Kit de herramientas de código abierto: Matriz de microelectrodos de fibra de carbono de sobremesa para grabación nerviosa

Gran parte de la investigación en neurociencia se basa en el registro de señales neuronales utilizando electrofisiología (ePhys). Estas señales neuronales son cruciales para comprender las funciones de las redes neuronales y los nuevos tratamientos médicos, como las interfaces de las máquinas cerebrales y los nervios periféricos1,2,3,4,5,6. La investigación en torno a los nervios periféricos requiere electrodos de grabación neuronal hechos a medida o disponibles comercialmente. Los electrodos de grabación neuronal, herramientas únicas con dimensiones a escala de micras y materiales frágiles, requieren un conjunto especializado de habilidades y equipos para fabricar. Se ha desarrollado una variedad de sondas especializadas para usos finales específicos; sin embargo, esto implica que los experimentos deben diseñarse en torno a sondas comerciales actualmente disponibles, o un laboratorio debe invertir en el desarrollo de una sonda especializada, que es un proceso largo. Debido a la amplia variedad de investigaciones neuronales en nervios periféricos, existe una gran demanda de una sonda ePhys ^{versátil4,7,8}. Una sonda ePhys ideal contaría con un sitio de grabación pequeño, baja impedancia9 y un precio financieramente realista para la implementación en un ^sistema3.

Los electrodos comerciales actuales tienden a ser electrodos extraneurales o de manguito (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11), que se encuentran fuera del nervio, o intrafasciculares, que penetran en el nervio y se sientan dentro del fascículo de interés. Sin embargo, a medida que los electrodos del manguito se encuentran más lejos de las fibras, recogen más ruido de los músculos cercanos y otros fascículos que pueden no ser el objetivo. Estas sondas también tienden a constreñir el nervio, lo que puede conducir a la bioincrustación, una acumulación de células gliales y tejido cicatricial, en la interfaz del electrodo mientras el tejido sana. Los electrodos intrafasciculares (como ^LIFE12, ^TIME13 y Utah Arrays14) agregan el beneficio de la selectividad de fascículos y tienen buenas relaciones señal-ruido, lo cual es importante para discriminar señales para la interfaz de máquinas. Sin embargo, estas sondas tienen problemas con la biocompatibilidad, con nervios que se deforman con el tiempo3,15,16. Cuando se compran comercialmente, ambas sondas tienen diseños estáticos sin opción de personalización específica del experimento y son costosas para los laboratorios más nuevos.

En respuesta a los altos costos y problemas de biocompatibilidad presentados por otras sondas, los electrodos de fibra de carbono pueden ofrecer una vía para que los laboratorios de neurociencia construyan sus propias sondas sin la necesidad de equipos especializados. Las fibras de carbono son un material de grabación alternativo con un factor de forma pequeño que permite una inserción de bajo daño. Las fibras de carbono proporcionan una mejor biocompatibilidad y una respuesta cicatricial considerablemente menor que el ^{silicio17,18,19} sin el procesamiento intensivo en salas ^{limpias5,13,14}. Las fibras de carbono son flexibles, duraderas, se integran fácilmente con otros ^{biomateriales19} y pueden penetrar y registrar desde el ^nervio7,20. A pesar de las muchas ventajas de las fibras de carbono, muchos laboratorios encuentran ardua la fabricación manual de estas matrices. Algunos ^grupos21 combinan fibras de carbono en haces que colectivamente dan como resultado un diámetro mayor (~200 μm); sin embargo, hasta donde sabemos, estos haces no han sido verificados en nervio. Otros han fabricado matrices de electrodos de fibra de carbono individuadas, aunque sus métodos requieren guías de fibra de carbono fabricadas en salas ^{limpias22,23,24} y equipos para poblar sus matrices17,23,24. Para abordar esto, proponemos un método de fabricación de una matriz de fibra de carbono que se puede realizar en la mesa de trabajo del laboratorio que permite modificaciones improvisadas. La matriz resultante mantiene puntas de electrodos individuadas sin herramientas especializadas de relleno de fibra. Además, se presentan múltiples geometrías para que coincidan con las necesidades del experimento de investigación. A partir de trabajos anteriores8,17,22,25, este documento proporciona metodologías detalladas para construir y modificar varios estilos de matrices manualmente con un tiempo mínimo de capacitación en salas limpias necesario.

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan.

1. Elegir una matriz de fibra de carbono

1. Elija una placa de circuito impreso (PCB) de uno de los tres diseños que se muestran en la Figura 1.
   NOTA: Para este protocolo, Flex Arrays será el foco.
   1. Consulte los diseños de PCB en el sitio web de Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), de forma gratuita y listos para ser enviados y ordenados para imprimir a través de una imprenta de PCB.
   2. Consulte la Tabla 1 para obtener un resumen de los conectores para cada placa y sus especificaciones para ayudar a elegir el conector que funcionará para la configuración experimental específica.

