Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تشريح المقطع المبرد للمنطقة تحت البطانية للبالغين من أجل تحليل دقيق وعميق للبروتيوم الكمي

Published: October 7, 2021 doi: 10.3791/63047
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,2,4
1Division of Physiological Genomics, Biomedical Center, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, 3SYNERGY, Excellence Cluster Systems Neurology, University of Munich, 4Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet

Summary

يسمح تشريح المقطع بالتبريد بإعداد طازج ومجمد لأكبر مكان عصبي المنشأ في دماغ الفئران لتحليل البروتيوم الكمي العميق. هذه الطريقة دقيقة وفعالة وتسبب الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة. لذلك ، فهي مناسبة بشكل مثالي لدراسة البيئة الدقيقة الجزيئية لهذا المكان ، وكذلك الأعضاء والمناطق والأنواع الأخرى.

Abstract

يتكون الكوة العصبية تحت البطينية من شريط شبه بطيني لجدار البطين الجانبي للبطين الجانبي. المنطقة تحت البطانية (SEZ) هي منطقة رقيقة ومتميزة تتعرض للبطينين والسائل الدماغي الشوكي. يسمح عزل هذا المكان بتحليل البيئة الدقيقة للخلايا الجذعية العصبية. ومع ذلك ، فإن استخراج الأنسجة الصغيرة لتحليل البروتيوم يمثل تحديا ، خاصة بالنسبة للحفاظ على عمق قياس كبير وتحقيق متانة موثوقة. تم تطوير طريقة جديدة تسمى تشريح المقطع بالتبريد (CSD) ، تجمع بين الدقة العالية والحد الأدنى من اضطراب الأنسجة ، لمواجهة هذه التحديات. تتوافق هذه الطريقة مع أحدث طرق قياس الطيف الكتلي (MS) التي تسمح بالكشف عن منظمات متخصصة منخفضة الوفرة. قارنت هذه الدراسة CSD وبيانات البروتيوم الخاصة به بالطريقة والبيانات التي تم الحصول عليها عن طريق التشريح المجهري للالتقاط بالليزر (LCM) والتشريح القياسي للمالف الكامل. أسفرت طريقة CSD عن ضعف عمق القياس الكمي في أقل من نصف وقت التحضير مقارنة ب LCM وفي الوقت نفسه تفوقت بوضوح على دقة التشريح للتشريح الكامل. وبالتالي ، فإن CSD هي طريقة متفوقة لجمع المنطقة الاقتصادية الخاصة لتحليل البروتينات.

Introduction

نظرا لأن تكوين الخلايا العصبية مقيد في دماغ البالغين ، فإن استراتيجيات إصلاح الجهاز العصبي المركزي المختلفة ستستفيد بشكل كبير من زيادة فهم أسس الاستبدال العصبي للبالغين. لقد ساعدتنا القوارض على فهم الآليات الأساسية لتكوين الخلايا العصبية بعد الولادة ، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أن تكوين الخلايا العصبية لدى البالغين يعتمد إلى حد كبير على الأنواع. في الفئران ، هناك ثلاثة منافذ للخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSC). ما تحت المهاد هو مكان NSC للبالغين مع إمكانات عصبية1,2 ، في حين أن التكوين العصبي المستمر للبالغين يقتصر بشكل أساسي على الحصين3 والمنطقة الاقتصادية الخاصة للجدران الجانبية للبطينين الجانبيين4,5,6. المنطقة الاقتصادية الخاصة هي أكبر منطقة جرثومية تحتوي على NSCs (خلايا النوع B) التي تتطور إلى خلايا عصبية (خلايا من النوع A) عبر الخلايا السلفية المضخمة العابرة (خلايا النوع C). تحتوي المنطقة الاقتصادية الخاصة على 20-35٪ من خلايا النوع B ، و 1-15٪ من خلايا النوع C ، و 1-30٪ من خلايا النوع A ، و 25-50٪ من الخلايا البطانية7. تتميز المنطقة الاقتصادية الخاصة ببنية دقيقة معقدة ، مع خلايا بطانية ، وخلايا دبقية صغيرة ، وخلايا إبانديمالية تعيش في مكانة الخلايا الجذعية وتؤثر عليها8،9،10. على الرغم من ندرة الخلايا العصبية في المنطقة الاقتصادية الخاصة، إلا أن المحاور العصبية المنبثقة من مصادر بعيدة مثل المخطط أو منطقة التيجمنتال البطني أو ما تحت المهاد تصل إلى الخلايا البائية وتؤثر عليها4. ميزة فريدة من نوعها لهذا المكان المناسب للخلايا الجذعية هي الفصل بين موقع الانتشار وموقع التمايز. بعد الانتشار ، تهاجر السلف العصبية عدة ملليمترات من المنطقة الاقتصادية الخاصة إلى المصباح الشمي ، حيث تتمايز بشكل نهائي إلى خلايا عصبية وتندمج في الدوائر العصبية الموجودة مسبقا. وقد وفرت التحقيقات في البرامج الجوهرية للخلايا المرتبطة بتكوين الخلايا العصبية بالفعل معرفة مهمة لإعادة برمجة الخلايا العلاجية التجريبية واستراتيجيات زرعها15،16،17،18،19،20. ومع ذلك ، فإن الإشارات الخارجية للخلايا تنظم أيضا تكوين الخلايا العصبية ، ويمكن لبيئات الأنسجة تحديد المصير العصبي للخلايا الجذعية11،12،14،21،22،23. وبالتالي ، فإن التحقيق في البيئة الدقيقة للمنافذ العصبية وتفاعلها مع الخلايا الجذعية له أهمية حاسمة.

المصفوفة خارج الخلية (ECM) وغيرها من البروتينات المفرزة هي جزء كبير من البيئة الدقيقة. من أجل التحديد الدقيق والقياس الكمي ، فإن النهج البروتيني هو الأنسب من النهج النسخي لتحديد تكوين ECM بسبب الارتباط المنخفض بين النسخ ومستويات البروتين ل ECM24,25. علاوة على ذلك ، هناك أدلة كبيرة على أن المنظمين المتخصصين في المنطقة الاقتصادية الخاصة لا يتم إنتاجهم حصريا بواسطة الخلايا التي تملأ المكان نفسه. تفرز المواقع البعيدة، مثل الضفيرة المشيمية، إشارات تعديلية تنتقل إلى الخلايا الجذعية عبر السائل الدماغي الشوكي22,23. يمكن أن يساعد التحقيق في البروتيوم المتخصص في تحديد المنظمين المتخصصين الموجودين في المكانة بشكل مستقل عن موقع إنتاجهم ، بالنظر إلى أن نسبة كبيرة من البيئة الدقيقة خارج الخلية يتم تجميعها بواسطة البروتينات.

