se cree que se produce un cambio de la glucólisis al metabolismo mitocondrial para suministrar la energía y los bloques de construcción necesarios para apoyar esta rápida transición5, como sugieren las observaciones de que las HSC poseen una masa mitocondrial inactiva 6,7,8,9 . Por el contrario, la actividad mitocondrial (indicada por los niveles de ROS vinculados) es mucho mayor en los progenitores comprometidos por el linaje que en las HSC 9,10,11. Por lo tanto, los cambios metabólicos que ocurren durante el primer paso de la hematopoyesis sugieren un papel directo y crucial de las mitocondrias en la regulación del destino de HSC.

Las mitocondrias disfuncionales presentes bajo diversas condiciones de estrés, como el envejecimiento, el cáncer, la diabetes y la obesidad12, pueden interferir con la capacidad de autorrenovación de HSC, induciendo un desequilibrio en la diferenciación HSC/progenitor al producir cantidades excesivas de ROS, afectar la producción de ATP y/o alterar otros procesos metabólicos 9,12,13 . Las perturbaciones en la homeostasis metabólica en la diferenciación HSC/progenitor podrían afectar significativamente a la hematopoyesis, contribuyendo potencialmente al desarrollo de anomalías hematológicas13. Dadas las influencias críticas de la glucólisis y el OxPHOS mitocondrial en el tallo y la diferenciación de HSC, es de interés investigar tanto los parámetros metabólicos en condiciones normales como de estrés. Se pueden obtener información valiosa sobre la función glucolítica y mitocondrial de las HSC y las células progenitoras mediante la evaluación de su ECAR y OCR, que son indicadores de la glucólisis celular y la respiración mitocondrial, respectivamente.

El analizador de flujo extracelular Seahorse es un potente aparato equipado con dos sondas por pozo para medir simultáneamente ECAR y OCR en células vivas y, por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la bioenergética celular en tiempo real, en respuesta a diversos sustratos o inhibidores. El cartucho de ensayo utilizado con el analizador contiene puertos de inyección para contener hasta cuatro medicamentos para la inyección automatizada durante el ensayo. En la Figura 1A se muestra un esquema de una prueba de esfuerzo de glucólisis típica. El ensayo comienza con la medición de ECAR de células, incubadas en medio de prueba de esfuerzo de glucólisis que contiene glutamina pero no glucosa o piruvato. Esto representa la acidificación que ocurre debido a las actividades no glucolíticas de las células y se informa como acidificación no glicolítica. Esto es seguido por la inyección de glucosa a una concentración saturante. A través de la glucólisis, la glucosa en la célula se convierte en piruvato, que se metaboliza aún más en el citoplasma para producir lactato, o en las mitocondrias para producir CO2 y agua.

La conversión de glucosa en lactato provoca la producción neta y la posterior liberación de protones en el medio extracelular, lo que resulta en un rápido aumento de la ECAR 14,15,16. Este cambio estimulado por la glucosa en ECAR se informa como glucólisis en condiciones basales. La segunda inyección consiste en oligomicina (un inhibidor de la ATP sintasa, también conocido como complejo V17), que inhibe la producción mitocondrial de ATP. Durante la inhibición de OxPHOS mediada por oligomicina, las células regulan al máximo la glucólisis para satisfacer sus demandas energéticas. Esto provoca un aumento adicional en ECAR, revelando la capacidad glucolítica máxima de las células. La diferencia entre la capacidad glucolítica máxima y la glucólisis basal se conoce como reserva glucolítica. Finalmente, se inyecta 2-DG, lo que provoca una caída significativa en ECAR, generalmente cerca de los niveles de acidificación no glicolítica. 2-DG es un análogo de la glucosa que se une competitivamente a la hexoquinasa, lo que resulta en la inhibición de la glucólisis18. Por lo tanto, la disminución inducida por 2-DG en ECAR confirma aún más que la glucólisis es de hecho la fuente de ECAR observada después de las inyecciones de glucosa y oligomicina.

