Ensayo de uracilo-ADN glicosilasa mediante desorción láser asistida por matriz/análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo

Hui-Lan Chang; Kang-Yi Su; Steven D. Goodman; Wern-Cherng Cheng; Liang-In Lin; Ya-Chien Yang; Sui-Yuan Chang; Woei-horng Fang

doi:10.3791/63089

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Artículo de método

Ensayo de uracilo-ADN glicosilasa mediante desorción láser asistida por matriz/análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo

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DOI:

10.3791/63089

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22 de abril de 2022

Hui-Lan Chang^*¹ , Kang-Yi Su^*¹^,² , Steven D. Goodman³ , Wern-Cherng Cheng² , Liang-In Lin¹^,² , Ya-Chien Yang¹^,² , Sui-Yuan Chang¹^,² , Woei-horng Fang¹^,²

¹Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, ²Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, ³Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se desarrolló un método no radioisotópico no marcado para evaluar la actividad de la uracilo-ADN glicosilasa utilizando la espectrometría de masas MALDI-TOF para el análisis directo de productos que contienen sitios apurínicos/apirimidínicos. El ensayo demostró ser bastante simple, específico, rápido y fácil de usar para la medición de la GLICosilasa de ADN.

Resumen

La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) es un componente clave en la vía de reparación de la escisión de base para la corrección del uracilo formado por la desaminación hidrolítica de la citosina. Por lo tanto, es crucial para el mantenimiento de la integridad del genoma. Se desarrolló un método altamente específico, no etiquetado, no radioisotópico para medir la actividad de UDG. Un dúplex de ADN sintético que contenía un uracilo específico del sitio fue escindido por UDG y luego sometido a un análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistido por láser / ionización asistido por matrix (MALDI-TOF MS). Se estableció un protocolo para preservar el producto del sitio apurínico/apirimidínico (AP) en el ADN sin rotura de hebra. El cambio en el valor m/z del sustrato al producto se utilizó para evaluar la hidrólisis de uracilo por UDG. Se utilizó un sustrato G:U para el análisis cinético UDG que arrojó el Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s y Kcat = 9.31 ^s-1. La aplicación de este método a un ensayo de inhibidor de la uraciloglicosasa (UGI) arrojó un valor de _IC50 de 7,6 pM. La especificidad de UDG utilizando uracilo en varias posiciones dentro de sustratos de ADN de cadena simple y doble cadena demostró diferentes eficiencias de escisión. Por lo tanto, este método SIMPLE, rápido y versátil MALDI-TOF MS podría ser un excelente método de referencia para varias glucosilasas de ADN monofuncionales. También tiene el potencial como una herramienta para la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.

Introducción

Aunque el uracilo es una base normal en el ARN, es una lesión común y altamente mutagénica en el ADN genómico. El uracilo puede surgir de la desaminación hidrolítica espontánea/enzimática de una desoxicitidina. En cada célula viva, esta desaminación ocurre 100-500 veces al día en condiciones ^{fisiológicas1,2}. Si estas alteraciones no se reparan, puede haber un cambio en la composición de la secuencia de ADN, causando mutación. Como el uracilo en el ADN prefiere emparejarse con dATP durante la replicación, si la citosina se desamina a uracilo, en dos eventos de replicación, habrá una nueva mutación de transición....