لجمع منطقة البطين الفئراني للتحليل البروتيني غير المتحيز ، هناك حاجة إلى طريقة ذات دقة عالية ، لالتقاط الشريط شبه البطيني الرقيق حوالي 50 ميكرومتر الذي يحتوي على خلايا جذعية مع استبعاد أنسجة المخطط المجاور. علاوة على ذلك ، يجب تقليل اضطراب الأنسجة أثناء التشريح إلى الحد الأدنى لتحليل البيئة الدقيقة خارج الخلية لأن البروتينات القابلة للذوبان ، بما في ذلك عوامل النمو أو السيتوكينات ، يمكن غسلها بسهولة. على الرغم من أنه من الممكن تحليل أطياف الكتلة للأنسجة الثابتة ، إلا أن العامل المطلوب ، مثل paraformaldehyde ، سيقلل من عمق تحديد البروتين وقد يدخل تعديلات ما بعد الترجمة. تشريح المنطقة الاقتصادية الخاصة الكامل الشائع ، على سبيل المثال ، لجمع الخلايا لتحليل فرز الخلايا المنشط بالفلور ، يزيل المنطقة الاقتصادية الخاصة بأكملها بالمقص26. هذا التشريح القياسي سريع مع الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة. ومع ذلك ، لا يمكن تجنب التلوث الخطي للعينات. على العكس من ذلك ، تتمتع LCM بميزة رائعة تتمثل في دقة التشريح الفائقة. ومع ذلك ، قد يؤدي LCM إلى اضطرابات في الأنسجة ، على سبيل المثال ، بسبب تلطيخ الخلفية أو تمسخ البروتين الناجم عن الليزر. للجمع بين نقاط القوة في تشريح الجبل الكامل و LCM ، تم تطوير طريقة جديدة متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد ، تسمى تشريح المقطع البارد (CSD) ، (الشكل 1A-D). يسمح CSD باستخراج المنطقة الاقتصادية الخاصة وتشريح المنطقة الاقتصادية الخاصة للجدران الإنسية للبطينين الجانبيين (MEZ) ، وهي منطقة تحكم مثالية ، معظمها غير عصبية المنشأ للمنطقة الاقتصادية الخاصة (انظر البروتوكول). أثبت البروتيوم المتخصص الذي تم الحصول عليه من خلال الجمع بين CSD وأحدث طرق MS أنه مفيد لتوصيف وتحديد المنظمين الجدد في هذا المجال NSC البالغ25. وبالتالي ، ستكون هذه الطريقة مفيدة لتحديد تكوين بروتين أنسجة المنطقة الاقتصادية الخاصة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية والاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية وحكومة بافاريا العليا (Regierung von Oberbayern). تم استخدام ذكور الفئران C57Bl6 فقط الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع في التجارب.

1. إعداد دماغ الفأر (~ 15 دقيقة لكل فأر)

  1. قم بإعداد وسط التشريح بإضافة 5 مل من 1 M HEPES (التركيز النهائي 10 mM) إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS).
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز وقت تخزين وسط التشريح (+4 درجة مئوية) 2 أسابيع.
  2. التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم وتشريح الدماغ بعناية.
    ملاحظة: عند التحقيق في ECM ، يفضل أن يكون النسيج غير معدل. يحافظ خلع عنق الرحم على وقت التشريح قصيرا قدر الإمكان ، وبالتالي يمنع الهضم الذاتي الأنزيمي بعد الموت قدر الإمكان. إذا كانت إزالة الدم أمرا بالغ الأهمية لسؤال البحث ، فما عليك سوى فحص الفأر عبر القلب مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قبل إزالة الدماغ.
  3. استخراج الدماغ عن طريق التشريح اليدوي ووضعه في طبق استزراع يحتوي على وسط تشريح بارد (الشكل 1B - 1).
    ملاحظة: حافظ على الأدمغة في وسط التشريح على الجليد طوال عملية التشريح.
  4. قم بإزالة المصباح الشمي (OB) باستخدام مشرط (الشكل 1B - 2) عن طريق قطع إكليلي مستقيم بين OB والقطب الأمامي للقشرة.
  5. قم بإزالة القطب الأمامي للقشرة باستخدام المشرط باستخدام قطع إكليلي لجعل البطينين الجانبيين مرئيين في المستوى الإكليلي (الشكل 1B - 3).
    ملاحظة: تأكد من أن القطع الإكليلي مصنوع ~ 5 مم من الغشاء البصري؛ خلاف ذلك ، سيتم فقدان الجزء العلوي من المنطقة الاقتصادية الخاصة / MEZ.
  6. باستخدام المقص ، افتح كلا البطينين الجانبيين من الأعلى ، بدءا من قسم سهمي من السطح القشري إلى تجويف البطين ، وقم بإطالة هذا القطع بطريقة على شكل حرف C بعد انثناء البطين (الشكل 1B - 4).
  7. قم بتوصيل الأطراف الذيلية للشق السهمي الأيسر والأيمن عن طريق قطع إكليلي إضافي بالمقص.
    ملاحظة: تشكل الجروح الثلاثة الآن شبه منحرف وستسهل إزالة القشرة والجسم الثفني في الخطوة التالية.
  8. قم بإزالة القشرة والجسم الثفني الذي يغطي البطينين الجانبيين باستخدام الملقط (الشكل 1B - 5). ثم قم بإزالة القشرة والجسم الثفني اللذين يغطيان جدران البطين الإنسي. هنا ، قم بإجراء جروح إضافية إذا كان النسيج متصلا بجدران البطين الإنسي ، أو ببساطة ارفع القشرة والجسم الثفني بالمقص لإزاحة الأنسجة.
  9. انشر بعناية جدران البطين باستخدام الملقط (الشكل 1B - 6). إزالة الضفيرة المشيمية مع الملقط.
    ملاحظة: من المهم الإزالة الكاملة للضفيرة المشيمية لتجنب التداخل مع خطوات التشريح التالية وتجنب التلوث المحتمل لعينات المنطقة الاقتصادية الخاصة / MEZ.
  10. ضع الدماغ على شريحة زجاجية وضع الشريحة الزجاجية فوق الثلج الجاف لتجميد الدماغ. الحفاظ على جدران البطين في التكوين المفتوح.
    ملاحظة: تأكد من وجود مسافة كافية بين الجدران الجانبية والإنسية للبطين لتسهيل التشريح الدقيق والحصري للمنطقة الاقتصادية الخاصة ومنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا. إذا انقبض النسيج مرة أخرى في تكوين مغلق ، فاستخدم الملقط لإصلاح الجدران في الموضع المطلوب أثناء التجميد. تجنب أي ضرر يلحق بالمنطقة الاقتصادية الخاصة / المنطقة الاقتصادية الخاصة. حاول تطبيق الحد الأدنى من القوة، خاصة عند الحافة العليا للبطينين المفتوحين.