La Figura 1B muestra el esquema de una prueba de esfuerzo mitocondrial típica. El ensayo comienza con la medición de OCR basal de las células, incubadas en un medio de prueba de esfuerzo mitocondrial que contiene glucosa, glutamina y piruvato. Después de las mediciones basales de OCR, se inyecta oligomicina en este ensayo, que inhibe el complejo V, reduciendo así el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones (ETC)17. En consecuencia, el OCR se reduce en respuesta a la inyección de oligomicina, y esta disminución en el OCR está relacionada con la producción de ATP mitocondrial. La segunda inyección consiste en cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxia) fenilhidrazona (FCCP), un protonóforo y un desacoplador de OxPHOSmitocondrial 17. FCCP colapsa el gradiente de protones mitocondriales al permitir el flujo de protones a través de la membrana interna mitocondrial. Debido a la inyección de FCCP, el flujo de electrones a través del ETC se reprime, y el complejo IV consume oxígeno al nivel máximo. La diferencia entre el OCR máximo y el OCR basal se conoce como la capacidad respiratoria sobrante, que es una medida de la capacidad de la célula para responder al aumento de la demanda de energía en condiciones de estrés. Finalmente, se inyecta una mezcla de dos inhibidores de ETC (rotenona, un inhibidor del complejo I, y antimicina A, un inhibidor del complejo III17), que apaga completamente el flujo de electrones y el OCR disminuye a un nivel bajo. El OCR medido después de la inyección de rotenona y antimicina A corresponde al OCR no mitocondrial impulsado por otros procesos dentro de las células. El OCR no mitocondrial permite el cálculo de la respiración basal, la fuga de protones y la respiración máxima.

La respiración basal representa la diferencia entre la OCR basal y la OCR no mitocondrial. La fuga de protones se refiere a la diferencia entre el OCR después de la inyección de oligomicina y el OCR no mitocondrial. La respiración máxima representa la diferencia entre el OCR después de la inyección de FCCP y el OCR no mitocondrial. La eficiencia de acoplamiento se calcula como el porcentaje de la tasa de producción de ATP a la tasa de respiración basal. Este documento de método proporciona un protocolo detallado para medir ECAR y OCR en HSPC de linaje negativo utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96. Este protocolo describe los enfoques para aislar los HSPC negativos para el linaje de ratones, explica la optimización de la densidad de siembra celular y las concentraciones de varios fármacos utilizados en los ensayos de flujo extracelular y describe las estrategias de tratamiento farmacológico.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales vertebrados fueron aprobados y realizados de acuerdo con las regulaciones del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan.

1. Día antes del ensayo (Tiempo total: ~10 min)

  1. Hidratación del cartucho del sensor (tiempo de paso: ~ 10 min)
    1. Abra el kit de ensayo de flujo extracelular y retire el cartucho del sensor y el conjunto de la placa de utilidad. Guarde los pisos de guía de carga para usarlos al día siguiente.
    2. Separe manualmente el cartucho del sensor (la parte verde superior con tapa) de la placa de utilidad (microplaca inferior de 96 pocillos) y colóquelo boca abajo junto a la placa de utilidad.
    3. Usando una pipeta multicanal, llene cada pozo de la placa de utilidad con 200 μL de calibrante, incluido con el kit de ensayo de flujo.
    4. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad, asegurándose de sumergir completamente los sensores en el calibrante.
    5. Coloque el cartucho del sensor ensamblado y la placa de utilidad con el calibrante en una incubadora sin CO2 a 37 °C durante la noche. Para evitar la evaporación del calibrante, asegúrese de que la incubadora esté humidificada adecuadamente. Si utiliza una incubadora de horno normal para incubaciones sin CO2 a 37 °C, coloque un vaso de precipitados abierto que contenga agua dentro de la incubadora para humidificarla. Si está disponible, utilice una estación de preparación XF para todas las incubaciones sin CO2 a 37 °C.
      NOTA: Alternativamente, el cartucho del sensor se puede hidratar durante la noche con 200 μL por pozo de agua ultrapura estéril en una incubadora sin CO2 a 37 °C. Reemplace el agua con 200 μL por pozo de calibrante precalentado de 37 °C, al menos 45-60 min antes de cargar los puertos de inyección el día del ensayo.

2. Día del ensayo (Tiempo total: ~9 h 30 min)

NOTA: El tiempo total indicado anteriormente incluye las duraciones acumuladas de los pasos 2.1-2.4, además del paso 2.5 o el paso 2.6.

