Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

Summary

Aquí, describimos un protocolo para crear organoides cardíacos humanos (hHO) relevantes para el desarrollo de manera eficiente utilizando células madre pluripotentes humanas por autoorganización. El protocolo se basa en la activación secuencial de señales de desarrollo y produce tejidos cardíacos humanos altamente complejos y funcionalmente relevantes.

Abstract

La capacidad de estudiar el desarrollo cardíaco humano en la salud y la enfermedad está muy limitada por la capacidad de modelar la complejidad del corazón humano in vitro. El desarrollo de plataformas similares a órganos más eficientes que puedan modelar fenotipos complejos in vivo , como organoides y órganos en un chip, mejorará la capacidad de estudiar el desarrollo y la enfermedad del corazón humano. Este artículo describe un protocolo para generar organoides cardíacos humanos (hHO) altamente complejos mediante la autoorganización utilizando células madre pluripotentes humanas y la activación gradual de la vía de desarrollo utilizando inhibidores de moléculas pequeñas. Los cuerpos embrionarios (EB) se generan en una placa de 96 pocillos con pocillos de fijación ultra bajos de fondo redondo, lo que facilita el cultivo en suspensión de construcciones individualizadas.

Los EB se diferencian en hHO mediante una estrategia de modulación de señalización Wnt de tres pasos, que implica una activación inicial de la vía Wnt para inducir el destino del mesodermo cardíaco, un segundo paso de inhibición Wnt para crear linajes cardíacos definitivos y un tercer paso de activación Wnt para inducir tejidos de órganos proepicárdicos. Estos pasos, llevados a cabo en un formato de 96 pocillos, son altamente eficientes, reproducibles y producen grandes cantidades de organoides por tirada. El análisis por imágenes de inmunofluorescencia del día 3 al día 11 de la diferenciación revela especificaciones del primer y segundo campo cardíaco y tejidos altamente complejos dentro de hHOs en el día 15, incluido el tejido miocárdico con regiones de cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como cámaras internas revestidas con tejido endocárdico. Los organoides también exhiben una intrincada red vascular en toda la estructura y un revestimiento externo de tejido epicárdico. Desde un punto de vista funcional, los hHO superan con fuerza y presentan una actividad normal del calcio según lo determinado por las imágenes en vivo de Fluo-4. En general, este protocolo constituye una plataforma sólida para estudios in vitro en tejidos cardíacos similares a órganos humanos.

Introduction

Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos y afectan aproximadamente al 1% de todos los nacidos ^vivos1,2,3. En la mayoría de las circunstancias, las razones de los CHD siguen siendo desconocidas. La capacidad de crear modelos de corazón humano en el laboratorio que se asemejan mucho al corazón humano en desarrollo constituye un importante paso adelante para estudiar directamente las causas subyacentes de las enfermedades coronarias en humanos en lugar de en modelos animales sustitutos.

El....

Protocol

1. Cultura y mantenimiento de hPSC

NOTA: Las PSC inducidas por humanos (hiPSC) o las células madre embrionarias humanas (hESC) deben cultivarse durante al menos 2 pasajes consecutivos después de la descongelación antes de ser utilizadas para generar EB para la diferenciación o la criopreservación adicional. Las hPSC se cultivan en medio PSC (consulte la Tabla de materiales) en placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas de matriz extracelular de membrana basal (BM-ECM). Al realizar cambios de medio en hPSCs en placas de 6 pocillos, agregue el medio directamente al lado interno del pozo en lugar de directamente en la parte sup....

Results

Para lograr la hHO autoorganizada in vitro, modificamos y combinamos los protocolos de diferenciación previamente descritos para la diferenciación monocapa 2D de ^{cardiomiocitos21} y células epicárdicas22 utilizando moduladores de la vía Wnt y para organoides precardíacos ^3D16 utilizando los factores de crecimiento BMP4 y Activina A. Utilizando el protocolo de diferenciación EB y hHO de placa de 96 pocillos descrito aquí y mostrado en

Discussion

Los recientes avances en cardiomiocitos derivados de células madre humanas y otras células de origen cardíaco se han utilizado para modelar el desarrollo del corazón ^{humano22,24,25} y la ^{enfermedad26,27,28} y como herramientas para detectar ^{terapias29,30} y agentes