2. Soldadura del conector a la placa de circuito

1. Ajuste un soldador a 315 °C (600 °F).
2. Aplique fundente a todas las almohadillas de soldadura en la PCB.
   NOTA: El flujo dentro de un tubo se puede exprimir a través de las almohadillas, mientras que el flujo en una olla se puede aplicar con el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón untando el flujo a través de todas las almohadillas generosamente.
3. Forme pequeños montículos de soldadura en las almohadillas posteriores de la matriz flexible (Figura 2A).
4. Suelde la fila inferior de los pines del conector a la fila posterior de las almohadillas de soldadura (Figura 2B).
   NOTA: Todos los diseños de placa proporcionados por el laboratorio de Chestek fueron diseñados para que los conectores se emparejaran con precisión con su placa designada.
   1. Para hacer esto, suelde los pines a cada lado del conector con fácil acceso a los montículos de soldadura. Una vez asegurado, empuje suavemente la punta del soldador entre los pasadores delanteros para soldar las conexiones restantes en la parte posterior.
      NOTA: Una vez que la fila posterior de pines esté segura, el resto del conector se alineará con cada pin por encima de su almohadilla de soldadura asignada.
5. Suelde la primera fila de pasadores a la placa aplicando una pequeña cantidad de soldadura a cada pasador. Aplique una capa adicional de fundente si la soldadura no se está realizando rápidamente.
   1. Limpie el exceso de flujo con alcohol isopropílico (IPA) al 100% y un cepillo de cerdas cortas.
6. Encapsule las conexiones soldadas en epoxi de conjunto retardado (Figura 2 C, D) utilizando una aguja de 23 G y una jeringa de 1 ml colocada de lado atrás en los pines. Empuje el epoxi a través de la jeringa lentamente para que fluya hacia y a lo largo de las conexiones.
   1. Deje la tabla durante la noche para que el epoxi retardado pueda curarse.
      NOTA: Si bien el inserto del producto para el epoxi de conjunto retrasado indica que se cura en 30 minutos, dejarlo durante la noche permite que se forme una conexión más estable.
7. Asegure la parte posterior de la placa a los lados del conector colocando una pequeña línea de epoxi retardado a través de la parte posterior de la placa y tirando de ella hacia los bordes del conector.
   1. Deje que la tabla se cure durante la noche nuevamente.
      NOTA: En este punto, almacene las matrices o continúe con la compilación. Si hace una pausa en la compilación, guarde las matrices en una caja limpia y seca a temperatura ambiente.

3. Población de fibra

1. Cortar un capilar de vidrio tirado para que su punta encaje entre las trazas de la matriz (Figura 3A).
   1. Usando un extractor de vidrio y filamento, haga capilares usando los siguientes ajustes: Calor = 900, Tracción = 70, Velocidad = 35, Tiempo = 200, Presión = 900.
      NOTA: Los números no tienen unidad y son específicos de este dispositivo (consulte la Tabla de materiales).
2. Use los extremos de madera de dos aplicadores con punta de algodón (uno por cada parte de epoxi de plata) para recoger una pequeña proporción de ~ 1: 1 de epoxi de plata en un plato de plástico y mezcle con los mismos palos utilizados para recoger. Deseche los aplicadores después de mezclar.
3. Corte de 2 a 4 mm del extremo del paquete de fibra de carbono en un trozo de papel de impresora con una cuchilla de afeitar. Para separar fácilmente las fibras en el paquete, que son difíciles de separar, tire de un trozo de papel laminado suavemente sobre la parte superior del paquete.
   NOTA: El pedazo de papel laminado transfiere estática a las fibras, que se separarán por sí mismas.
4. Aplique epoxi de plata entre cada otro par de trazas en un lado de la tabla con el capilar de vidrio (Figura 3B).
   1. Tome una pequeña gota de epoxi en el extremo de un capilar tirado. Aplique suavemente entre cualquier otro rastro en el extremo de la tabla, llenando el espacio.
      NOTA: El espacio debe llenarse en la parte superior de los dos rastros sin desbordarse para tocar los rastros vecinos. Cada rastro está conectado a un canal. Este método de población epoxi significa que cada fibra tendrá dos canales conectados a ella. Esto se debe a que dos trazas permiten una mejor alineación de la fibra, y la redundancia en el canal ayuda a garantizar la conexión eléctrica.
5. Use pinzas recubiertas de teflón para colocar una fibra de carbono en cada traza epoxi (Figura 3C).
6. Use un capilar limpio para ajustar las fibras de carbono, de modo que sean perpendiculares al extremo de la placa Flex Array y enterradas debajo del epoxi (Figura 3D).
7. Coloque las matrices en un bloque de madera con extremos de fibra que sobresalgan del borde del bloque.
   NOTA: El peso del back-end mantendrá la matriz en el bloque.
8. Hornea el bloque de madera y las matrices a 140 °C durante 20 min para curar el epoxi de plata y bloquear las fibras en su lugar.
9. Repita los pasos 3.4-3.8 para el otro lado del tablero.
   NOTA: Las matrices se pueden almacenar después de cualquier paso de horneado; sin embargo, la estática de las cajas de almacenamiento puede hacer que las fibras se alejen de la placa si se aplicó muy poco epoxi de plata al poblar la placa.
   1. Cree una plataforma adhesiva elevada dentro de una caja para que la mayor parte de la placa se pueda pegar al adhesivo, lo que permite que los extremos de fibra de la placa se suspendan dentro de la caja para evitar la rotura de la fibra. Conservar a temperatura ambiente.
      NOTA: Si las fibras se alejan de la placa durante el almacenamiento, raspe el epoxi de los rastros con un capilar de vidrio limpio y repita los pasos 3.1-3.8 para reemplazar las fibras. A partir de este momento, las matrices deben almacenarse con las fibras suspendidas de esta manera para evitar la rotura de la fibra.

