La extracción de moléculas de glucógeno hepático para la determinación de la estructura del glucógeno

Resumen

Se determinó una concentración óptima de sacarosa para la extracción de glucógeno hepático mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La adición de un paso de ebullición de 10 minutos para inhibir las enzimas que degradan el glucógeno resultó beneficiosa.

Resumen

El glucógeno hepático es un polímero de glucosa hiperramificado que interviene en el mantenimiento de los niveles de azúcar en sangre en los animales. Las propiedades del glucógeno están influenciadas por su estructura. Por lo tanto, un método de extracción adecuado que aísle muestras representativas de glucógeno es crucial para el estudio de esta macromolécula. En comparación con otros métodos de extracción, un método que emplea un paso de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa puede minimizar el daño molecular. Basándose en este método, una publicación reciente describe cómo se varió la densidad de la solución de sacarosa utilizada durante la centrifugación (30%, 50%, 72,5%) para encontrar la concentración más adecuada para extraer partículas de glucógeno de una amplia variedad de tamaños, limitando la pérdida de partículas más pequeñas. Se introdujo un paso de ebullición de 10 minutos para probar su capacidad para desnaturalizar las enzimas que degradan el glucógeno, preservando así el glucógeno. Se demostró que la concentración más baja de sacarosa (30%) y la adición de la etapa de ebullición extraen las muestras más representativas de glucógeno.

Introducción

El glucógeno es un polímero complejo e hiperramificado de glucosa que se encuentra en animales, hongos^{y bacterias}. En los mamíferos, el glucógeno hepático funciona como un amortiguador de glucosa en sangre, preservando la homeostasis, mientras que el glucógeno muscular actúa como un reservorio de glucosa a corto plazo para proporcionar energía directamente². La estructura del glucógeno a menudo se describe por tres niveles (que se muestran en la Figura 1): 1. Las cadenas lineales están formadas por monómeros de glucosa a través de enlaces glucosídicos (1→4)-α, con puntos de ramificación cone....

Protocolo

Los hígados de ratón utilizados para optimizar este procedimiento,²¹ eran de 12 ratones machos de fondo BKS-DB/Nju (7,2 semanas de edad, véase la Tabla de Materiales). El uso de animales fue aprobado por el Comité de Ética y Cuidado de Animales del Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tejidos animales

1. Pesar el hígado de ratón (1-1,8 g de hígado entero de cada ratón).
2. Congele rápidamente el hígado de ratón en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.

2. Preparación de tampón y reactivos

1. Prepare un tamp....

Resultados

Si bien el procedimiento descrito anteriormente es para el método más óptimo (sacarosa al 30% con la adición de un paso de ebullición de 10 minutos), aquí se proporcionan datos para el glucógeno extraído a través de tres concentraciones de sacarosa (30%, 50%, 72,5%), con y sin paso de ebullición, como se describió anteriormente²¹. Siguiendo el protocolo, la pureza, el rendimiento bruto y el rendimiento de glucógeno seco extraído en diferentes condiciones se dan en la Tabla 1, repr.......

Discusión

Estudios previos han demostrado que la estructura del glucógeno es importante por sus propiedades; Por ejemplo, el tamaño molecular afecta la tasa de degradación del glucógeno¹⁰, y la distribución de la longitud de la cadena afecta su solubilidad²⁶. Para comprender correctamente estas relaciones, es importante extraer el glucógeno con un procedimiento que aísle, en la medida de lo posible, una muestra representativa y no dañada. Los métodos tradicionales de extracción utili.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
8-aminopireno-1,3,6-trisulfonato (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	solución 0,1 M
Ácido acético	SIGMA Aldrich	695092	0,1 M, solución de pH 3,5
Sistema Agilent 1260 Infinity SEC	Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU		Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
BKS-DB/Nju ratones de fondo	Nanjing Institución de Investigación Biomédica de la Universidad de Nanjing
Kit de ensayo de D-glucosa (formato GOPOD)	Megazyme	K-GLUC
Ácido etilenedinitrilotetraacético (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogeneizador	IKA	T 25
Ácido clorhídrico	SIGMA Aldrich	2104	Solución 0,1 M
Ácido clorhídrico	SIGMA Aldrich	2104	solución 0,1 M
Sistema P/ACE MDQ plus	Ab Sciex, EE. UU.		Electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)
Detector de índice de refracción	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Bárbara, CA, EE. UU.)		Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
Acetato de sodio	SIGMA Aldrich	241245	solución de 1 M, pH 4,5
Azida de sodio	SIGMA Aldrich	S2002
Cloruro de sodio	SIGMA Aldrich	S9888
Cianoborohidruro de sodio	SIGMA Aldrich	156159	solución 1 M
Fluoruro de sodio	SIGMA Aldrich	201154
Hidróxido de sodio	SIGMA Aldrich	43617	solución 0,1 M
Nitrato de sodio	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Pirofosfato de sodio	SIGMA Aldrich	221368
sacarosa	SIGMA Aldrich	V90016
SUPREMA precolumna, 1.000 y 10.000 columnas	Polymer Standards Services, Mainz, Alemania		Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Tubos ultracentrífugos Beckman			4 mL, tubo ultratransparente de pared delgada abierto, 11 x 60 mm

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