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpos
Alexa Fluor 488 Burro anti-ratón	Invitrogen	A-21202	1:200
Alexa Fluor 488 Burro anti-conejo	Invitrogen	A-21206	1:200
Alexa Fluor 594 Burro anti-ratón	Invitrogen	A-21203	1:200
Alexa Fluor 594 Burro anti-conejo	Invitrogen	A-21207	1:200
Alexa Fluor 647 Burro anticabra	Invitrogen	A32849	1:200
HAND1	Abcam	ab196622	Conejo; 1:200
HAND2	Abcam	ab200040	Conejo; 1:200
NFAT2	Abcam	ab25916	Conejo; 1:100
PECAM1	DSHB	P2B1	Conejo; 1:50
TNNT2	Abcam	ab8295	Ratón; 1:200
THY1	Abcam	ab133350	Conejo; 1:200
TJP1	Invitrogen	PA5-19090	Cabra; 1:250
VIM	Abcam	ab11256	Cabra; 1:250
WT1	Abcam	ab89901	Conejo; 1:200
Medios y reactivos
Accutase	Innovative Cell Technologies	NC9464543	reactivo de disociación celular
Activin A	R& D Systems	338AC010
B-27 Suplemento (sin insulina)	Gibco	A1895601	suplemento de cultivo celular sin insulina
B-27 Suplemento	Gibco	17504-044 suplemento para	cultivo celular
BMP-4	Gibco	PHC9534
Albúmina sérica bovina	Bioworld	50253966
CHIR-99021	Selleck	442310
D-(-)-Fructosa	Millipore Sigma	F0127
DAPI	Thermo Scientific	62248	1:1000
Dimetilsulfóxido	Millipore Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	10566016
Essential 8 Flex Medium Kit	Gibco	A2858501	medio de células madre pluripotentes (PSC) que contiene 1% penicilina-estreptomicina
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201
Glicerol	Millipore Sigma	G5516
Glicina	Millipore Sigma 410225
Matrigel GFR	Corning	CB40230	Matriz extracelular de membrana basal (BM-ECM)
Suero de burro normal	Millipore Sigma	S30-100mL
Paraformaldehído	MP Biomedicals		IC15014601 Polvo disuelto en tampón PBS – uso al 4%
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122
tampón de fosfato	Gibco	10010049
Solución tampón de fosfato (10x)	Gibco	70011044
Microesferas de poliperlas Polysciences	, Inc.	73155	90 y micro; m
ReLeSR	Stem Cell Technologies	NC0729236	reactivo de disociación para hPSCs
RPMI 1640	Gibco	11875093
Thiazovivin	Millipore Sigma	SML1045
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Solución Azul de Trypan	Gibco	1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Medio de montaje	Vector Laboratories	H170010
WNT-C59	Selleck	NC0710557
Otros
tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher Scientific	02682002
15 mL Tubos Falcon Fisher	Scientific	1495970C
Viales criogénicos de 2 mL	Corning	13-700-500
Depósitos de reactivos de 50	mL Fisherbrand	13681502
Placas de cultivo celular de fondo plano de 6 pocillos	Corning	0720083
8 Vidrio de cubierta con cámara de pozo # 1.5 Vidrio de cobertura de alto rendimiento	Cellvis	C8-1.5H-N
Microplacas de fijación ultra baja transparentes de 96 pocillos	Costar	07201680
ImageJ	NIH		Image software de procesamiento
	Kimwipes Kimberly-Clark Professional	06-666	toallitas de laboratorio
Micro Cover Glass	VWR	48393-241	24 x 50 mm Nº 1.5
Portaobjetos de microscopio	Fisherbrand	1255015
Moxi Cell Counter	Orflo Technologies	MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Tipo M	Orflo  Tecnologías	MXC001
Pipetas multicanal	Fisherbrand	FBE1200300	30-300 µ L
Olympus cellVivo	Olympus		Para Caclium Imagen, análisis con Imagej
Centrífuga Sorvall Legend X1 ThermoFisher	Scientific	75004261
	ThermoFisher Scientific	13-687-717
Top Coat Nail Varish	Seche Vite		Se puede comprar en cualquier supermercado