Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Surinder Kumar; Morgan Jones; Qing Li; David B. Lombard

doi:10.3791/63045

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Artículo de método

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

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DOI:

10.3791/63045

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24 de septiembre de 2021

Surinder Kumar¹ , Morgan Jones² , Qing Li²^,³^,⁴ , David B. Lombard¹^,⁴^,⁵

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

En este artículo

Resumen

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Resumen

Bajo estado estacionario, las células madre hematopoyéticas (HSC) permanecen en gran medida inactivas y se cree que dependen predominantemente de la glucólisis para satisfacer sus necesidades energéticas. Sin embargo, en condiciones de estrés como la infección o la pérdida de sangre, las HSC se vuelven proliferativas y producen rápidamente células progenitoras aguas abajo, que a su vez se diferencian aún más, produciendo en última instancia células sanguíneas maduras. Durante este proceso de transición y diferenciación, las HSC salen de la inactividad y se someten rápidamente a un cambio metabólico de la glucólisis a la fosforilación oxidativa (OxPHOS). Varias condiciones de estrés, como el envejecimiento, el cáncer, la diabetes y la obesidad, pueden afectar negativamente la función mitocondrial y, por lo tanto, pueden alterar la reprogramación metabólica y la diferenciación de las HSC y los progenitores durante la hematopoyesis. Se pueden obtener información valiosa sobre las funciones glucolíticas y mitocondriales de las HSC y los progenitores en condiciones normales y de estrés a través de la evaluación de su tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR), que son indicadores de la glucólisis celular y la respiración mitocondrial, respectivamente.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado para medir ECAR y OCR en poblaciones de células negativas de linaje derivadas de la médula ósea de ratón, que incluyen células madre hematopoyéticas y células progenitoras primitivas (HSPC), utilizando el analizador de flujo extracelular. Este protocolo describe enfoques para aislar células de linaje negativo de la médula ósea de ratón, explica la optimización de la densidad de siembra celular y las concentraciones de 2-desoxi-D-glucosa (2-DG, un análogo de glucosa que inhibe la glucólisis) y varios medicamentos dirigidos a OxPHOS (oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A) utilizados en estos ensayos, y describe las estrategias de tratamiento farmacológico. Los parámetros clave del flujo glicolítico, como la glucólisis, la capacidad glucolítica y la reserva glucolítica, y los parámetros de OxPHOS, como la respiración basal, la respiración máxima, la fuga de protones, la producción de ATP, la capacidad respiratoria excedente y la eficiencia de acoplamiento, se pueden medir en estos ensayos. Este protocolo permite mediciones de ECAR y OCR en HSPC no adherentes y se puede generalizar para optimizar las condiciones de análisis para cualquier tipo de células de suspensión.

Introducción

La hematopoyesis es el proceso por el cual se forman varios tipos de células sanguíneas maduras con funciones altamente especializadas a partir de HSCs¹. Las HSC son capaces de autorrenovarse y diferenciarse en varias poblaciones progenitoras multipotentes y específicas del linaje. Estos progenitores finalmente producen células de linajes linfoides, mieloides, eritroides y megacariocitarios. Para mantener su capacidad de autorrenovación, las HSC permanecen en gran medida inactivas y, al igual que otras células madre tisulares, se cree que dependen de la glucólisis en lugar de OxPHOS mitocondrial para la producción de ATP....