2. تقسيم الدماغ المحضر (~ 15 دقيقة لكل فأر)

  1. قطع 50-100 ميكرومتر من أقسام إكليلية سميكة من الدماغ حتى نهاية البطين الجانبي باستخدام cryostat وتركيب الأقسام على شرائح زجاجية. تأكد من أن الدماغ متصل بلوحة التعلق cryostat في الدماغ الخلفي مع وسط OCT وأنه لا يوجد OCT يتلامس مع الدماغ الأمامي ، وخاصة في البطينين.
    ملاحظة: سوف يتداخل وسيط OCT مع قياسات التصلب المتعدد. ومع ذلك ، إذا كان سيتم استخدام الأنسجة لفحص الأجسام المضادة ، فمن غير الضروري استبعاد وسط OCT. لا ينصح باستخدام الشرائح الزجاجية المطلية. تطبق الشرائح المطلية الكثير من القوة اللاصقة على الأنسجة ، مما يعوق نقل عينة الأنسجة من الشرائح إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق في الخطوات التالية.

3. تشريح حر لشرائح الدماغ (~ 30 دقيقة لكل فأر)

  1. ضع الشرائح الزجاجية مع أقسام الدماغ على الجليد الجاف تحت مجهر التشريح (الشكل 1C - 1).
  2. قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الثلج الجاف ، وتأكد من بقاء الأنابيب على الثلج الجاف لمدة 1 دقيقة على الأقل لتكون باردة بما فيه الكفاية قبل نقل العينة.
    ملاحظة: استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الجودة العالية، لأن بعض الأنابيب منخفضة الجودة قد تلقي بالبلاستيك في خطوات هضم الأنسجة اللاحقة المرتبطة بقياسات التصلب المتعدد.
  3. ارفع الشرائح من الثلج الجاف لمدة 15-30 ثانية لتحقيق ذوبان قصير وغير مكتمل لجعل المايلين المضغوط للمخطط قابلا للملاحظة كنقاط بيضاء كثيفة.
    ملاحظة: يصبح تحديد الحدود بين المنطقة الاقتصادية الخاصة والمخطط ممكنا (الشكل 1C - 2 ، انظر الشكل 2A لاستبعاد المايلين ومقارنة مع طريقة الجبل بأكمله). إذا استغرق الذوبان وقتا طويلا ، فيمكن تسريع العملية عن طريق الضغط على إصبع مغطى بالقفازات على الجانب الآخر من الشريحة الزجاجية. ومع ذلك ، يجب ممارسة هذه المناورة لأن الذوبان المفرط يحدث بسهولة.
  4. افصل المنطقة الاقتصادية الخاصة بمشرط مبرد مسبقا عن المخطط المجاور (الشكل 1C ، D).
  5. انقل المنطقة الاقتصادية الخاصة إما كقطعة كاملة أو مقسمة إلى 2-4 أجزاء في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام الحافة الحادة للمشرط المبرد. إذا كان من المقرر استخدام النسيج لنوع آخر من التحليل بخلاف التصلب المتعدد، فانقل عينة الأنسجة إلى الحاوية المناسبة بدلا من ذلك (على سبيل المثال، صفيحة 96 بئرا).
    ملاحظة: قد يؤدي قطع الأنسجة المجمدة تماما إلى تفكك الأنسجة بسرعة وسقوطها من الشريحة. قطع الأنسجة المذابة تماما يؤدي إلى تفكك الأنسجة. تأكد من أن الأنسجة ليست مجمدة تماما ولا مذابة تماما.

Representative Results

عند اتباع الخطوات المذكورة أعلاه، تكون عينات الأنسجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق جاهزة ومتوافقة مع إعداد عينة التصلب المتعدد. بعد إعداد العينة ، حصلنا على ~ 5-7 ميكروغرام من الببتيدات لكل عينة من المنطقة الاقتصادية الخاصة أو MEZ لكل فأر. ومع ذلك ، قد تعتمد الكميات النهائية من الببتيدات على طريقة تحضير MS. في مقارنات البروتيوم أدناه، تمت زيادة تحديد البروتين وعمق القياس الكمي (500-1000 بروتين لكل عينة) عن طريق المطابقة الحسابية لأطياف الببتيد مع مكتبات أطياف الببتيد التي تم إنشاؤها لكل منطقة نسيج25,27. والجدير بالذكر أن طريقة تجزئة النانو الأقل خسارة المستخدمة هنا لإنشاء مكتبات أطياف الببتيد غير متاحة تجاريا حاليا. تم تحليل بيانات MS الخام باستخدام برنامج MaxQuant28 ، مما حقق دقة كتلة في نطاق الأجزاء لكل مليار29. تسمح بيئة Max Quant بالمطابقة بين عمليات تشغيل MS. تم تحديد وفرة البروتين كميا باستخدام خوارزمية قياس كمي خالية من الملصقات30. تم إجراء تلطيخ كيميائي نسيجي مناعي على الأنسجة المجمدة الطازجة وأجريت كما تم الإبلاغ عنه سابقا25 (انظر جدول المواد).

تشريح المقطع بالتبريد
تم الحصول على المنطقة الاقتصادية الخاصة الكاملة و MEZ للفئران البالغة (n = 4) باستخدام CSD (انظر الشكل 1 والبروتوكول). تم تشريح القشرة الحسية الجسدية (Cx) بمقص جراحي. تم تشريح 4 فئران إضافية بنفس الطريقة. ومع ذلك، تم تجميع الأنسجة المشوهة في عينة واحدة لكل منطقة لإنشاء مكتبة البروتيوم (10,923 بروتينا محددا) لزيادة تحديد البروتين وتحديده كميا في العينات الفردية25. في العينات الفردية الأربعة، (متوسط ± SD) تم تحديد كمية 6,673 ± 317.4 بروتين في المنطقة الاقتصادية الخاصة و 6,747 ± 37.7 في المنطقة الاقتصادية الخاصة. تم إيداع جميع بيانات البروتينات MS في اتحاد ProteomeXchange عبر مستودع شركاء PRIDE31 ، ورقم الانضمام للبروتينات المبلغ عنها هنا هو ProteomeXchange: PXD016632 (http://proteomecentral.proteomexchange.org).