  1. Preparación de microplacas recubiertas de adhesivo celular (tiempo de paso: ~1 h 30 min)
    NOTA: Realice todos los pasos en un gabinete de bioseguridad.
    1. Preparar 2,5 ml de la solución adhesiva celular (22,4 μg/ml, consulte la Tabla de materiales) por microplaca de cultivo celular de 96 pocillos disolviendo 56 μg del adhesivo celular en un volumen apropiado de bicarbonato de sodio esterilizado por filtro de 0,1 M (pH 8,0) y añadiendo inmediatamente hidróxido de sodio 1 N a la mitad del volumen de material adhesivo celular utilizado. Vórtice o pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    2. Abra la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos (incluida con el kit de ensayo de flujo) y dispense 25 μL de la solución adhesiva celular preparada en el fondo de cada pozo. Cubra la microplaca con la tapa e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de la campana.
    3. Después de la incubación, retire y deseche el exceso de solución adhesiva celular con una pipeta o aspirador multicanal, y lave cada pozo dos veces con 200 μL de agua ultrapura estéril. Seque al aire la placa, con la tapa retirada, dentro de la campana durante 30-45 min.
      NOTA: Las microplacas de cultivo celular recubiertas con adhesivo celular pueden almacenarse hasta una semana a 4 °C. Las microplacas precubiertas almacenadas a 4 °C deberán dejarse calentar a temperatura ambiente dentro de la campana antes de sembrar las células.
  2. Preparación de medios de ensayo (tiempo de paso: ~ 30 min)
    1. Preparación del medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis
      1. Suplementar 100 mL de medio base (ver la Tabla de Materiales) con 1 mL de 200 mM L-glutamina.
        NOTA: La concentración final de L-glutamina en el medio de ensayo es de 2 mM.
      2. Caliente el medio suplementado con L-glutamina a 37 ° C en un baño de agua.
      3. Ajuste el pH del medio cálido a 7.4 con 1 N NaOH.
      4. Esterilizar con filtro el medio con un filtro de 0,2 μm y mantenerlo a 37 °C hasta que esté listo para usar.
    2. Preparación del medio de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial
      1. Suplementar 100 mL del medio base con 0,45 g de glucosa, 1 mL de 200 mM de L-glutamina y 1 mL de piruvato de sodio de 100 mM.
        NOTA: El medio de ensayo final contiene 25 mM de glucosa, 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio.
      2. Glucosa tibia, L-glutamina y el medio suplementado con piruvato de sodio a 37 ° C en un baño de agua.
      3. Ajuste el pH del medio cálido a 7.4 con 1 N NaOH.
      4. Filtro-esterilizar el medio con un filtro de 0,2 μm y mantener a 37 °C hasta que esté listo para usar.
  3. Cosechar HSPC negativos para el linaje del ratón (tiempo de paso: ~ 3 h)
    1. Prepare el tampón del ensayo complementando la solución de sal equilibrada de Hank con suero bovino fetal al 4%. Prepare 1x tampón de enriquecimiento diluyendo el caldo 5x con agua destilada estéril. Mantenga ambos tampones en hielo hasta su uso.
    2. Sacrificar humanamente a los ratones usando CO2 seguido de dislocación cervical y eliminar las extremidades posteriores con tijeras. Retire cuidadosamente todos los tejidos de los huesos y corte los extremos de ambos lados del fémur y la tibia con tijeras. Elimine las células de la médula ósea del fémur y la tibia con el tampón del ensayo. Pase las células enjuagadas a través de un filtro estéril de 70 μm, centrifugue el filtrado a 200 × g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
    3. Lisar los glóbulos rojos resuspiendo el gránulo celular en 500 μL de tampón ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2). Después de la lisis durante 1 min en hielo, lave las muestras agregando 1 ml de tampón de ensayo y centrífuga a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