4. Aplicación de epoxi ultravioleta (UV) para aislar las fibras de carbono

1. Use un capilar limpio y aplique una pequeña gota (~ 0,5 mm de diámetro de epoxi UV en los rastros expuestos en un lado de la placa (Figura 4A). Continúe agregando gotas de epoxi UV hasta que los rastros estén completamente cubiertos.
   NOTA: No permita que el epoxi UV entre en las fibras de carbono más allá del extremo de la PCB para garantizar una inserción suave más adelante.
2. Cure el epoxi UV bajo una luz de pluma UV durante 2 min (Figura 4B).
3. Repita los pasos 4.1-4.2 para el otro lado del tablero.
4. Cortar las fibras a 1 mm usando una retícula estereoscopio y tijeras quirúrgicas.
   NOTA: Las matrices se pueden almacenar en este punto hasta que estén listas para continuar con los siguientes pasos. Deben almacenarse en una caja que elevará las fibras de carbono lejos de la caja en sí. Las matrices se pueden almacenar a temperatura ambiente indefinidamente.

5. Comprobación de conexiones eléctricas con escaneos de impedancia de 1 kHz (Figura 5)

1. Sumerja las fibras de carbono 1 mm en 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Para completar el circuito, use un cloruro de plata-plata (Ag| AgCl) electrodo de referencia y una varilla de acero inoxidable (contraelectrodo).
   1. Usando una abrazadera de vaso de precipitados, suspenda el Ag| Electrodo AgCl en el 1x PBS y conéctelo a la referencia del sistema de impedancia que se está utilizando.
   2. Usando una abrazadera de vaso de precipitados, suspenda la varilla de acero inoxidable en el PBS 1x y conéctela a la entrada de contraelectrodo del sistema de impedancia que se está utilizando.
3. Ejecute un escaneo de impedancia de 1 kHz para cada fibra utilizando un potenciostato establecido en una frecuencia de escaneo de 1 kHz a 0.01 _Vrms en una sola forma de onda sinusoidal. Ajuste el potenciostato a 0 V al comienzo de cada escaneo durante 5 s para estabilizar la señal grabada. Registre las mediciones a través del software asociado al potenciostato.
   NOTA: Las mediciones se pueden tomar en cualquier punto de la construcción; sin embargo, solo son necesarios antes del aislamiento y durante la preparación de la punta. La Tabla 2 enumera los rangos típicos de impedancias después de cada paso de compilación a 1 kHz para la referencia del usuario.
4. Enjuague las fibras en agua desionizada (DI) sumergiéndolas en un vaso de precipitados pequeño tres veces y déjelas secar a temperatura ambiente.
   NOTA: Las matrices se pueden dejar almacenadas hasta que el usuario pueda continuar con el siguiente paso.

6. Aislamiento de parileno C

NOTA: El parileno C fue elegido como el material aislante para las fibras de carbono, ya que se puede depositar a temperatura ambiente en lotes de matrices y proporciona un recubrimiento altamente conforme.

1. Enmascarar el conector Flex Array mediante el conector de acoplamiento.
2. Coloque un lote de 8-12 matrices en una caja de almacenamiento con una plataforma adhesiva elevada para que puedan aislarse en una sola tirada. Coloque las matrices de modo que el extremo del conector de la matriz esté en la plataforma adhesiva con el extremo de fibra de la matriz volando (Figura 6) para evitar que las fibras se peguen al adhesivo y se retiren y para garantizar un recubrimiento de parileno uniforme en las fibras.
3. Cubra las matrices en un sistema de deposición parileno C a un espesor de 800 nm en una sala limpia, utilizando el equipo de protección personal (EPP) adecuado según lo definido por la sala limpia individual que se está utilizando.
   NOTA: Aquí, el EPP se definió como zapatos de sala limpia, traje, cubierta para la cabeza, gafas, máscara y guantes de látex. Cabe señalar que este es el EPP estándar para ingresar a una sala limpia. Este paso se puede subcontratar a una empresa de recubrimiento de parileno por una tarifa; sin embargo, un servicio comercial puede ser capaz de recubrir más matrices a la vez. Cada sistema de deposición de parileno C puede tener diferentes precauciones de seguridad. Póngase en contacto con el técnico antes de usarlo para garantizar la seguridad del usuario.
4. Retire el conector de acoplamiento utilizado como máscara de la matriz Flex.
5. Coloque las matrices en una nueva caja para su almacenamiento hasta que estén listas para usar.

