Un ensayo de micropatrones para medir la quiralidad celular

Resumen

Presentamos un protocolo para determinar la quiralidad multicelular in vitro, utilizando la técnica de micropatronaje. Este ensayo permite la cuantificación automática de los sesgos izquierda-derecha de varios tipos de células y se puede utilizar con fines de detección.

Resumen

La quiralidad es una propiedad celular intrínseca, que representa la asimetría en términos de polarización a lo largo del eje izquierda-derecha de la célula. Como esta propiedad única atrae cada vez más atención debido a sus importantes funciones tanto en el desarrollo como en la enfermedad, un método de cuantificación estandarizado para caracterizar la quiralidad celular avanzaría en la investigación y las aplicaciones potenciales. En este protocolo, describimos un ensayo de caracterización de quiralidad multicelular que utiliza matrices de células con micropatrones. Los micropatrones celulares se fabrican en portaobjetos de vidrio recubiertos de titanio / oro a través de la impresión de microcontacto. Después de la siembra en las islas geométricamente definidas (por ejemplo, en forma de anillo) recubiertas de proteínas, las células migran direccionalmente y forman una alineación sesgada hacia la dirección en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj, que puede analizarse y cuantificarse automáticamente mediante un programa MATLAB escrito a medida. Aquí describimos en detalle la fabricación de sustratos micropatronados, la siembra celular, la recopilación de imágenes y el análisis de datos y mostramos resultados representativos obtenidos utilizando las células NIH/3T3. Este protocolo ha sido validado previamente en múltiples estudios publicados y es una herramienta eficiente y fiable para estudiar la quiralidad celular in vitro.

Introducción

La asimetría izquierda-derecha (LR) de la célula, también conocida como mano celular o quiralidad, describe la polaridad celular en el eje LR y se reconoce que es una propiedad biofísica fundamental y conservada 1,2,3,4,5. La quiralidad celular se ha observado tanto in vivo como in vitro a múltiples escalas. Hallazgos previos revelaron remolinos quirales de citoesqueleto de actina en células individuales sembradas en islas circulares⁶, migración sesgada y alineación....

Protocolo

1. Fabricación de sellos de polidimetilsiloxano (PDMS)¹⁶

1. Dibuje una matriz de anillos a microescala utilizando software CAD, con un diámetro interior de 250 μm y un diámetro exterior de 450 μm. El patrón utilizado en este protocolo es una matriz de 10 x 10 con una distancia de 850 μm entre anillos.
2. Imprima una máscara de transparencia del patrón a la resolución deseada utilizando el servicio de impresión de máscaras de una empresa de microfabricación (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Se ha demostrado que las dimensiones proporcionadas del anillo funcionan para muchos tipos de células

Resultados

Quince minutos después de la siembra de células NIH/3T3, la adhesión celular en el patrón de anillo se confirmó visualmente mediante imágenes de contraste de fase. Después del cultivo posterior de 24 h, las células en los patrones se volvieron confluentes y alargadas con alineaciones claramente asimétricas, sesgadas hacia la dirección de las agujas del reloj (Figura 2). La migración direccional de las células unidas se registra mediante imágenes de lapso de tiempo, la motilidad celular y la .......

Discusión

El ensayo de patrones en forma de anillo descrito aquí proporciona una herramienta fácil de usar para la caracterización cuantitativa de la quiralidad multicelular, capaz de producir resultados altamente confiables y repetibles. La rápida generación de microambientes definidos idénticos y el análisis imparcial permiten el procesamiento automatizado de alto rendimiento de muestras de gran tamaño. Este protocolo discute la fabricación de los micropatrones de anillo, el modelado celular y el análisis automático de la alinea.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol de 200 grados	Koptec	DSP-MD-43
Sistema de microscopio BZX	Keyence	BZX-600
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), alta glucosa	Gibco	11965092
Evaporador de haz de electrones	Temscal	BJD-1800	Recubrimiento de película de oro-titanio Suero
fetal bovino	VWR	89510-186
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F1141-5MG
Portaobjetos de microscopio de vidrio	VWR	10024-048
Pinzas de vidrio	Exelta	390BSAPI
Pellets de evaporación de oro	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
células NIH/3T3	ATCC	CRL-1658
Alineador de contacto	OAI OAI	200	Fotolitografía UV
Octadecanetiol (C18)	Sigma	O1858-25ML
Agitador orbital	VWR	89032-088
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Producto de investigación internacional	P32080-100T
Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
Oblea de silicio	University Wafer	ID#809
Piruvato de sodio	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 fotorresistente	MicroChem	Y311075 0500L1GL
Pellets de evaporación de titanio	International Advanced Materiales	TI14
Mascarilla de transparencia (con función)	Outputicity.com	N/A	Servicio
de impresión de mascarillas Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo fisher scientific	25200-072

Polidimetilsiloxano