    4. Después del lavado, incube las muestras con un cóctel de anticuerpos biotinilados dirigidos contra CD2 (dilución 1:200), CD3 (dilución 1:200), CD5 (dilución 1:200), CD8 (dilución 1:200), Ter-119 (dilución 1:200), B220 (dilución 1:200) y Gr-1 (dilución 1:800) durante 45 min en hielo en un volumen total de 500 μL de tampón de ensayo.
    5. Lave las muestras con 1 ml de tampón de ensayo con centrifugación como la anterior.
    6. Lave las muestras con 1 ml de tampón de enriquecimiento 1x con centrifugación como se indica arriba.
    7. Incubar las muestras con 20 μL de nanoperlas de estreptavidina y 100 μL de tampón de enriquecimiento 1x sobre hielo durante 15 min.
    8. Lave las muestras con 1 ml de tampón de enriquecimiento 1x con centrifugación como se indica arriba.
    9. Resuspend las muestras en 2,5 mL de tampón de enriquecimiento 1x. Colóquelos en un imán de separación durante 5 min. Recoger los sobrenadantes por separado en tubos cónicos de 15 ml.
    10. Resuspender muestras separadas por imán en un tampón de enriquecimiento adicional de 2,5 ml y colocarlas nuevamente en el imán de separación durante 5 minutos. Recoger y combinar sobrenadantes a las colecciones anteriores en tubos cónicos de 15 ml del paso 2.3.9.
      NOTA: Los sobrenadantes contienen las fracciones celulares negativas para el linaje.
    11. Centrifugar los tubos cónicos de 15 ml que contienen las células seleccionadas negativamente durante 5 min a 200 × g a 4 °C.
    12. Resuspenda los gránulos celulares en 1 ml de tampón de ensayo y cuente el número de celda usando azul tripano manualmente o a través de un contador de celdas automatizado como una Condesa 3.
      NOTA: Siguiendo el enfoque descrito anteriormente, ~ 6 × 106 HSPC de linaje negativo deben purificarse fácilmente de las extremidades posteriores de un solo ratón. Si los reactivos, como el tampón de ensayo, el tampón de enriquecimiento 1x y el cóctel de anticuerpos específicos del linaje, se preparan el día anterior al experimento, se tarda aproximadamente 2,5-3 h en enriquecer los HSPC de 4 ratones. Tomaría 10 minutos adicionales para cada mouse más allá de este número.
  4. Células de siembra en microplacas recubiertas con adhesivo celular (tiempo de paso: ~ 1 h)
    1. Células centrífugas del paso 2.3.12 a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en el medio de ensayo apropiado (medio de prueba de esfuerzo de glucólisis o medio de prueba de esfuerzo mitocondrial). Centrifugar a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Repita el paso 2.4.2. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en el medio de ensayo calentado apropiado a la concentración de 2,5 × 105 células por 50 μL o 5 × 106 por ml.
    4. Pipetear 50 μL de la suspensión celular a lo largo del lado de cada pocillo de la microplaca de cultivo celular de 96 pocillos recubierta con adhesivo celular a temperatura ambiente. Pipetear 50 μL del medio de ensayo en los pozos de medición de fondo de esquina. Utilice una pipeta multicanal para el revestimiento de celdas para garantizar la consistencia.
    5. Cree una placa de equilibrio de centrífuga agregando 50 μL de agua por pozo de una microplaca de cultivo celular de 96 pocillos sin recubrimiento.
    6. Centrifugar las células en la placa a 200 × g durante 1 min a temperatura ambiente. No aplique freno. Transfiera la placa a una incubadora sin CO2 a 37 °C durante 25-30 minutos para asegurarse de que las células se hayan unido por completo. Confirme visualmente bajo un microscopio que las células están adheridas de manera estable a la superficie de la microplaca.
      NOTA: Como se pueden recolectar ~ 6 × 106 HSPC de linaje negativo de las extremidades posteriores de un solo ratón, se necesitan HSPC aislados de 4 ratones (~ 2.4 × 107 células) para llenar una placa completa de 96 pocillos si el objetivo es detectar múltiples intervenciones ex vivo en paralelo. Sin embargo, si el objetivo es investigar el impacto de una alteración genética o una intervención en los parámetros metabólicos de los HSPC in vivo, entonces los HSPC aislados de múltiples pares de ratones de control y prueba se pueden analizar en múltiples réplicas técnicas en paralelo utilizando una sola placa.