7. Métodos de preparación de propinas

NOTA: Dos preparaciones de puntas en esta sección usan láseres para cortar fibras. El EPP adecuado, como las gafas resistentes a las longitudes de onda utilizadas, siempre debe usarse cuando se usa el láser, y otros usuarios de laboratorio en las cercanías del láser también deben estar en el EPP. Aunque las longitudes de fibra enumeradas en estos pasos son longitudes recomendadas, los usuarios pueden probar cualquier longitud que se adapte a sus necesidades. El usuario debe elegir uno de los siguientes métodos de preparación de puntas, ya que el corte con tijera por sí solo no será suficiente para volver a exponer el ^electrodo25.

1. Granate de aluminio de itrio dopado con neodimio (Nd: YAG) cortado con láser
   1. Cortar las fibras a 550 μm con tijeras quirúrgicas.
   2. Utilice un láser pulsado Nd:YAG de 532 nm (5 mJ/pulso, 5 ns de duración, 900 mW) para cortar 50 μm de la punta de las fibras para volver a exponer el carbono debajo del parileno C (generalmente toma 2-3 pulsos).
      1. Alinee las puntas de fibra utilizando el estereoscopio incorporado que viene con este sistema láser.
         NOTA: Este sistema permite al usuario alinear una ventana (aquí, se utilizó 50 μm x 20 μm (altura x anchura)) para abarcar el extremo de la fibra.
      2. Enfoque el estereoscopio en el extremo de la fibra a un aumento de 500x para un corte preciso y preciso.
         NOTA: Parylene C se desprenderá ligeramente (<10 μm) de la punta dejando una punta roma y cilíndrica.
2. Afilado de soplete25,26,27
   1. Cortar las fibras a 300 μm con tijeras quirúrgicas.
   2. Sumerja la matriz en un plato de agua desionizada, conector lateral hacia abajo y asegurado al fondo del plato con una pequeña cantidad de masilla.
   3. Use una cámara de lápiz para alinear las fibras con la superficie del agua de modo que las fibras apenas toquen la superficie del agua.
   4. Ajuste la llama de un soplete de butano a 3-5 mm y páselo sobre la parte superior de las fibras en un movimiento de ida y vuelta para afilar las fibras.
      NOTA: Las puntas de fibra brillarán de color naranja cuando la llama pase sobre ellas.
   5. Retire la matriz de la masilla e inspecciónela bajo un estereoscopio en busca de puntas puntiagudas con un aumento de 50x.
      NOTA: Si se observan puntas puntiagudas, entonces no es necesario más soplete. Si las puntas parecen contundentes, repita los pasos 7.2.2-7.2.5.
3. Corte láser ^UV28
   NOTA: El láser UV solo se puede usar en diseños de fuerza de inserción cero (ZIF) y wide Board en la actualidad debido a que el gran punto focal del láser UV utilizado es más grande que el paso de las fibras de carbono Flex Array.
   1. Cortar las fibras de carbono a 1 mm con tijeras quirúrgicas.
   2. Coloque un láser UV en tres etapas motorizadas configuradas ortogonalmente.
      NOTA: El láser UV es un semiconductor multimodo de nitruro de galio indio (InGaN) con una potencia de salida de 1,5 W y una longitud de onda de 405 nm.
      1. Asegúrese de que el láser tenga un haz continuo para una alineación y corte rápidos y efectivos.
   3. Asegure la matriz en su lugar para mantener un plano de electrodos inmóvil y nivelado para que el láser pase por encima. Asegúrese de que la matriz se mantenga a una distancia adecuada del láser para que las fibras estén a la luz con el punto focal del láser. Para ello, proporciona una potencia menor al láser y ajusta la distancia para enfocar mejor la ^fibra28.
   4. Mueva el punto focal del láser UV a través del plano de la fibra a una velocidad de 25 μm / s para cortar las fibras a la longitud deseada (aquí, todas las fibras se cortan a 500 μm).
      NOTA: Las fibras emitirán una luz brillante antes de ser cortadas. Guarde las fibras después del tratamiento hasta que estén listas para ser recubiertas con un polímero conductor.