مقارنة مع تشريح كامل الجبل
تم إجراء تشريح Wholemount وفقا لبروتوكول قياسي26. كشف تشريح Wholemount عن عدد مماثل من البروتينات (حوالي 6000 لمنطقة SEZ و 6000 ل Cx ، n = 4 لكل مجموعة) مقارنة ب CSD25. أحد التحسينات المقصودة لاستخدام CSD للمنطقة الاقتصادية الخاصة ، بدلا من بروتوكول تشريح كامل ، هو الحد من التلوث المخططي المحتمل. في عينات المنطقة الاقتصادية الخاصة الملوثة بأنسجة من منطقة أخرى، لا يمكن تخصيص البروتينات المرشحة المكتشفة لمنطقة ما لأن التخصيب الكبير يمكن أن ينتج عن المنطقة ذات الأهمية والملوث. من الناحية المناعية الكيميائية، تم تحديد الكبسولات الداخلية الإيجابية الغنية بالمايلين (MAG) المرتبطة بالمايلين (MAG) في عينات الجبل الكامل ولكن نادرا ما تم تحديدها في عينات CSD (الشكل 2A). ويمكن تأكيد التلوث الخطي في عينات الجبل الكامل عن طريق تحديد إثراء بروتينات المايلين في المنطقة الاقتصادية الخاصة مقارنة بعينات القشرة الحسية الجسدية (Cx) المادة الرمادية (GM) (الشكل 2 باء). لاحظ أن أجزاء كبيرة من Cx GM ، وخاصة طبقات Cx العليا ، غير نخاعية32.

نظرا لأن حزم الألياف الكبيرة تمر عبر المخطط ، فقد أدى التلوث بهذه المنطقة إلى إثراء بروتينات المايلين مقارنة ب Cx. كانت بروتينات المايلين المستخدمة كعلامات للتلوث المخططي في عينات المنطقة الاقتصادية الخاصة هي بروتين المايلين الأساسي (MBP) ، والبروتين السكري المرتبط بالمايلين (MAG) ، وبروتين البروتيوليبيد 1 (Plp1) ، و 2',3'-حلقي-نيوكليوتيد 3'-فوسفوديستراز (Cnp). تم إثراء جميع بروتينات علامة المايلين بشكل كبير في المنطقة الاقتصادية الخاصة مقارنة ب Cx. على العكس من ذلك ، لم تسفر المقارنات بين بروتينات علامة المايلين الأربعة في مجموعة بيانات CSD عن اختلافات كبيرة عند مقارنة المنطقة الاقتصادية الخاصة ب Cx (الشكل 2B). تدعم البيانات البروتينية للمخطط33 الفرضية القائلة بأن إثراء بروتينات المايلين في عينات المنطقة الاقتصادية الخاصة للتشريح الكامل كان بسبب التلوث بالأنسجة المخططة. وبالتالي ، فإن CSD منعت إلى حد كبير التلوث بالأنسجة المخططة (الغنية بالمايلين المضغوط) مقارنة بالتشريح الكامل.

يمكن أن يكشف تحليل البروتيوم غير المتحيز للأنسجة غير المنفصلة عن بروتينات خارج الخلية مثيرة للاهتمام. مع تحسين التشريح باستخدام CSD ، تم إثراء البروتينات المرتبطة خارج الخلية بشكل كبير في العينات مقارنة بالعينات الكاملة (الشكل 2C ، اختبار إثراء التعليق التوضيحي). يعرض CSD والتشريح الكامل إثراء مماثلا لمصطلحات الأنطولوجيا الجينية (GO) "exosome الحويصلية خارج الخلية" و "جزء المنطقة خارج الخلية". ومع ذلك ، فإن مصطلح GO "المرتبط بالأمة" أكثر ثراء قليلا في CSD منه في التشريح الكامل. وبناء على ذلك ، تم العثور على إنزيم ECM المتقاطع ومنظم تكوين الخلايا العصبية transglutaminase-2 (Tgm2) المخصب في المنطقة الاقتصادية الخاصة مقارنة ب Cx باستخدام CSD25. وعلى النقيض من ذلك، لم يعثر على أي فرق بين عينات المنطقة الاقتصادية الخاصة وعينات Cx التي تم الحصول عليها عن طريق تشريح الجبل الكامل (الشكل 2D). تدعم البيانات البروتينية للمخطط33 الفرضية القائلة بأن الكشف عن منظم تكوين الخلايا العصبية Tgm2 عن طريق التشريح الكامل قد أعيقه التلوث بالأنسجة المخططة. وبالتالي ، بشكل عام ، يعد تشريح المقطع المبرد تحسينا ناجحا ولكنه ضروري أيضا للتشريح القياسي لتحليل البروتيوم الخاص بالمتخصصة.

مقارنة مع الفحص المجهري للالتقاط بالليزر
تم الحصول على النصف الأمامي من المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ من 3 فئران بالغة ل LCM (الشكل 3A ). بشكل عام ، تظهر طريقة LCM بعض العيوب ، خاصة فيما يتعلق باضطراب الأنسجة وكفاءتها. لتصور المنطقة ذات الأهمية تحت مجهر التشريح ، يعد تلطيخ الخلفية ضروريا ، مما قد يؤدي إلى غسل البروتينات الصغيرة أو القابلة للذوبان ذات الأهمية ، على سبيل المثال ، عوامل النمو أو السيتوكينات أو منظمات ECM مثل الإنزيمات. علاوة على ذلك ، تقضي الشرائح أوقاتا متفاوتة في درجة حرارة الغرفة أثناء الإزالة بالليزر. علاوة على ذلك ، قد يؤدي الليزر نفسه إلى تشويه البروتينات ذات الاهتمام.

تتمتع CSD بميزة كبيرة على LCM فيما يتعلق بالوقت والجهد اللازمين لإجراء التشريح: يجب تنفيذ الخطوة 1 من البروتوكول بالمثل لكل من CSD و LCM ؛ بدون هذه الخطوة ، تظل جدران البطين ملتصقة ، مما يجعل فصل عينات MEZ و SEZ أمرا صعبا. بالنظر إلى أن أقسام CSD (100 ميكرومتر) أكثر سمكا ب 6-7 مرات من الحد الأقصى للسمك34 من أقسام LCM (15 ميكرومتر) ، فإن الخطوة 2 (تقسيم الدماغ) والخطوة 3 (إزالة MEZ و SEZ من كل قسم إكليلي) ستستغرق ما لا يقل عن 6-7 مرات أطول ل LCM. سوف يستهلك تلطيخ الخلفية الضروري وإعداد مجهر الليزر وقتا إضافيا. هنا ، استغرق الأمر ثلاث مرات أطول لحصاد 50 ٪ من المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ من 3 بواسطة LCM مقارنة ب 100 ٪ من المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ من 4 بواسطة CSD ، مما يشكل ميزة سرعة ثمانية أضعاف CSD. باختصار ، لا يتطلب LCM قدرا ملحوظا من الجهد الإضافي فحسب ، بل يخضع النسيج أيضا لفترة أطول بكثير من التلاعب وتغيرات درجة الحرارة التي يمكن أن تعرض للخطر ديناميكيات وموثوقية البيانات الناتجة عن التحليل اللاحق.