  5. Realización de la prueba de esfuerzo de glucólisis utilizando el analizador de flujo extracelular (tiempo de paso: ~ 3 h 30 min)
    1. Cartucho de sensor de carga con compuestos de inyección
      1. Preparar soluciones de glucosa de 100 mM, oligomicina de 20 μM y 2-DG de 500 mM en medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis precalentada (pH 7.4).
        NOTA: Todas las soluciones compuestas inyectables se fabrican a una concentración de 10x. Las concentraciones finales del pozo son de 10 mM para la glucosa, 2 μM para la oligomicina y 50 mM para la 2-DG (ver Tabla 1).
      2. Retire el cartucho del sensor hidratado de la incubadora sin CO2 a 37 °C del paso 1.1.5. Elimine las burbujas de aire del calibrante en la placa de utilidad levantando el cartucho del sensor del calibrante y reemplazándolo en la misma placa de utilidad con el calibrante.
      3. Coloque la guía de carga A/D plana (incluida en el kit de ensayo de flujo extracelular) en la parte superior del cartucho del sensor, orientándola de modo que la letra 'A' se encuentre en la esquina superior izquierda para asegurarse de que solo los puertos A estén disponibles para la carga. Utilizando una pipeta multicanal, dispensar 20 μL de solución de glucosa de 100 mM en los puertos A.
      4. Reemplace la guía de carga A/D plana por la guía de carga B/C plana, orientándose de modo que la letra 'B' se encuentre en la esquina superior izquierda para garantizar que solo los puertos B estén disponibles para la carga. Utilizando una pipeta multicanal, dispensar 22 μL de solución de oligomicina de 20 μM en los puertos B.
      5. Reoriente la guía de carga B/C plana para ubicar la letra 'C' en la esquina superior izquierda para cargar los puertos C. Utilizando una pipeta multicanal, dispense 25 μL de la solución 500 mM 2-DG en los puertos C.
      6. Retire y deseche los planos de la guía de carga.
        NOTA: Es importante que cada serie de puertos de los 96 pozos, incluidos los de los pozos de fondo, se cargue completamente con el mismo volumen del compuesto inyector.
    2. Creación, calibración y mediciones de plantillas
      1. Cree o cargue la plantilla para la prueba de esfuerzo de glucólisis en el controlador. Ingrese detalles sobre estrategias de inyección, condiciones de tratamiento y tipos de células, y presione generar grupos. Vaya al mapa de placas y asigne pozos a cada grupo a analizar. Asigne los 4 pozos de esquina para las mediciones de fondo.
      2. En el protocolo, asegúrese de que la calibración y el equilibrio se comprueban en el paso de inicialización .
      3. Para la medición inicial y las mediciones después de cada inyección (glucosa, oligomicina y 2-DG), establezca el número de ciclos de medición en 3 y Mezclar - Esperar - Medir los tiempos a 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabla 2).
      4. Retire la tapa del cartucho sensor de compuestos cargado e hidratado, sumergido en calibrante en la placa de utilidad. Colóquelo en la bandeja de trabajo del analizador de flujo extracelular y comience la ejecución.
        NOTA: El primer paso es la calibración, que generalmente toma ~ 20 minutos.
      5. Saque la microplaca que contiene las células de la incubadora sin CO2 a 37 °C del paso 2.4.6 después de que finalicen los 25-30 minutos de incubación. Sin perturbar las células, agregue lentamente 130 μL del medio de ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis precalentado (pH 7.4) por pozo para compensar el volumen medio en cada pozo a 180 μL y devuelva la placa a la incubadora sin CO2 37 ° C durante 15-20 min adicionales.
        NOTA: Se prefiere un tiempo total de incubación de 45-60 minutos después de la centrifugación.
      6. Una vez finalizada la calibración, reemplace la placa de utilidad con la microplaca de ensayo (sin tapa) que contiene las celdas. Presione la placa de la célula de carga para iniciar las mediciones, que tomarán ~ 1.5 h para completar el ensayo.