8. Recubrimiento conductor de poli(3,4-etilendioxitiofeno):p-toluenosulfonato (PEDOT:pTS) para una menor impedancia

1. Mezcle soluciones de 0,01 M de 3,4-etilendioxitiofeno y 0,1 M de p-toluenosulfonato de sodio en 50 ml de agua DI y revuelva durante la noche en una placa de agitación (~ 450 rpm) o hasta que no se puedan observar partículas en la solución.
   NOTA: Guarde la solución en un recipiente resistente a la luz. Refrigere la solución después de mezclarla para mantener la solución utilizable hasta por 30 días.
2. Ejecute un escaneo de impedancia de 1 kHz utilizando los mismos parámetros que antes (pasos 5.2-5.3) en 1x PBS. Tenga en cuenta qué fibras tienen una buena conexión (<1 MΩ, típicamente 14-16 de 16 fibras).
3. Electroplaca con PEDOT:pTS para bajar la impedancia de los electrodos.
   1. Sumerja las puntas de fibra en la solución PEDOT:pTS.
   2. Siga los pasos descritos en el paso 5.2, cambiando la solución 1x PBS para PEDOT:pTS y cortocircuitando todas las conexiones a la placa al canal de corriente aplicado.
   3. Aplicar 600 pA por fibra buena durante 600 s usando un potenciostato.
   4. Apague la celda y déjela reposar durante 5 s al final de la carrera.
4. Retire las fibras de la solución y enjuáguelas con agua DI.
5. Vuelva a tomar impedancias de 1 kHz para comprobar que las fibras se recubrieron correctamente (utilice los mismos parámetros enumerados en los pasos 5.2-5.3).
   NOTA: Las fibras buenas se designan como cualquier fibra que tenga una impedancia de menos de 110 kΩ.

9. Conexión de cables de tierra y de referencia

1. Raspe suavemente el Parylene C del suelo y haga referencia a las vías en la tabla con pinzas. Cortocircuite el suelo y las vías de referencia juntas en pares en este diseño de tablero.
   NOTA: Las vías de tierra y de referencia se pueden encontrar cerca del conector en la matriz Flex y son los cuatro pequeños círculos dorados cerca de los conectores. Los usuarios solo necesitarán eliminar el parileno C de las vías más cercanas a las fibras de carbono para las mediciones.
2. Cortar dos longitudes de 5 cm de alambre de plata aislado con una cuchilla de afeitar. Desinsular los extremos de los cables 2-3 mm de un extremo para conectarlos a la matriz flexible y ~ 10 mm desde los extremos opuestos para permitir una conexión a tierra y referencia más fáciles durante la cirugía.
3. Caliente el soldador de nuevo a 600 ° F. Aplique una pequeña cantidad de flujo a las vías.
4. Inserte un cable (extremo expuesto de 2-3 mm) en cada una de las vías de ePhys de la placa. Aplique soldadura en la parte superior de las vías (Figura 7A). Deje que la sonda se enfríe, luego voltéela para aplicar una pequeña cantidad de soldadura en la parte posterior de la vía (Figura 7A).
5. Usando tijeras quirúrgicas, corte cualquier cable expuesto que sobresalga del montículo de soldadura posterior, ya que esto ayuda a reducir el ruido observado en la grabación (Figura 7B).
6. Coloque las matrices de nuevo en la caja de almacenamiento, doblando los cables hacia atrás y lejos de la fibra. Asegure los cables de la cinta adhesiva para evitar posibles interacciones entre la fibra y el alambre (Figura 7C).

10. Procedimiento quirúrgico

NOTA: La corteza de rata se utilizó para probar la eficacia de las fibras preparadas con láser UV, ya que esto se ha descrito ^{anteriormente7,20}. Estas sondas funcionarán en el nervio debido a su geometría y niveles de impedancia similares a las fibras preparadas con soplete. Esta cirugía se realizó con mucha precaución para validar que el láser UV no cambió la respuesta de los electrodos.

1. Anestesiar a una rata Long Evans macho adulto usando una combinación de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Confirme la anestesia con una prueba de pellizco en el dedo del pie. Aplique ungüento en los ojos para evitar que los ojos de la rata se sequen durante la cirugía.
2. Cree una craneotomía de 2 mm x 2 mm por encima de la corteza motora del hemisferio derecho. Identifique la esquina inferior izquierda de la craneotomía midiendo 1 mm anterior de bregma y 1 mm lateral de línea media.
3. Monte la matriz en un instrumento estereotáxico y ponga a cero el instrumento estereotáxico en la duramadre bajando suavemente las fibras hasta que toquen la superficie de la duramadre. Levante la matriz lejos del sitio quirúrgico y muévala hacia un lado hasta que esté lista para la inserción.
4. Reseque la duramadre tirando suavemente de una aguja con un extremo de púas sobre la superficie del tejido. Una vez que una porción de la duramadre se abre al cerebro, use un par de fórceps finos para ayudar aún más a retirar la duramadre.
5. Inserte las fibras en la craneotomía y 1,2 mm en el cerebro utilizando un instrumento estereotáxico, bajando lentamente a mano.
6. Registre los datos de ePhys durante 10 minutos con un headstage y un preamplificador específicos de ePhys.
   1. Configure el filtro de paso alto del preamplificador para procesar la señal a 2,2 Hz, las antialias a 7,5 kHz y la muestra a 25 kHz.
      NOTA: Para estas mediciones, solo se registra la actividad espontánea. No se aplica ningún estímulo.
7. Eutanasia
   1. Coloque la rata bajo isoflurano al 5% por debajo de 1 L/min de oxígeno hasta que los signos de vida hayan cesado (20-30 min). Confirmar la eutanasia con decapitación.