تمت مقارنة نتائج MS من CSD مع نتائج التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM). تمت مطابقة كلتا مجموعتي البيانات مع المكتبة البروتينية التي تم إنشاؤها عن طريق تجميع عينات CSD. في المتوسط، أنتجت LCM 3,441 ± 270.0 و 3,613 ± 238.7 بروتين فردي في المنطقة الاقتصادية الخاصة والبطين الإنسي، على التوالي (الشكل 3B). ونظرا للاختلاف الملحوظ في تحديد البروتين، أظهر تحليل المكون الرئيسي (PCA) فصلا متميزا وفقا لطريقة التشريح (المكون 1: 62.7٪، غير معروض). وأظهر المكون 2 أكبر فصل للمنطقة الاقتصادية الخاصة ومنطقة ميز بين عينات LCM (8.5٪، الشكل 3C). ويبدو أيضا أن المكون 3 يفصل بين LCM و CSD؛ ومع ذلك ، قد ينتج هذا الاختلاف عن الاختلافات القائمة على الطريقة بدلا من عدد البروتينات المحددة (6.4٪). ومع ذلك، ظل الفصل الإقليمي العام متميزا بشكل لافت للنظر بالنسبة لبيانات التشريح بالتبريد وأفضل بكثير من LCM. قد ينتج هذا التباين في ديناميكيات البيانات عن أوقات مختلفة تقضيها العينات في درجة حرارة الغرفة أثناء تشريح الليزر أو أن قابلية أعلى للأنسجة الصغيرة تصل إلى التباين في بروتوكولات البروتينات اللاحقة وقياسات قياس الطيف الكتلي.

للبحث عن الاختلافات في ملف تعريف البروتين ل ECM ، تم إجراء اختبار إثراء التعليق التوضيحي 2D بين CSD و LCM للمنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ (الشكل 3D). يسمح حساب الإثراء النسبي لشروط GO بين عينات LCM و CSD بمقارنة ديناميكيات البروتيوم النسبية لمجموعات بروتين ECM بين الطريقتين على الرغم من عدم تساوي كمية الأنسجة والاختلافات في بروتوكول التشريح. تكشف المؤامرات عن وجود علاقة جيدة بين LCM و CSD. يتم إثراء التعليقات التوضيحية "جزء المنطقة خارج الخلية" و "العضية المرتبطة بالغشاء خارج الخلية" بالمثل في كل من الطرق والمناطق. وبالتالي ، لا يبدو أن الطلب المتزايد على الوقت من LCM يتم تعويضه بحساسية أعلى نسبيا للبروتينات المرتبطة ب ECM. بدلا من ذلك ، توفر CSD تحديدا / قياسا كميا أكثر قوة عند مقارنة بيانات العينة لتكوين الخلايا العصبية وبروتينات ECM المرتبطة بالمنطقة الاقتصادية الخاصة Tgm2 و Thrombospondin-4 (Thbs4) و S100a6 و Tenacin-C (Tnc) (الشكل 3E). وفي حالة TnC، وعلى الرغم من تحديدها كميا في جميع العينات، فإن لجنة التنمية المستدامة هي الوحيدة التي أظهرت إثراء للمنطقة الاقتصادية الخاصة مقارنة بالمنطقة الاقتصادية الخالصة. ومع ذلك ، فإن بروتينات الغشاء القاعدي المرتبطة بالمنطقة الاقتصادية الخاصة Nidogen-1 (Nid1) ، والوحدة الفرعية Laminin beta-2 (Lamb2) ، والبروتين الأساسي لكبريتات الهيبارانية الخاصة بالغشاء السفلي (Hspg2)35 أظهرت إثراءا أكثر قوة في المنطقة الاقتصادية الخاصة (مقارنة ب MEZ) في عينات LCM مقارنة بعينات CSD (غير معروضة). وبالتالي ، يمكن أن توفر CSD عينات من الأنسجة التي توفر بروتينا كميا دقيقا وعميقا لتوصيف المنطقة الاقتصادية الخاصة في إطار زمني معقول ، دون القلق بشأن سلامة الأنسجة المعرضة للخطر أو فقدان البروتين.

الاحصاءات
تم إجراء الاختبارات الإحصائية واختبارات إثراء التعليقات التوضيحية 2D و PCA في بيئة Perseus. تم تضمين البروتينات في التحليل إذا تم اكتشاف قيمة صالحة لكل طريقة في عينة واحدة على الأقل. تم تصور وفرة البروتين ومقارنات الأرقام باستخدام برنامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد). تم استخدام التحكم القائم على التباديل لمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) (تم تعيين FDR إلى 0.05 ، 250 عشوائيا) لمقارنات البروتين. بالنسبة لاختبارات إثراء التعليقات التوضيحية ثنائية الأبعاد36، يتم إثراء مصطلحات GO المعروضة بشكل كبير (تم تعيين FDR إلى 0.02 باستخدام طريقة التحكم في Benjamini-Hochberg FDR).