      7. Una vez finalizadas las mediciones, recoja la microplaca de ensayo que contiene las células y retire el medio de ensayo sin perturbar las células. Lavar una vez suavemente con 250 μL de solución salina tamponada con fosfato 1x sin desalojar las células.
      8. Añadir 10 μL de tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na desoxicolato, 0,1% dodecilsulfato de sodio, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), complementado con 1x cóctel inhibidor de la proteasa, a cada pozo y agitar la placa en un agitador durante 10 min. Congelar toda la placa a -80 °C.
      9. Descongele la placa y realice un ensayo de medición de proteínas para la normalización de datos siguiendo las instrucciones del fabricante.
      10. Recupere y analice los datos. Abra el archivo de datos con Wave Desktop Software. Haga clic en Normalizar y pegue los valores de normalización para cada pozo. Haga clic en aplicar para normalizar los datos. Haga clic en Exportar y seleccione el generador de informes de prueba de esfuerzo de glucólisis para exportar los datos analizados a un generador de informes. Como alternativa, exporte los datos a una aplicación externa.
        NOTA: Alternativamente, el contenido total de ADN nuclear en cada pozo se puede utilizar para normalizar los datos. Un colorante fluorescente, como CyQuant que se une al ácido nucleico, se puede utilizar para evaluar el contenido total de ADN nuclear por pozo.
  6. Realización de una prueba de esfuerzo mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular (Tiempo de paso: ~3 h 30 min)
    1. Cartucho de sensor de carga con compuestos de inyección
      1. Preparar soluciones de oligomicina de 20 μM, FCCP de 20 μM y 5 μM de rotenona + 5 μM de antimicina A en un medio de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial precalentado (pH 7.4).
        NOTA: Todas las soluciones compuestas inyectables se fabrican a una concentración de 10x. Las concentraciones finales del pozo son de 2 μM para la oligomicina, 2 μM para la FCCP y 0,5 μM para la rotenona y la antimicina A (ver Tabla 3).
      2. Retire el cartucho del sensor hidratado de la incubadora de 37 °C del paso 1.1.5 y retire las burbujas de aire como se describe anteriormente en el paso 2.5.1.2.
      3. Siguiendo los pasos 2.5.1.3 a 2.5.1.6, dispensar 20 μL de oligomicina de 20 μM en los puertos A, 22 μL de 20 μM fccP en los puertos B y 25 μL de una mezcla de 5 μM de rotenona y 5 μM de antimicina A en los puertos C.
        NOTA: Es importante que cada serie de puertos de los 96 pozos, incluidos los de los pozos de fondo, se cargue completamente con el mismo volumen de compuesto de inyección.
    2. Creación, calibración y mediciones de plantillas
      1. Cree o cargue la plantilla para la prueba de esfuerzo mitocondrial en el controlador. Ingrese detalles sobre estrategias de inyección, condiciones de tratamiento y tipos de células, y presione generar grupos. Vaya al mapa de placas y asigne pozos a cada grupo a analizar. Asigne los 4 pozos de esquina para las mediciones de fondo.
      2. En el protocolo, asegúrese de que la calibración y el equilibrio se comprueban en el paso de inicialización.
      3. Para la medición basal y las mediciones después de cada inyección (oligomicina, FCCP y rotenona + antimicina A), establezca el número de ciclos de medición en 3 y Mezclar - Esperar - Medir los tiempos a 3 min - 0 min - 3 min (ver Tabla 4).
      4. Inicie la ejecución para realizar la calibración como en el paso 2.5.2.4.
      5. Añadir 130 μL del medio de ensayo de ensayo de esfuerzo mitocondrial precalentado (pH 7,4) por pozo y en el paso 2.5.2.5.
      6. Iniciar las mediciones; recuperar y analizar los datos como en los pasos 2.5.2.6 a 2.5.2.10. Exporte los datos analizados al generador de informes de pruebas de esfuerzo mitocondrial o a una aplicación externa.