11. Clasificación de picos

1. Utilice un software de clasificación de picos para ordenar y analizar los datos utilizando métodos informados ^{anteriormente8}.
2. Utilice un filtro de paso alto en todos los canales (esquina de 250 Hz, Butterworth ^{de 4º} orden) y establezca el nivel de detección de forma de onda en -3,5 × umbral RMS.
   1. Utilice un modelo gaussiano para agrupar y picos con características similares. Combine y promedie grupos de al menos 10 formas de onda para incluir en análisis posteriores.
   2. Elimine o elimine todas las formas de onda que no sean picos del conjunto de datos.
3. Exporte los datos una vez que se hayan ordenado todos los canales y use un software de análisis para trazar y analizar más a fondo las formas de onda.

12. Imágenes microscópicas electrónicas de barrido (SEM)

NOTA: Este paso hará que las matrices sean inutilizables y debe usarse solo para inspeccionar los resultados del tratamiento de puntas para verificar que las matrices se estén procesando correctamente. No es necesario realizar este paso para crear una matriz correcta. A continuación se resume un esquema general del proceso SEM; sin embargo, los usuarios que no han utilizado SEM previamente deben recibir ayuda de un usuario capacitado.

1. Corte el extremo fibrado de la PCB y móntelo en un talón SEM enmascarado con cinta de carbono. Coloque las matrices en una pequeña plataforma de cinta de carbono apilada (4-5 capas) para evitar que las fibras de carbono se peguen al talón SEM.
2. Recubrir las matrices con oro (100-300 Å) siguiendo los procedimientos descritos por el fabricante del recubridor de pulverización de oro.
3. Para inspeccionar los efectos del tratamiento de puntas, tome imágenes de las matrices en un SEM a una distancia de trabajo de 15 mm y una resistencia del haz de 20 kV.
   NOTA: Las matrices se pueden obtener imágenes sin recubrimiento por pulverización bajo un bajo vacío, como se muestra en la Figura 8D para fibras cortadas con láser UV. Para esta configuración, se recomienda tener una distancia de trabajo de 11-12 mm y una resistencia de haz de 4 kV.

Validación de consejos: imágenes SEM
El trabajo anterior20 mostró que el corte de tijera resultó en impedancias poco confiables a medida que Parylene C se doblaba a través del sitio de grabación. El corte por tijera se usa aquí solo para cortar fibras a la longitud deseada antes de procesarlas con un método de corte de acabado adicional. Se utilizaron imágenes SEM de las puntas para determinar la longitud del carbono expuesto y la geometría de la punta (Figura 8).

Las fibras cortadas con láser Nd:YAG y Nd:YAG fueron revisadas previamente17,20. Las fibras cortadas con tijera (Figura 8A) tienen geometrías de punta inconsistentes, con Parylene C doblando sobre el extremo cuando se cortan20. Las fibras cortadas con láser Nd:YAG permanecen consistentes en el área, la forma y la impedancia del sitio de grabación (Figura 8B). Las fibras con soplete20 conducen a la mayor variabilidad de tamaño y forma del electrodo y a una punta afilada, lo que permite la inserción en tejido duro. En promedio, se volvieron a exponer 140 μm de carbono, con un área de transición suave entre el aislamiento de carbono y parileno C (Figura 8C). Las fibras cortadas con láser UV fueron similares a las fibras con soplete, mostrando 120 μm de carbono expuestos desde la punta (Figura 8D). Las impedancias indicaron que los métodos de corte con láser UV o punta de soplete son adecuados para ePhys y son soluciones viables para laboratorios sin acceso a un láser Nd: YAG.

Validación de consejos: grabación eléctrica
La Figura 9 muestra las impedancias resultantes de cada método de preparación utilizando Flex Arrays. Los valores resultantes están dentro de un rango apropiado para el registro de ePhys. Las fibras cortadas con láser Nd:YAG dieron como resultado el área de superficie más pequeña pero las impedancias más altas, incluso con el recubrimiento PEDOT:pTS (carbono desnudo: 4138 ± 110 kΩ; con PEDOT:pTS: 27 ± 1.15 kΩ; n = 262). Le sigue la relación inversa en soplete (carbono desnudo: 308 ± 7 kΩ; con PEDOT:pTS: 16 ± 0,81 kΩ; n = 262) y corte láser UV (carbono desnudo: 468 ± 85,7 kΩ; con PEDOT:pTS: 27 ± 2,83 kΩ; n = 7) fibras que tienen una gran superficie y bajas impedancias. Sin embargo, en todos los casos, las fibras recubiertas de PEDOT:pTS caen por debajo del umbral de 110 kΩ establecido previamente para indicar un electrodo bueno y de baja impedancia.

Se tomaron registros agudos de ePhys de una rata Long Evans implantada agudamente con una matriz ZIF con corte láser UV y fibras tratadas con PEDOT: pTS para demostrar la viabilidad de este método. ePhys ha sido previamente probado y comprobado con tijera-cut20 y Nd:YAG-17 y fibras tratadas con soplete7,8 y por lo tanto no fue revalidado en este texto. En la Figura 10 se presentan registros agudos de cuatro fibras de tratamiento con láser UV (2 mm de longitud) que se implantaron simultáneamente en la corteza motora de la rata (n = 1). Se encontraron tres unidades en todas las fibras, lo que sugiere que el tratamiento de las fibras con el láser UV de bajo costo es similar a otros métodos de corte que permiten que la fibra de carbono registre unidades neuronales, como se esperaría de los SEM e impedancias. Si bien las matrices de fibra de carbono se construyen y modifican fácilmente para satisfacer las necesidades del usuario, debe tenerse en cuenta que se necesita una validación adicional para algunas compilaciones (Tabla 3), mientras que otras son menos adecuadas para ciertas tareas finales.

Parileno comercial C
El proveedor determinó que las matrices recubiertas comercialmente tenían un espesor de parileno C de 710 nm, dentro del rango objetivo de aislamiento. Las matrices se prepararon para las grabaciones de ePhys utilizando la preparación de la punta del soplete. Las impedancias se tomaron después de la preparación de las puntas y se compararon con los datos existentes. Una sonda con soplete y recubierta de PEDOT:pTS tenía un promedio de 14,5 ± impedancia de 1,3 kΩ en 16 fibras. Se tomaron imágenes SEM de la punta y el vástago para comparar la deposición de parileno C (Figura 11 A, B, respectivamente). Estos resultados muestran que el uso de un proveedor comercial no cambió los valores de impedancia esperados, lo que sugiere que esta será una sustitución igualmente viable de la deposición en la sala blanca de la universidad.

Análisis de costos de dispositivos
Siempre que todas las herramientas y materiales a granel (por ejemplo, epoxis, soldadura) sean accesibles para el investigador, una tarifa de usuario de Parylene C de $ 41 y un lote de 8 sondas, el costo total de los materiales es de $ 1168 ($ 146 por sonda). El esfuerzo del personal (Tabla 4) es de ~25 h para el lote. Si se utiliza un paso de fabricación sustituido, el costo de las sondas variará según el costo comercial del recubrimiento de Parylene C ($ 500-800 cotizados). El tiempo para los pasos de compilación (Tabla 4) se agrupa para todas las instancias de una tarea repetida para simplificar. Los tiempos de construcción para diseños con un paso más grande (Wide Board y ZIF) se reducen drásticamente ya que los pasos intensivos manualmente (por ejemplo, la colocación de fibra de carbono) son más fáciles y rápidos de completar.

Figura 1: Conectores y placas de circuito impreso asociadas. (A) Placa ancha con uno de los dieciséis conectores necesarios en el recuadro (barra de escala insertada = 5 mm). (B) ZIF y uno de los dos conectores y una cubierta. (C) Flex Array con un conector de 36 pines; barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pasos de soldadura y aislamiento para flex array. (A) Colocación de la soldadura para los pines del conector inferior. (B) Pasadores traseros asegurados en su lugar con los pasadores delanteros listos para soldar. (C) Conjunto retardado de flex array aislado epoxi; tenga en cuenta que el epoxi de ajuste retardado no cubre las vías de referencia y de tierra en ninguno de los lados. (D) Parte posterior de la matriz flexible con una banda de epoxi de ajuste retardado a través de las vías de la almohadilla (no la tierra y las vías de referencia) y envuelta alrededor del lado de la placa hacia el borde del conector. Barra de escala = 0,5 cm (B) y 1 cm (A, C, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Aplicación de epoxi de plata y alineación de fibras de carbono entre las trazas del Flex Array. Los capilares se han resaltado con una superposición blanca. (A) El extremo del capilar encaja entre las trazas para obtener (B) epoxi de plata limpia (denotada con flechas al final del capilar y dentro de las trazas) deposición sin derrame fuera de los pares de trazas. (C) Las fibras de carbono se colocan en el epoxi y luego (D) se enderezan con un capilar limpio. Barras de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aislamiento con aplicación de epoxi UV (A) El epoxi UV se aplica utilizando un capilar limpio y dos gotas de epoxi UV (marcado con superposiciones blancas). El epoxi UV se aplica en gotas de diámetros de 0,25-0,75 mm hasta que el epoxi UV forma una burbuja lisa sobre la parte superior de los rastros. (B) El epoxi UV se cura bajo luz UV. El Flex Array se coloca en masilla sobre un bloque de madera para facilitar el movimiento y la alineación debajo de la luz UV. La luz UV se mantiene con un soporte ~ 1 cm por encima del extremo de la matriz flexible. El recuadro (B) muestra el perfil lateral de un Flex Array correctamente aislado con epoxi UV. La burbuja epoxi UV a cada lado de la tabla tiene aproximadamente 50 μm de altura. Barras de escala = 500 μm (A y recuadro B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Configuración para mediciones de impedancia. Todas las piezas están etiquetadas y los conectores y adaptadores del sistema dependen del sistema. PBS se destaca cuando la solución se intercambia por PEDOT:pTS más adelante en la compilación; sin embargo, la configuración es idéntica de lo contrario. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendioxitiofeno):p-toluenosulfonato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Flex Array preparado para el recubrimiento de parileno C. El Flex Array está asegurado a una plataforma de espuma elevada con cinta adhesiva hacia arriba durante el proceso de recubrimiento. Barra de escala = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Cables de tierra y de referencia conectados a la matriz Flex finalizada. La soldadura se aplicó a cada lado de la vía a cada lado de la placa (A) para crear una unión segura. Las vías de ePhys se etiquetan en la placa como GND y Ref y se emparejan en lados opuestos de la placa entre sí. Hay dos vías adicionales también etiquetadas como GND y Ref2. Ambas vías GND están acortadas juntas. Ref2 está destinado a ser utilizado en experimentos electroquímicos. El exceso de cable en (A) se denota con una caja roja y se retira (B) de la parte posterior de la sonda (la caja roja muestra dónde solía estar el cable) para ayudar con la reducción de ruido y el manejo de la sonda. (C) Final Flex Array almacenado para uso futuro. Tenga en cuenta que las vías GND y Ref emparejadas en esta placa la designan para las grabaciones de ePhys. Barras de escala = 200 μm (A, B). Abreviaturas: ePhys = electrofisiología; GND = tierra; Ref = referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes SEM de fibras con diferentes técnicas de corte de punta. (A) Fibra cortada con tijera con muy poco carbono expuesto. (B) Corte láser Nd: YAG. (C) Fibra sopleteada con ~ 140 mm de carbono expuesto desde la punta. (D) Fibras UV cortadas con láser con ~ 120 mm de carbono expuesto desde la punta. Las flechas rojas indican el área de transición entre el parileno C y la fibra de carbono desnuda. Barras de escala = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Abreviaturas: SEM = microscópico electrónico de barrido; Nd:YAG = Granate de aluminio de itrio dopado con neodimio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Diferencias de impedancia entre aplicar únicamente el tratamiento (carbono desnudo expuesto) y con la adición de PEDOT:pTS. En todos los casos, la adición de PEDOT:pTS disminuye la impedancia en un orden de magnitud. Tamaño de la muestra: Nd: YAG = 262, Soplete = 262, UV = 7. La diferencia de tamaño de la muestra UV se debe a la novedad del método de preparación; sin embargo, muestra un rango similar al de la cerbatana, como se esperaba. Los datos de impedancia se expresan como media ± error estándar. Abreviaturas: PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendioxitiofeno):p-toluenosulfonato; Granate de aluminio de itrio dopado con neodimio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Datos de aumento electrofisiológico agudo de cuatro electrodos uv cortados con láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Matrices comerciales recubiertas de parileno C. (A) La matriz afilada muestra un afilado uniforme en todas las fibras, lo que indica que no hay inconvenientes en el recubrimiento comercial. (B) Después del soplete, la transición (caja roja) entre la fibra de carbono desnuda y el parileno C no muestra ninguna diferencia discernible entre las matrices recubiertas en una instalación de sala limpia. Barras de escala = 200 μm (A) y 10 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Cada PCB tiene un conector y un tono diferentes asociados. Abreviatura: PCB = placa de circuito impreso.

Tabla 2: Rango típico de impedancias después de cada etapa de construcción (n = 272). *n = 16. PEDOT: Las sondas tratadas con pTS por encima de 110 kΩ aún pueden grabar señales; sin embargo, todos los electrodos tratados generalmente caen bajo este valor. Abreviaturas: PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendioxitiofeno):p-toluenosulfonato; Granate de aluminio de itrio dopado con neodimio.

Tabla 3: Usos validados de cada tablero con los métodos de corte descritos. Todos los métodos de corte incluyeron electrodeposición de PEDOT:pTS. "No viable" indica que un factor de forma del diseño impide que este tratamiento de punta se pruebe en este momento (es decir, el paso de fibra). Abreviaturas: Granate de aluminio de itrio dopado con neodimio; SEM = microscopía electrónica de barrido; ePhys = electrofisiología; ZIF = fuerza de inserción cero.

Tabla 4: Tiempo requerido para cada paso de un proceso de fabricación. La soldadura del conector y los cables de tierra y referencia se han combinado aquí para simplificar la lista de actividades. Abreviaturas: PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendioxitiofeno):p-toluenosulfonato; Granate de aluminio de itrio dopado con neodimio.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.