Figure 1
الشكل 1: طريقة تشريح المقطع المبرد. (أ) نظرة عامة على المنطقة موضع الاهتمام: البطين الجانبي مع المنطقة الاقتصادية الخاصة العصبية المنشأ و MEZ غير العصبية المنشأ. الأرومات العصبية الملطخة بالمناعة مع Dcx. (B) الإزالة التدريجية ل OB ، القطب الأمامي ، القشرة ، والجسم الثفني فوق البطينين والضفيرة المشيمية: 1. التنسيب في وسط التشريح ، 2. إزالة OB ، 3. إزالة القطب الأمامي للقشرة ، 4. الشقوق السهمية في الجزء العلوي البطيني ، 5. إزالة الجزء العلوي البطيني ، 6. انتشار جدران البطين. (ج) 100 ميكرومتر شرائح إكليلية من دماغ الفأر الطازج المجمد ، (1)قبل و (2.) بعد إزالة جدران البطين بمشرط بارد مثلج. قضبان المقياس = 4 مم (D) تلطيخ قسم إكليلي من البطين الجانبي (GFAP: أخضر; DAPI: أزرق) ، تظهر المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ تشريحها باستخدام CSD. أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر (A) ، 200 ميكرومتر (D). الاختصارات: CSD = تشريح المقطع البارد. المنطقة الاقتصادية الخاصة = المنطقة تحت البطانية; MEZ = المنطقة البطانية الإنسية; Dcx = دبل كورتين; OB = لمبة الشم. GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: دقة تشريح فائقة مع تشريح المقطع المبرد مقارنة بالتشريح الكامل. (أ) صورة كيميائية نسيجية مناعية لعينة المنطقة الاقتصادية الخاصة التي تم الحصول عليها عن طريق تشريح كامل الجبل (يسار). يتم تصور إدراج الأنسجة المخططية الغنية بالمايلين عن طريق تلطيخ ضد MAG (الأخضر).. تلطيخ المنطقة الاقتصادية الخاصة تشريح مع CSD (يمين). في CSD ، يتم استبعاد جميع المايلين المخطط تقريبا (تلطيخ ضد MAG ، الأخضر) من شريط العينة. تم تصور النوى باستخدام DAPI (أزرق). (ب) مقارنة إثراء علامة المايلين في المنطقة الاقتصادية الخاصة مقابل Cx من الجبل الكامل (MBP: p = 0.0074; MAG: p = 0.0016; Plp1: p = 0.0011 ; CNP: p = 0.0029) و CSD (MBP: p = 0.0667; MAG: p = 0.0236; Plp1: p = 0.3420 ; CNP: p = 0.1842). (ج) اختبار إثراء التعليق التوضيحي 2D الذي يقارن بين المنطقة الاقتصادية الخاصة بكامل الجبال وعينات CSD-SEZ. يتم إثراء مصطلحات GO خارج الخلية والماتريسوم المرتبط بها في بيانات CSD أكثر من البيانات الكاملة. (د) وفرة البروتين من منظم NSC Tgm225 رسمت لتشريح الجبل كله و CSD. يتم إثراء Tgm2 بشكل كبير في المنطقة الاقتصادية الخاصة مقارنة ب Cx في CSD (CSD: p = 0.0029; جبل كامل: p = 0.1775). بالنسبة ل B و D: كمرجع ، تم رسم بيانات البروتيوم من Sharma et al.33 مع قياسات المخطط والقشرة للبروتينات المقابلة المعروضة في عينات CSD و CSD. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (A). الاختصارات: CSD = تشريح المقطع البارد. المنطقة الاقتصادية الخاصة = المنطقة تحت البطانية; MAG = البروتين السكري المرتبط بالمايلين; Cx = القشرة الحسية الجسدية; MBP = بروتين المايلين الأساسي; Plp1 = بروتين بروتيوليبيد 1 ؛ CNP = 2',3'-دوري-نيوكليوتيد 3'-فوسفوديستراز; GO = أنطولوجيا الجينات; NSC = الخلايا الجذعية العصبية; Tgm2 = tranglutaminase 2 ؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; LFQ = كمية خالية من الملصقات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تحسين قياس البروتين خارج الخلية مع تشريح المقطع المبرد مقارنة ب LCM. (أ) تلطيخ كريسيل البنفسجي للبطين الجانبي قبل وبعد التقاط الليزر للمنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ (يسار). للمقارنة ، شق CSD من المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ (يمين). أشرطة المقياس = 150 ميكرومتر (B) مقارنة بين عدد البروتينات المكتشفة في عينات المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ من CSD و LCM. ± (ج) تحليل المكون الرئيسي لعينات المنطقة الاقتصادية الخاصة والمناطق الاقتصادية الخاصة (MEZ) مقارنة بين CSD و LCM (المكون 2: 8.5٪ من التباين ؛ المكون 3: 6.4٪). (د) إثراء التعليق التوضيحي 2D لقسم التبريد والليزر MEZ (أعلى) والمنطقة الاقتصادية الخاصة (أسفل). يتم إثراء مصطلحات GO العضية خارج الخلية وجزء المنطقة خارج الخلية بشكل كبير (النقاط الحمراء). (هاء) وفرة البروتينات الواصمة خارج الخلية المرتبطة بالمنطقة الاقتصادية الخاصة في المنطقة الاقتصادية الخاصة ومنطقة ميز بالنسبة للآلية المتوسطة والمتوسطة الحجم (TNC: p = 0.3789) وعينات لجنة التنمية المستدامة (Tgm2: p = 0.2940؛ S100a6: p = 0.0218 ; THBS4: p = 0.3941; Tnc: p = 0.0004). الاختصارات: CSD = تشريح المقطع البارد. LCM = الليزر التقاط التشريح المجهري; المنطقة الاقتصادية الخاصة = المنطقة تحت البطانية; MEZ = المنطقة البطانية الإنسية; GO = أنطولوجيا الجينات; Tnc = Tenacin-C; Tgm2 = ترانسغلوتاميناز 2 ; S100a6 = S100 بروتين ملزم للكالسيوم A6 ؛ THBS4 = ثرومبوسبوندين-4; LFQ = كمية خالية من الملصقات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

جعلت طريقة CSD من الممكن استخراج أنسجة المنطقة الاقتصادية الخاصة بدقة وتوليد بروتين موثوق به بعمق كبير باستخدام MS. CSD يعرض ميزة واضحة مقارنة بالتشريح الكامل من حيث تقليل التلوث الخطي لعينات المنطقة الاقتصادية الخاصة بشكل كبير وإثراء البروتين خارج الخلية. نظرا لأنه من الممكن أيضا اكتشاف عدد مماثل من البروتينات في العينات الفردية (~ 6500 بروتين لكل عينة) باستخدام CSD والتشريح الكامل ، فإن الوقت الإضافي ل CSD يستحق الجهد. يوفر LCM تشريحا أكثر دقة للمنطقة الاقتصادية الخاصة ولكنه وصل إلى عمق بروتين أقل ، مع 3500 بروتين فقط لكل عينة على الرغم من استخدام نفس بروتوكول MS مثل CSD (مطابقة المكتبة والقياس الكمي الخالي من الملصقات). الأهم من ذلك ، كان التباين أكبر بكثير ، ربما بسبب وقت التحضير الأطول ثمانية أضعاف لكل عينة. يكشف PCA للعينات التي تم الحصول عليها بواسطة LCM و CSD عن فصل واضح لكلتا الطريقتين مع مجموعات ضيقة خاصة بالمنطقة منفصلة بقوة عن بعضها البعض. وعلى النقيض من ذلك، أظهرت عينات LCM توزيعا أكثر تشتتا، وهو ما يرجع على الأرجح جزئيا إلى طول فترة التحضير. ومن غير الواضح ما إذا كان جمع عينات أكثر بكثير على مدى فترة أطول من شأنه أن يسفر عن بروتين متساو في المتانة والعمق مع LCM. بحساب التقدير ، فإن جمع حجم عينة مماثل كما هو الحال بالنسبة ل CSD سيستغرق 5-8 مرات أطول مع LCM ، وحتى ما يصل إلى 15 مرة أطول إذا تم تضمين العينات المقدمة لمكتبات أطياف الببتيد ، والكثير منها في ظل ظروف مذابة. علاوة على ذلك ، بالنظر إلى الاضطرابات الإضافية للأنسجة اللازمة ل LCM (تلطيخ الخلفية ، تشريح الليزر) ، قدمت LCM القليل من المكاسب ، إن وجدت ، على CSD. وبالتالي ، يمكن اعتبار CSD أكثر ملاءمة لأبحاث البروتيوم خارج الخلية ، وتحديدا للمنطقة الاقتصادية الخاصة.