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Resultados

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Usando este protocolo, el número de células y las concentraciones de varios fármacos dirigidos a OxPHOS (utilizados en los ensayos de flujo extracelular) se optimizaron para medir ECAR y OCR de HSPC aislados de ratones C57BL / 6 hembra de 24 semanas de edad. En primer lugar, se realizó la prueba de esfuerzo de glucólisis para optimizar el número de células y la concentración de oligomicina. En este ensayo se utilizó un número variable de HSPC por pozo que oscilaba entre 5 × 104 y2,5 × 10 5. Como se ...

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Discusión

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Este documento de método describe un protocolo optimizado para la evaluación de la bioenergética celular (glucólisis y OxPHOS) en HSPC de ratón utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse. Este dispositivo es una poderosa herramienta que mide simultáneamente el ECAR y el OCR de las células vivas, que son métricas de glucólisis y respiración mitocondrial, respectivamente. Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la bioenergética celular en tiempo real. Además, la plataforma basada en microplacas de 96 poci...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo en el laboratorio Lombard cuenta con el apoyo de los NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), el DoD (CA190267, CA170628, NF170044 y ME200030) y la Fundación Glenn para la Investigación Médica. El trabajo en el laboratorio Li cuenta con el apoyo de los NIH (NHLBI 5R01HL150707).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.2 μ m filtroCorning430626Se utiliza para filtrar-esterilizar el medio de ensayo
100 mM de piruvato de sodioLife Technologies11360-070Componente del medio de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial
15 mL tubos cónicos FalconCorning352096Se utiliza durante la cosecha de HSPC y para preparar soluciones farmacológicas de ensayo
200 mM L-glutaminaLife Technologies25030-081Componente de la prueba de esfuerzo de glucólisis y el medio de ensayo de prueba de esfuerzo mitocondrial
2-Desoxi-D-glucosa (2-DG)Sigma-AldrichD83753ª inyección de fármaco durante la prueba de esfuerzo de glucólisis
5x Tampón de enriquecimiento (MojoSort)Biolegend480017Se utiliza para lavados durante la cosecha de HSPC
Cloruro de amonio (NH4Cl)Fisher ScientificA661-3Componente de la lisis ACK tampón
Antimicina ASigma-AldrichA86743ª inyección de fármaco durante la prueba de esfuerzo mitocondrial
Kit de ensayo de proteínas Bio-Rad DCBio-Rad500-0112Utilizado según las instrucciones del fabricante
Cianuro-4 de carbonilo (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP)Sigma-AldrichC29202ª inyección de fármaco durante la prueba de esfuerzo mitocondrial
Cell-TakCorning354240Adhesivo de celda. Se utiliza para el recubrimiento de microplacas celulares
Countes 3 Contador de celdas automatizadoThermoFisher ScientificPara el recuento de células
EDTAFisher ScientificO2793-500Componente del tampón de lisis ACK y el tampón de lisis RIPA
Falcon 70 μ m filterFisher Scientific08-771-2Utilizado como filtro de células durante la cosecha de HSPCs
Gibco Fetal bovine serum (FBS)FisherScientific26400044Utilizado para preparar tampón de ensayo durante la cosecha de HSPCs
Gibco HBSSFisher Scientific14175095Utilizado para preparar tampón de ensayo durante la cosecha de HSPC
GlucosaSigma-AldrichG7528Componente de la prueba de esfuerzo mitocondrial medio de ensayo y primera inyección de la prueba de esfuerzo de glucólisis
OligomicinaSigma-AldrichO48762ª inyección de fármaco durante la prueba de esfuerzo de glucólisis y 1ª inyección de fármaco durante la prueba de esfuerzo mitocondrial
PBSLife Technologies10010-049Se utiliza para lavar las células después del ensayo para la cuantificación de proteínas
Bicarbonato de potasio (KHCO3)Fisher ScientificP235-500Componente del tampón de lisis ACK
Cóctel de inhibidores de proteasa (PIC)Roche11836170001Se suministra en forma de comprimidos. Un comprimido se disolvió en 10 mL de tampón RIPA para hacer 1x PIC.
Biotina de rata antiratón-B220, ID de clon: RA3-6B2Biolegend103203Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Biotina de rata antiratón-CD2, ID del clon: RM2-5Biolegend100103Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Biotina de rata antiratón-CD3, ID del clon: 17A2Biolegend100243Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Biotina de rata antiratón-CD5, clon Identificación: 53-7.3Biolegend100603Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Biotina de rata antiratón-CD8, ID del clon: 53-6.7Biolegend100703Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Biotina de rata antiratón-Gr-1, ID del clon: RB6-8C5Biolegend108403Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Biotina de rata antiratón-Ter-119, ID del clon: TER-119Biolegend116203Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
RotenonaSigma-AldrichR88753ª inyección de fármaco durante la prueba de esfuerzo mitocondrial
Seahorse XFe96 analizador de flujo extracelularSeahorse Biosciences ahora AgilentPara mediciones ECAR y OCR en tiempo real.
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761Se utiliza para fabricar una solución adhesiva de células para el recubrimiento de microplacas
Cloruro de sodio (NaCl)FisherBP358Componente del tampón de lisis RIPA
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750Componente del tampón de lisis RIPA
Fluoruro de sodio (NaF)Sigma-AldrichS7920Componente del tampón de lisis RIPA
Hidróxido de sodio (NaOH)Sigma-AldrichS8045Solución preparada 1 N. Utilizado para la normalización del pH
Nanoperlas de estreptavidina (MojoSort)Biolegend480015Se utiliza para el agotamiento del linaje durante la cosecha de HSPC
Tris-HClFisherBP153Componente del tampón de lisis RIPA
Medio base XF Medio baseAgilent102353-100utilizado para preparar la prueba de esfuerzo de glucólisis y la prueba de esfuerzo mitocondrial Medios de ensayo
Estación de preparación XF Caballitomar BiocienciasUtilizado para productos no CO2 37 ° C incubaciones
XFe96 extracelular FluxPakAgilent102416-100 o 102601-100Incluye cartuchos de ensayo con placas utilitarias, planos de guía de carga para cargar fármacos
en el cartucho de ensayo, solución de calibrante XF y microplaca de cultivo celular XF
de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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