Name: Kit de herramientas de código abierto: Matriz de microelectrodos de fibra de carbono de sobremesa para grabación nerviosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende a fabricar matrices de microelectrodos de fibra de carbono personalizables para grabación nerviosa in vivo sin necesidad de sala limpia. Esta técnica accesible minimiza el daño tisular y mejora la precisión en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por los Institutos Nacionales de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (UF1NS107659 y UF1NS115817) y la Fundación Nacional de Ciencias (1707316). Los autores reconocen el apoyo financiero de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Michigan y el apoyo técnico del Centro de Caracterización de Materiales de Michigan y el Laboratorio de Pregrado Van Vlack. Los autores agradecen al Dr. Khalil Najafi por el uso de su láser Nd: YAG y a la Instalación de Nanofabricación Lurie por el uso de su máquina de deposición Parylene C. También nos gustaría agradecer a Specialty Coating Systems (Indianápolis, IN) por su ayuda en el estudio de comparación de recubrimientos comerciales.

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<li>Mohanaraj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle+modified+carbon+fiber+microelectrodes+for+enhanced+neurochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle modified carbon fiber microelectrodes for enhanced neurochemical detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59552(2019).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Sustituciones de materiales Si bien todos los materiales utilizados se resumen en la Tabla de materiales, se requiere que muy pocos de los materiales provengan de proveedores específicos. La placa Flex Array debe provenir del proveedor enumerado, ya que son la única empresa que puede imprimir la placa flexible. El conector Flex Array también debe solicitarse al proveedor indicado, ya que es un conector propietario. El parileno C es muy recomendable como material aislante para las fibr...

Gran parte de la investigación en neurociencia se basa en el registro de señales neuronales utilizando electrofisiología (ePhys). Estas señales neuronales son cruciales para comprender las funciones de las redes neuronales y los nuevos tratamientos médicos, como las interfaces de las máquinas cerebrales y los nervios periféricos1,2,3,4,5,6. La investigación en torno a los nervios periféricos requiere electrodos de grabación neuronal hechos a medida o disponibles comercialmente. Los electrodos de grabación neuronal, herramientas únicas con dimensiones a escala de micras y materiales frágiles, requieren un conjunto especializado de habilidades y equipos para fabricar. Se ha desarrollado una variedad de sondas especializadas para usos finales específicos; sin embargo, esto implica que los experimentos deben diseñarse en torno a sondas comerciales actualmente disponibles, o un laboratorio debe invertir en el desarrollo de una sonda especializada, que es un proceso largo. Debido a la amplia variedad de investigaciones neuronales en nervios periféricos, existe una gran demanda de una sonda ePhys versátil4,7,8. Una sonda ePhys ideal contaría con un sitio de grabación pequeño, baja impedancia9 y un precio financieramente realista para la implementación en un sistema3.
Los electrodos comerciales actuales tienden a ser electrodos extraneurales o de manguito (Neural Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff Electrode11), que se encuentran fuera del nervio, o intrafasciculares, que penetran en el nervio y se sientan dentro del fascículo de interés. Sin embargo, a medida que los electrodos del manguito se encuentran más lejos de las fibras, recogen más ruido de los músculos cercanos y otros fascículos que pueden no ser el objetivo. Estas sondas también tienden a constreñir el nervio, lo que puede conducir a la bioincrustación, una acumulación de células gliales y tejido cicatricial, en la interfaz del electrodo mientras el tejido sana. Los electrodos intrafasciculares (como LIFE12, TIME13 y Utah Arrays14) agregan el beneficio de la selectividad de fascículos y tienen buenas relaciones señal-ruido, lo cual es importante para discriminar señales para la interfaz de máquinas. Sin embargo, estas sondas tienen problemas con la biocompatibilidad, con nervios que se deforman con el tiempo3,15,16. Cuando se compran comercialmente, ambas sondas tienen diseños estáticos sin opción de personalización específica del experimento y son costosas para los laboratorios más nuevos.
En respuesta a los altos costos y problemas de biocompatibilidad presentados por otras sondas, los electrodos de fibra de carbono pueden ofrecer una vía para que los laboratorios de neurociencia construyan sus propias sondas sin la necesidad de equipos especializados. Las fibras de carbono son un material de grabación alternativo con un factor de forma pequeño que permite una inserción de bajo daño. Las fibras de carbono proporcionan una mejor biocompatibilidad y una respuesta cicatricial considerablemente menor que el silicio17,18,19 sin el procesamiento intensivo en salas limpias5,13,14. Las fibras de carbono son flexibles, duraderas, se integran fácilmente con otros biomateriales19 y pueden penetrar y registrar desde el nervio7,20. A pesar de las muchas ventajas de las fibras de carbono, muchos laboratorios encuentran ardua la fabricación manual de estas matrices. Algunos grupos21 combinan fibras de carbono en haces que colectivamente dan como resultado un diámetro mayor (~200 μm); sin embargo, hasta donde sabemos, estos haces no han sido verificados en nervio. Otros han fabricado matrices de electrodos de fibra de carbono individuadas, aunque sus métodos requieren guías de fibra de carbono fabricadas en salas limpias22,23,24 y equipos para poblar sus matrices17,23,24. Para abordar esto, proponemos un método de fabricación de una matriz de fibra de carbono que se puede realizar en la mesa de trabajo del laboratorio que permite modificaciones improvisadas. La matriz resultante mantiene puntas de electrodos individuadas sin herramientas especializadas de relleno de fibra. Además, se presentan múltiples geometrías para que coincidan con las necesidades del experimento de investigación. A partir de trabajos anteriores8,17,22,25, este documento proporciona metodologías detalladas para construir y modificar varios estilos de matrices manualmente con un tiempo mínimo de capacitación en salas limpias necesario.

<table><tbody><tr><td>Almejas de 3 puntas</td><td>05-769-6Q</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 2 Costo unitario (USD): 20</td></tr><tr><td>3,4-etilendioxitiofeno (25 g) (PEDOT)</td><td>96618</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 102</td></tr><tr><td>353ND-T Epoxi (8oz)++ (ZIF y Wide Board Only)</td><td>353ND-T/8OZ</td><td>Tecnología Epoxi</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 48</td></tr><tr><td>Ag/AgCl (3M NaCl) Electrodo de referencia (paquete de 3)</td><td>50-854-570</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 100</td></tr><tr><td>Autolab</td><td>PGSTAT12</td><td>Metrohm</td><td></td></tr><tr><td>Blowtorch</td><td>1WG61</td><td>Grainger</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 36</td></tr><tr><td>Fibras de carbono</td><td>T-650/35</td><td>3K Cytec Thornel Cantidad</td><td>: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Cinta de carbono</td><td>NC1784521</td><td>Fisher Cantidad</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 27</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>WOD1002</td><td>MediChoice</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 0.57</td></tr><tr><td>Epoxi de fraguado diferido ++</td><td>1FBG8</td><td>Cantidad de Grainger</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 3</td></tr><tr><td>DI Agua n</td><td>/a</td><td>n/a Cantidad</td><td>: n/a Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>50-822-409</td><td>Cantidad Fisher</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 73</td></tr><tr><td>Matriz Flex**</td><td>n/a</td><td>Cantidad MicroConnex</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 68</td></tr><tr><td>Cantidad Flux</td><td>SMD291ST8CC</td><td>DigiKey</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 13</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio (paquete de 350)</td><td>50-821-986</td><td>Cantidad Fisher</td>: <td>1 Costo unitario (USD): 60</td></tr><tr><td>Plato de vidrio</td><td>n/a</td><td>n/a Cantidad</td><td>: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Conector Hirose (solo ZIF)</td><td>H3859CT-ND</td><td>Cantidad DigiKey</td><td>: 2 Costo unitario (USD): 2</td></tr><tr><td>botellas de vidrio resistentes a la luz</td><td>n/a</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Filimento de calefacción de micropipetas</td><td>FB315B</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>P-97</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo (paquete de 200)</td><td>19-041-171C</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 47</td></tr><tr><td>Software de clasificación fuera de línea</td><td>n/a</td><td>Plexon</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Conector Omnetics* (solo Flex Array)</td><td>A79025-001</td><td>Omnetics Inc</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 35</td></tr><tr><td>Conector Omnetics* (solo Flex Array)</td><td>A79024-001</td><td>Omnetics Inc</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 35</td></tr><tr><td>Conector Omnetics a ZIF</td><td>ZCA-OMN16</td><td>Tecnologías Tucker-Davis Cantidad</td><td>: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Conector de terminal de clavijas (solo placa ancha)</td><td>ED11523-ND</td><td>Cantidad DigiKey</td><td>: 16 Costo unitario (USD): 10</td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de sonda</td><td>G2085</td><td>Melmat</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 2</td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>4A807</td><td>Grainger</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 2</td></tr><tr><td>SEM post</td><td>16327</td><td>lnf</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 3</td></tr><tr><td>Epoxi de plata (1oz) ++</td><td>H20E/1OZ</td><td>Tecnología de epoxi</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 125</td></tr><tr><td>Alambres GND REF de plata</td><td>50-822-122</td><td></td><td>Fisher Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 423.2</td></tr><tr><td>P-toulenessulfonato de sodio (pTS) - 100g</td><td>152536</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 59</td></tr><tr><td>Soldadura</td><td>24-6337-9703</td><td>Cantidad DigiKey</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 60</td></tr><tr><td>Punta de soldador</td><td>T0054449899N-ND</td><td>Digikey</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 13</td></tr><tr><td>Estación de soldadura</td><td>WD1002N-ND</td><td>Digikey</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 374</td></tr><tr><td>Sistema de curado LED UV SPOTCURE-B</td><td>n/a</td><td>FusionNet LLC</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 895</td></tr><tr><td>Varilla de acero inoxidable</td><td>n/a</td><td>n/a Cantidad</td><td>: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Plato de agitación</td><td>n/a</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): n/a</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>08-953-1B</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 100</td></tr><tr><td>TDT Cubierta (solo ZIF)</td><td>Z3_ZC16SHRD_RSN</td><td>TDT</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 3.5</td></tr><tr><td>Pinzas de teflón</td><td>50-380-043</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 47</td></tr><tr><td>UV & Gafas de seguridad para luz visible</td><td>92522</td><td>Loctite Cantidad</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 45</td></tr><tr><td>Epoxi UV (8oz)++ (solo Flex Array)</td><td>OG142-87/8OZ</td><td>Tecnología Epoxi</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 83</td></tr><tr><td>Láser UV</td><td>n/a</td><td></td><td>WER Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 30</td></tr><tr><td>Bote de peso (paquete de 500)</td><td>08-732-112</td><td>Fisher</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 58</td></tr><tr><td>Tablero ancho +</td> <td>n/a</td><td>Cantidad de circuitos avanzados</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 3</td></tr><tr><td>ZIF Cabecera activa</td><td>ZC16</td><td>Cantidad de Tucker-Davis Technologies</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 925</td></tr><tr><td>ZIF Cabecera pasiva</td><td>ZC16-P Cantidad de</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>: 1 Costo unitario (USD): 625</td></tr><tr><td>ZIF*</td><td>n/a</td><td>Circuitos de costa a costa</td><td>Cantidad: 1 Costo unitario (USD): 9</td></tr></tbody></table>

kit de herramientas de código abierto: matriz de microelectrodos de fibra de carbono de sobremesa para grabación nerviosa

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

Las sondas nerviosas periféricas convencionales se fabrican principalmente en una sala limpia, lo que requiere el uso de múltiples herramientas costosas y altamente especializadas. Este documento presenta un proceso de fabricación "ligero" de salas limpias de matrices de electrodos neuronales de fibra de carbono que puede ser aprendido rápidamente por un usuario de sala limpia sin experiencia. Este proceso de fabricación de matrices de electrodos de fibra de carbono requiere solo una herramienta de sala limpia, una máquina de deposición Parylene C, que se puede aprender rápidamente o subcontratar a una instalación de procesamiento comercial a un costo marginal. Este proceso de fabricación también incluye placas de circuito impreso de relleno manual, aislamiento y optimización de puntas. 
Las tres optimizaciones de puntas diferentes exploradas aquí (láser Nd: YAG, soplete y láser UV) dan como resultado una gama de geometrías de punta e impedancias de 1 kHz, con fibras sopladas que resultan en la impedancia más baja. Si bien los experimentos anteriores han demostrado la eficacia del láser y el electrodo de soplete, este documento también muestra que las fibras cortadas con láser UV pueden registrar señales neuronales in vivo. Las matrices de fibra de carbono existentes no tienen electrodos individuados a favor de los paquetes o requieren guías fabricadas en salas limpias para la población y el aislamiento. Las matrices propuestas utilizan solo herramientas que se pueden usar en una mesa de trabajo para la población de fibra. Este proceso de fabricación de matrices de electrodos de fibra de carbono permite una rápida personalización de la fabricación de matrices a granel a un precio reducido en comparación con las sondas disponibles comercialmente.

Validación de consejos: imágenes SEM El trabajo anterior20 mostró que el corte de tijera resultó en impedancias poco confiables a medida que Parylene C se doblaba a través del sitio de grabación. El corte por tijera se usa aquí solo para cortar fibras a la longitud deseada antes de procesarlas con un método de corte de acabado adicional. Se utilizaron imágenes SEM de las puntas para determinar la longitud del carbono expuesto y la geometría de la punta (Fig...

Aquí, describimos la metodología de fabricación para matrices de electrodos de fibra de carbono personalizables para grabar in vivo en nervios y cerebro.

Kit de herramientas de código abierto: Matriz de microelectrodos de fibra de carbono de sobremesa para grabación nerviosa

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...

Los electrodos de fibra de carbono, son más pequeños que las neuronas y hacen un daño mínimo. Además, se pueden fabricar con un mínimo de equipo especializado en la mesa de trabajo. La principal ventaja de esta técnica está en su simplicidad.Permite a los usuarios crear y personalizar matrices neuronales, sin experiencia en salas limpias. Manipular las fibras de carbono y colocar el epoxi de plata es complicado y crítico. Estas dos partes requieren mucha práctica y control motor fino.El primer día siempre es el peor, pero con la práctica, después de aproximadamente una semana, construirás una matriz neuronal funcional. Para comenzar, coloque un soldador a 315 grados centígrados. Aplique fundente a todas las almohadillas de soldadura.Forme pequeños montículos de soldadura en las almohadillas posteriores de la matriz flexible, luego suelde los pines a cada lado del conector. Una vez asegurado, empuje suavemente la punta del soldador, entre los pasadores delanteros, para soldar las conexiones restantes en la parte posterior. Aplique una capa de flujo adicional, si la soldadura lleva mucho tiempo, luego suelde la primera fila de pines a la placa.Limpie el exceso de fundente con alcohol 100% isopropílico y un cepillo de cerdas cortas. A continuación, empuje lentamente el epoxi colocado con una jeringa, colocada de lado a dos aguas abajo en los pines, para encapsular la conexión soldada. Coloque una pequeña línea del epoxi en la parte posterior del tablero y tire de él hacia los bordes del conector para asegurarlo.Hacer capilares con un extractor de vidrio y filamento. Corta un capilar de vidrio tirado, de modo que su punta encaje entre los rastros de la matriz. Luego, cuchara aproximadamente una proporción de uno a uno de epoxi de plata en un plato de plástico, con los extremos de madera de dos aplicadores con punta de algodón y mézclalo.Deseche los aplicadores después de mezclar. Corte de dos a cuatro milímetros, desde el extremo de un paquete de fibra de carbono, en un papel de impresora con una cuchilla de afeitar. Tire de un papel laminado, suavemente, sobre la parte superior del haz para separar las fibras y el paquete.A continuación, tome un poco de epoxi en el extremo del capilar tirado. Y aplícalo suavemente entre cualquier otro rastro, en el extremo de la tabla, llenando el espacio. Coloque una fibra de carbono en cada traza epoxi, con pinzas recubiertas de teflón.Luego, ajuste las fibras de carbono con un capilar limpio y tirado, para hacerlo perpendicular al extremo de la tabla de matriz flexible y enterrarlas debajo del epoxi. Coloque las matrices en un bloque de madera, con extremos de fibra que sobresalen del borde del bloque. Hornea el bloque de madera y las matrices a 140 grados centígrados durante 20 minutos, para curar el epoxi de plata y bloquear las fibras en su lugar.Si el epoxi de plata corta dos o más de las fibras juntas, se puede quitar usando un capilar de vidrio limpio y raspándolo suavemente de la tabla. Guarde las tablas terminadas en una caja con una plataforma elevada, para suspender los extremos con fibra de la placa, para evitar la rotura de la fibra. Aplique una pequeña gota de epoxi UV sobre los rastros expuestos con un capilar limpio y continúe agregando gotas, hasta que los rastros estén completamente cubiertos.Cure el epoxi UV bajo una pluma UV durante dos minutos y repítalo para el otro lado de la placa. Corta las fibras a un milímetro con una retícula estereoscopio y tijeras quirúrgicas. Para comprobar las conexiones eléctricas, ajuste el potenciostato a cero voltios, durante cinco segundos, y estabilice la señal grabada.Ejecute un escaneo de impedancia de un kilohercio para cada fibra con un potenciostato. Registre las mediciones a través del software asociado al potenciostato. Luego sumerja las fibras en agua desionizada en un vaso de precipitados, tres veces, para enjuagarlas.Raspe suavemente el parileno C del suelo y haga referencia a los cables en la placa con pinzas. A continuación, corte dos longitudes de cinco centímetros de alambre de plata aislado con una cuchilla de afeitar. Desaisle de dos a tres milímetros de alambre, desde un extremo y alrededor de 10 milímetros desde el extremo opuesto.A continuación, caliente el soldador a 315 grados centígrados y aplique un pequeño flujo a los cables. Inserte de dos a tres milímetros de un cable, en cada cable de electrofisiología en la placa, y aplique soldadura en la parte superior de los cables. Después de dejar que la sonda se enfríe, voltéela para aplicar un poco de soldadura en la parte posterior del cable.Corta cualquier alambre expuesto que sobresalga del montículo de soldadura posterior. Coloque las matrices en la caja de almacenamiento, doblando los cables hacia atrás, lejos de la fibra y asegure los cables en la cinta adhesiva, para evitar posibles interacciones entre cables de fibra. Se utilizaron imágenes SEM de las puntas para determinar la longitud del carbono expuesto y la geometría de la punta.Las fibras cortadas con tijera tienen geometrías de punta inconsistentes, con Parylene C doblando sobre el extremo. Las fibras cortadas con láser NDYAG permanecen consistentes, en el área del sitio de grabación, la forma y la impedancia. Las fibras quemadas por soplado conducen al mayor tamaño de electrodo, y variabilidad de forma y una punta afilada.En promedio, 140 micrómetros de carbono fueron reexpuestos. Las fibras cortadas con láser UV fueron similares a las fibras quemadas por soplado, mostrando 120 micro metros de carbono, expuestos desde la punta. Las impedancias resultantes estaban dentro del rango, para el registro electrofisiológico.Las fibras cortadas con láser NDYAG tenían el área de superficie más pequeña pero las impedancias más altas. Seguido de fibras sopladas y cortadas con láser UV. Sin embargo, en todos los casos, las fibras recubiertas peDOT:pTS cayeron por debajo del umbral de 110 kilo ohmios.Los registros agudos de cuatro fibras de tratamiento con láser UV, de dos milímetros de longitud, implantadas simultáneamente en la corteza motora de la rata, mostraron tres unidades en todas las fibras, lo que sugiere que el tratamiento de las fibras con el láser UV de bajo costo es similar a otros métodos de corte. Al intentar este protocolo, date un espacio grande y limpio cuando pobles fibras de carbono. Es fácil barrer accidentalmente todas sus fibras de la mesa, porque no hay suficiente espacio de maniobra.Estas matrices ahora son adecuadas para grabaciones de unidades de señal desde el cerebro. Estas técnicas de construcción permitieron al grupo del Dr. Barnes, en la Universidad de Michigan, informar y al grupo del Dr. Chiel en la Universidad Case Western Reserve, informar sobre el intracelular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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