ومن الجدير بالذكر أنه إذا كانت المنطقة موضع الاهتمام أصغر من المنطقة الاقتصادية الخاصة (على سبيل المثال، التحقيق فقط في طبقة الخلايا البطانية)، فإن النهج الحر يتخلف عن دقة LCM. على سبيل المثال ، من الصعب استخدام CSD لفصل الطبقة البطانية عن الطبقة تحت البطانية لأن الطبقة البطانية ليست سوى قطر خلية عريض ، وترسيم الحدود نحو الطبقة تحت البطانية غير مرئي للعين المجردة في الأنسجة المجمدة الطازجة. وبالتالي ، سيكون LCM خيارا أفضل من CSD إذا كان التشريح الدقيق على مقياس أقل من 50 ميكرومتر أكثر أهمية من الأنسجة غير المضطربة أو الحفاظ على وقت التشريح قصيرا. بالنسبة للمناطق التي يبلغ عرضها 50 ميكرومتر وأكثر ، فإن دقة CSD قابلة للمقارنة مع دقة LCM لتحليل بروتين ECM.

لقد أثبتت CSD بالفعل أنها مفيدة من خلال المساهمة في التحقيق في الدور الوظيفي ل ECM في المجال العصبي25. وبالتالي ، فإن التطبيق المستمر ل CSD في المنطقة الاقتصادية الخاصة لمختلف تحقيقات البروتين والبروتيوم (أو حتى تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة) قد يؤدي إلى الكشف عن المزيد من منظمات تكوين الخلايا العصبية ، وعلامات تنشيط الخلايا الجذعية ، وفهم أعمق لفسيولوجيا الخلايا الجذعية المتخصصة في المنطقة الاقتصادية الخاصة. بالنظر إلى انخفاض تكوين الخلايا العصبية في SEZ37 المسنة ، فإن تحليلا موجزا لتغيرات ECM في المنطقة الاقتصادية الخاصة بالفئران المسنة مقابل الفئران الصغيرة قد يعزز فهم الآليات المتخصصة الدقيقة التي تعزز تطوير NSC وصيانته38,39. علاوة على ذلك ، فإن تأثير الالتهاب والإصابة على تكوين الخلايا العصبية في المنطقة الاقتصادية الخاصة راسخ بشكل جيد40،41،42،43. إن إثراء الفيبرينوجين المشتق من الدم في المنطقة الاقتصادية الخاصة بعد إصابة الدماغ القشرية وتأثيره على تكوين الخلايا الدبقية الفلكية في المنطقة الاقتصادية الخاصة وتكوين الندبات44 يسلط الضوء على التأثير المحتمل للتغيرات الدقيقة الناجمة عن الصدمة على فسيولوجيا الخلايا الجذعية في المنطقة الاقتصادية الخاصة. وبالتالي ، فإن التحقيق في بروتين SEZ-ECM بالاقتران مع إصابة الدماغ باستخدام CSD يمكن أن يساعد في توضيح الآليات التي تؤثر بها الإصابة والالتهاب على تكوين الخلايا العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضا على منافذ الدماغ البشري العصبية في الصحة والمرض حيث يمكن في كثير من الأحيان الحصول على الأنسجة المجمدة الطازجة من العمليات الجراحية. علاوة على ذلك ، نظرا للاختلافات في الأنواع في تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، سيكون من الرائع أيضا تطبيق طريقة CSD على الأنواع الأخرى ، على سبيل المثال ، بالاقتران مع تكوين الخلايا العصبية المخططية. علاوة على ذلك ، مع طرق الكشف عن البروتين الأخرى ، يمكن التحقيق في الاختلافات في عوامل النمو المنتجة محليا بدقة وكفاءة باستخدام CSD للمنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ (على سبيل المثال ، ELISA).

وأخيرا، يمكن تعديل إجراء التشريح من أجل الاستخراج الدقيق لمناطق الدماغ الأخرى، وكذلك للأسئلة البحثية التي لا تتعلق بتكوين الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، يتضمن CSD خطوة قصيرة شبه ذوبان ، حيث يكون المايلين المضغوط مرئيا كمناطق بيضاء متميزة عن أنسجة المخ المتبقية الأكثر شفافية. مع تعديل بسيط للطريقة ، ستسمح هذه الميزة بالتشريح الدقيق لأنسجة المايلين المدمجة في الجسم الثفني فقط ، والتي يمكن أن تخضع لتحليل بروتيني للتغيرات المرتبطة بالإصابة. اقتراح بتعديل البروتوكول الذي من شأنه أن يسمح بتشريح الجسم القاسي هو حذف الخطوات 1.5-1.9 من البروتوكول والمضي مباشرة في إعداد الأقسام الإكليلية بدلا من فتح البطينين لجعل المنطقة الاقتصادية الخاصة و MEZ في متناول اليد. ثم ، ضع الأقسام على الثلج الجاف ، وارفع الشرائح لفترة وجيزة وشبه إذابتها ، وقم ببساطة بإزالة الجسم الثفني بمشرط. يجب أن يكون هذا التحضير جاهزا الآن لأي تحليل يتطلب تشريحا فعالا لأنسجة الجسم الثفني الأصلية.

باختصار ، تقدم هذه الدراسة طريقة تشريح دقيق يمكن استخدامها لتحليل البروتيوم المتخصص العصبي البطيني الموثوق. وتؤكد البيانات على توافق وفائدة طريقة لجنة التنمية المستدامة جنبا إلى جنب مع التحليل البروتيني القائم على التصلب المتعدد للبيئة الدقيقة للمنطقة الاقتصادية الخاصة. إن الجمع بين الدقة والكفاءة والحد الأدنى من اضطراب الأنسجة يجعل CSD امتدادا قيما للطرق الحالية.

Disclosures

يعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة

Acknowledgments

نود أن نشكر بصدق ماتياس مان على السماح لنا بإجراء أجزاء كبيرة من التجارب في مختبره ، وفابيان كوسكيا للمساعدة في تحليل LCM والبروتيوم ، وتاتيانا سيمون إيبرت على تشريح كامل الجبل ، و Korbinian Mayr و Igor Paron على مساعدتهم التقنية. نحن نقدر بامتنان التمويل المقدم من مجلس الأبحاث الألماني إلى MG (SFB870 ، TFR274) ، والاتحاد الأوروبي (Eranet S-700982-5008-001) ، و ERC (aERC "NeuroCentro" إلى MG) ، والجمعية السويدية للبحوث الطبية (SSMF ، إلى JK) منحة ما بعد الدكتوراه ، ومؤسسات وصناديق KI (2020-01351 ، إلى JK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryostat CM3050S Leica
Dissecting microscope Leica
Dumont no. 5SF forceps, Inox super fine tip Fine Science Tools cat. no. 11252-00
Hank’s Balanced Salt Solution with CaCl2 and MgCl2 Invitrogen cat. no. 24020
HEPES buffer solution (1 M) Invitrogen cat. no. 15630
Microscope slides RS France cat. no. BPB018
Safe-lock tubes, PCR clean 2.0 mL Eppendorf cat. no. 0030123344
Spring scissors, Vannas-Tubingen 5 mm Fine Science Tools cat. no. 15003-08
Surgical disposable scalpels B. Braun cat. no. 5518083
Tissue culture dishes 60 mm Greiner Bio-One cat. no. 633180
Antibodies
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 555) (1/1,000) ThermoFisher Scientific cat. no. A-11001
DAPI Sigma cat. no. D9542
guinea pig polyclonal anti-DCX 1:500 Millipore cat. no. AB2253,
mouse monoclonal anti-GFAP 1:500 Sigma cat. no. G3893
mouse monoclonal anti-MAG 1:400 Millipore cat. no. MAB1567
Software
GraphPad Prism version 9 GraphPad Software, San Diego California USA www.graphpad.com
Perseus Version 1.6.10.50 Max-Planck Institute for Biochemistry, Munich Bavaria Germany https://maxquant.net/perseus/
ZEN imaging software Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodman, T., Hajihosseini, M. K. Hypothalamic tanycytes-masters and servants of metabolic, neuroendocrine, and neurogenic functions. Frontiers in Neuroscience. 9, 387 (2015).
  2. Chaker, Z., et al. Hypothalamic neurogenesis persists in the aging brain and is controlled by energy-sensing IGF-I pathway. Neurobiology of Aging. 41, 64-72 (2016).
  3. Kuhn, H. G., Toda, T., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis: a coming-of-age story. Journal of Neuroscience. 38 (49), 10401-10410 (2018).
  4. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  5. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  6. Bordiuk, O. L., Smith, K., Morin, P. J., Semënov, M. V. Cell proliferation and neurogenesis in adult mouse brain. PloS One. 9 (11), 111453 (2014).
  7. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. Journal of Neuroscience. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  8. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The adult ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and olfactory bulb (OB) neurogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), 018820 (2016).
  9. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63 (8), 1394-1405 (2015).
  10. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  11. Sirko, S., et al. Chondroitin sulfates are required for fibroblast growth factor-2-dependent proliferation and maintenance in neural stem cells and for epidermal growth factor-dependent migration of their progeny. Stem Cells. 28 (4), 775-787 (2010).
  12. Mercier, F. Fractones: extracellular matrix niche controlling stem cell fate and growth factor activity in the brain in health and disease. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (24), 4661-4674 (2016).
  13. Mercier, F., Kitasako, J. T., Hatton, G. I. Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. Journal of Comparative Neurology. 451 (2), 170-188 (2002).
  14. Nascimento, M. A., Sorokin, L., Coelho-Sampaio, T. Fractone bulbs derive from ependymal cells and their laminin composition influence the stem cell niche in the subventricular zone. Journal of Neuroscience. 38 (16), 3880-3889 (2018).
  15. Chen, G., et al. In vivo reprogramming for brain and spinal cord repair. eNeuro. 2 (5), 0106-0115 (2015).
  16. Zhang, Q., Chen, W., Tan, S., Lin, T. Stem cells for modeling and therapy of Parkinson's disease. Human Gene Therapy. 28 (1), 85-98 (2017).
  17. Wei, C., Xiong, S., Cheng, L. Reprogramming of fibroblasts to neural stem cells by a chemical cocktail. Methods in Molecular Biology. 2117, 265-270 (2020).
  18. Tian, Z., Zhao, Q., Biswas, S., Deng, W. Methods of reactivation and reprogramming of neural stem cells for neural repair. Methods. 133, 3-20 (2018).
  19. Heinrich, C., et al. Sox2-mediated conversion of NG2 glia into induced neurons in the injured adult cerebral cortex. Stem Cell Reports. 3 (6), 1000-1014 (2014).
  20. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  21. Seidenfaden, R., Desoeuvre, A., Bosio, A., Virard, I., Cremer, H. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (1-2), 187-198 (2006).
  22. Lepko, T., et al. Choroid plexus-derived miR-204 regulates the number of quiescent neural stem cells in the adult brain. EMBO Journal. 38 (17), 100481 (2019).
  23. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  24. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nature Communications. 10 (1), 963 (2019).
  25. Kjell, J., et al. Defining the adult neural stem cell niche proteome identifies key regulators of adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 26 (2), 277-293 (2020).
  26. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), e1938 (2010).
  27. Kulak, N. A., Geyer, P. E., Mann, M. Loss-less nano-fractionator for high sensitivity, high coverage proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 16 (4), 694-705 (2017).
  28. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  29. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  30. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  31. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47 (1), 442-450 (2019).
  32. Tomassy, G. S., et al. Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex. Science. 344 (6181), 319-324 (2014).
  33. Sharma, K., et al. Cell type- and brain region-resolved mouse brain proteome. Nature Neuroscience. 18 (12), 1819-1831 (2015).
  34. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  35. Kerever, A., et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu. Stem Cells. 25 (9), 2146-2157 (2007).
  36. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  37. Daynac, M., Morizur, L., Chicheportiche, A., Mouthon, M. -A., Boussin, F. D. Age-related neurogenesis decline in the subventricular zone is associated with specific cell cycle regulation changes in activated neural stem cells. Scientific Reports. 6, 21505 (2016).
  38. Navarro Negredo, P., Yeo, R. W., Brunet, A. Aging and rejuvenation of neural stem cells and their niches. Cell Stem Cell. 27 (2), 202-223 (2020).
  39. Smith, L. K., White, C. W., Villeda, S. A. The systemic environment: at the interface of aging and adult neurogenesis. Cell and Tissue Research. 371 (1), 105-113 (2018).
  40. Neuberger, E. J., Swietek, B., Corrubia, L., Prasanna, A., Santhakumar, V. Enhanced dentate neurogenesis after brain injury undermines long-term neurogenic potential and promotes seizure susceptibility. Stem Cell Reports. 9 (3), 972-984 (2017).
  41. Fisch, U., Brégère, C., Geier, F., Chicha, L., Guzman, R. Neonatal hypoxia-ischemia in rat elicits a region-specific neurotrophic response in SVZ microglia. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 26 (2020).
  42. Götz, M., Sirko, S., Beckers, J., Irmler, M. Reactive astrocytes as neural stem or progenitor cells: In vivo lineage, In vitro potential, and Genome-wide expression analysis. Glia. 63 (8), 1452-1468 (2015).
  43. Kernie, S. G., Parent, J. M. Forebrain neurogenesis after focal Ischemic and traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 37 (2), 267-274 (2010).
  44. Pous, L., et al. Fibrinogen induces neural stem cell differentiation into astrocytes in the subventricular zone via BMP signaling. Nature Communications. 11 (1), 630 (2020).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 176 ،
تشريح المقطع المبرد للمنطقة تحت البطانية للبالغين من أجل تحليل دقيق وعميق للبروتيوم الكمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Friess, C., Götz, M., Kjell, J. … More

Friess, C., Götz, M., Kjell, J. Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63047, doi:10.3791/63047 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter